本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种狂犬病病毒灭活疫苗的纯化方法。
背景技术：
狂犬病(rabies)，是由狂犬病毒所致的自然疫源性或动物源性人畜共患急性传染病，流行性广、致死率极高，对人民生命健康构成严重威胁。目前疫苗预防接种仍是预防和控制狂犬病最有效的方法。自1885年路易巴斯德发明第一支人用狂犬病疫苗以来，狂犬病疫苗的发展经历了早期的动物神经组织疫苗、禽胚疫苗、细胞培养的粗制疫苗，到目前的经原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞、原代鸭胚细胞、非洲绿猴肾细胞、恒河猴胎儿二倍体细胞、人二倍体细胞培养的纯化疫苗。
1980年前，我国生产和使用的是成年羊脑组织疫苗，接种后不良反应大，特别是由脑组织引起的变态性脑脊髓炎不良反应尤为严重，同时免疫效果也不够满意。为解决这些问题，我国于1965年开始由卫生部武汉生物制品研究所牵头，中国药品生物制品检定所、卫生部长春、兰州生物制品研究所等单位合作启动细胞培养疫苗研发工作，最终该疫苗于1980年应用并替代了羊脑疫苗。其中，冻干人用狂犬病疫苗(vero细胞)以其在生产工艺、经济效益和质量等方面的综合优势，占据了当前我国的大部分狂犬病疫苗市场。
vero细胞作为一种传代细胞，其dna存在与人体正常细胞进行作用，使人体正常细胞产生突变，从而导致癌变的风险[1,2]。尽管目前国际上认为130-150代vero细胞无致瘤性，可以应用于疫苗的生产，但促生长蛋白及细胞残留蛋白、潜在病毒、细胞残余等细胞基质使传代细胞疫苗的大量使用仍存在隐忧，因此为了确保疫苗的安全性，目前世界上许多机构组织对生物制品中的细胞残留量都制定了相关标准[3]。我国现行药典(2015年第三版)就对生物制品中宿主细胞物质残留量做了明确规定，vero细胞dna残留量不高于100pg/剂(通则3407第一法)；总蛋白含量不高于80μg/剂(lowry法)；vero细胞宿主蛋白质(hcp)残留量不高于4μg/剂(采用酶联免疫法)；细菌内毒素不高于25eu/剂(凝胶限度实验)。
早期，狂犬病疫苗制品采用微孔滤膜过滤技术微滤去除组织碎片、脱落细胞或细胞碎片。其后，为提高疫苗效价，增加了超滤浓缩技术，一些小分子杂质也在超滤过程中被去除。上世纪七十年代建立的蔗糖区带超速离心纯化工艺和九十年代建立的凝胶过滤柱层析纯化技术，进一步提高了制品的纯度。此后，人用狂犬病疫苗制品纯化工艺不再有大的改进。国内外各种类型的狂犬病疫苗制品纯化工艺大致相同，依次为微滤澄清、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或凝胶过滤柱层析。
随着疫苗质量要求的不断提高，人们对狂犬病疫苗纯化技术的改进尝试工作也从未停止，总结前人所尝试的方法有：用β-丙内酯使其失活后通过区带离心法纯化狂犬病病毒[4]；浓缩病毒液依次经过阴离子交换色谱，阳离子交换色谱，金属鳌合亲和色谱处理[5]；硫酸鱼精蛋白-琼脂糖凝胶层析和分子筛层析法先后对病毒液进行提纯[6]；用特定波长的超声波处理浓缩病毒液，再经过分子筛层析提纯得到第一次纯化液，然后重复上述操作获得第二次纯化液[7]；在接种病毒前，用含有丁酸钠和硫酸鱼精蛋白的pbs溶液清洗生产细胞，病毒收获液经分子筛复合离子层析纯化[8]；用阳离子交换层析、核酸酶、蔗糖梯度超速离心依次对超滤浓缩病毒液进行处理从而实现纯化[9]；通过可互换次序的阴离子交换层析和羟基磷灰石层析依次对病毒液进行提纯[10]等。
到目前为止，上述方法都或多或少存在一些缺陷。比如超声波处理不可避免的会对病毒目的蛋白的活性造成一定的损伤，影响疫苗产品收率；不仅如此，超声波能改变物质原有结构，有可能使杂质的成分变得更复杂。而密度梯度离心操作繁琐，工作量较大，设备昂贵，不适宜大规模工业生产，且大幅增加了非终端灭菌制品的染菌风险；硫酸鱼精蛋白在结合dna的同时也结合了部分病毒糖蛋白,造成了较大的活性损失[11]。李旭等[12]曾对新型的复合介质captocore700纯化狂犬病疫苗的效果做了研究，发现其与传统sepharose系列凝胶纯化方法的杂质去除能力差异不大，其主要是在纯化上样体积方面具有优势。曾蓉芳等[13]早在1997年应用sepharosecl-6b和deae交换树脂为介质进行了疫苗小量试制工艺的尝试，但该工艺的病毒得率和扩大生产还未得到进一步的探索。
参考文献：
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11.张磊,黄林,周兰斌,等.人用vero细胞狂犬病疫苗纯化工艺的建立[j].预防医学情报杂志.2003,19(03):198-199.
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技术实现要素：
为实现既不显著影响疫苗制品的药效，又能有效去除各种杂质的目标，特此提出本发明。
本发明提供了一种用分子筛层析结合阴离子交换层析大规模纯化浓缩病毒液，从而获得符合现行药典质量标准的狂犬病疫苗的生产方法。
本发明首先涉及一种灭活狂犬疫苗的生产方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)以vero细胞为病毒宿主接种并培养狂犬疫苗毒株，收获病毒浓缩液；
(2)病毒灭活；
(3)分子筛层析联用阴离子交换层析制备得纯化的灭活狂犬疫苗。
步骤(1)的具体步骤为：
1)将复苏后的单层vero细胞置37℃培养成均匀单层细胞，所使用的培养基为含5％牛血清的m199细胞培养基；
2)将培养好的vero细胞接种终末反应器，进行75l～300l体积的生物反应器细胞培养；培养参数为温度36.5±1℃、ph7.25±0.2、po230.0～80.0％、灌流量1～5个反应器工作体积/24小时；培养96～120小时后细胞数应达到(4.0～10.0)×106cells/ml；
3)向上述步骤2)中培养完毕的vero细胞中，按0.01～0.1moi接种狂犬病病毒毒种，培养参数为温度33～37℃、ph6.8～8.0、po230.0～80.0％、灌流量为1～5个反应器工作体积/24小时；
4)病毒培养3天后开始收获病毒液，连续收集4～6天并合并病毒液后，经0.2～0.45μm孔径滤芯澄清，再经300kd的膜包浓缩40～80倍，获得病毒浓缩液，获得的病毒液总蛋白不超过10mg/ml；
步骤(2)的具体步骤为：
1)按1：4000比例加入β-丙内酯(β-丙内酯原液)，置2～8℃灭活48～72小时；
2)随后37℃水解2～4小时，以确保β-丙内酯完全水解；
步骤(3)的具体步骤为：首先进行分子筛层析，然后进行阴离子交换层析
所述的分子筛层析技术参数为：
1)层析介质sepharose4fastflow，层析柱高度70～80cm；
2)平衡、洗脱缓冲液为ph7.2～8.2的6～60mmpbs(50～500mmnacl)，优选的，平衡、洗脱缓冲液为ph7.4～7.9的12～50mmpbs(100～400mmnacl)；
3)平衡缓冲液用量为直至柱后流出液ph7.2～8.2，优选的，平衡缓冲液用量为1.7～2.3个柱体积；
4)上样体积为3～8％柱体积；
5)上样、洗脱流速30～45cm/h，优选的，上样、洗脱流速为35～40cm/h；
6)使用紫外检测器检测波长280nm处的吸收值，收集第一个洗脱峰，得到粗纯疫苗；
所述的阴离子交换层析技术参数为：
1)层析介质qsepharosetmxl，层析柱高度20～40cm；
2)平衡缓冲液为ph7.2～8.2的6～60mmpbs(50～500mmnacl)，洗脱缓冲液为ph6.8～7.8的6～60mmpbs(50～1000mmnacl)，优选的，平衡缓冲液为ph7.4～7.9的12～50mmpbs(100～400mmnacl)，洗脱缓冲液为ph7.1～7.6的12～50mmpbs(300～800mmnacl)；
3)上样体积为15～40％柱体积；
4)上样、洗脱流速30～45cm/h，优选的，上样、洗脱流速35～40cm/h；
5)平衡缓冲液用量为8～12个柱体积；
6)使用紫外检测器检测波长280nm处的吸收值，收集第一个洗脱峰，获得纯化的灭活疫苗产品。
本发明的有益效果在于：
(1)在不向疫苗制品中添加任何化学、生物物质,并保证疫苗抗原原始结构的前提下,充分利用目的蛋白与杂质在物理和化学特性方面的差异，可有效去除杂蛋白、宿主dna；
(2)操作相对简单，污染风险低，并可结合使用双流路全自动生产液相层析系统，实现两次纯化工艺的串联，提升工艺的连贯性，进而进一步简化下游工艺操作，提高工作效率；
(3)离子交换层析结合能力强，可避免病毒抗原被稀释，为半成品配制提供充足操作空间。
附图说明
图1、分子筛层析后的样本图谱
图2、离子交换层析后的样本图谱
图3、分子筛层析后样品中病毒粒子透射电镜检测结果
图4、两级层析后样品中病毒粒子透射电镜检测结果
具体实施方式
实施例1、狂犬疫苗的生产及层析纯化
1、细胞和毒种
vero细胞：来自美国标准菌种保藏中心(atccccl-81)，代次为134代。由本公司狂犬病疫苗室传代，建立主细胞库、工作细胞库，生产用细胞代次不超过150代。
狂犬病毒毒株ctn-1v株：购自中国药品生物制品检定所，第23代。由本公司狂犬病疫苗室传代，建立主种子库、工作种子库，生产用工作种子批代次不超过35代，病毒滴度7.5～8.0lgld50/ml。
2、vero细胞细胞培养
(1)取工作细胞库中同批的1支或几支细胞管，复苏扩增至接种病毒的细胞为1批。
(2)将复苏后的单层细胞用0.25％胰蛋白酶与0.02％edta混合消化液或trypletm进行消化，分散成均匀的细胞，加入含5％牛血清的m199细胞培养液，置37℃培养成均匀单层细胞。
(3)按照步骤(2)的方法传代至一定代次后可经导罐或直接接种终末反应器，进行75l～300l体积的生物反应器细胞培养；培养参数为温度36.5±1℃、ph7.25±0.2、po230.0～80.0％、灌流量1～5个反应器工作体积/24小时；培养96～120小时，细胞数应达到(4.0～10.0)×106cells/ml。
3、病毒接种和培养
向上述步骤2中培养完毕的vero细胞培养设备中，按0.01～0.1moi接种狂犬病病毒毒种，培养参数为温度33～37℃、ph6.8～8.0、po230.0～80.0％、灌流量为1～5个反应器工作体积/24小时。
4、病毒收获
(1)病毒培养3天后开始收获病毒液，收集病毒液时的收集量与灌流量相同。
(2)根据需要及实际情况，可连续收获病毒液5天以上，每天收获的病毒液为单次病毒收获液。
5、病毒液澄清、浓缩
同批细胞生产的多次病毒收获液在严格无菌操作的条件下单独或者合并为一批，经0.2～0.45μm孔径滤芯澄清，再经300kd的膜包浓缩40～80倍，获得病毒浓缩液。
6、病毒灭活
(1)按1：4000比例加入β-丙内酯溶液，置2～8℃灭活48～72小时；
(2)随后37℃水解2～4小时，以确保β-丙内酯完全水解。
7、病毒液纯化
7.1、分子筛层析
(1)层析柱准备
纯化前，用1.5～2倍柱体积的0.5mnaoh溶液清洗、灭菌装载sepharose4fastflow层析介质的层析柱。
(2)层析操作
层析柱用1.7～3倍柱体积的pbs缓冲液平衡后，上样病毒浓缩液，上样体积为3～8％柱体积，上样和洗脱线流速控制在30～45cm/h，收集第一洗脱峰(紫外检测器波长280nm)，得到中间产物1(图1)。
7.2、离子交换层析
(1)层析柱准备
纯化前，先用1个柱体积的0.8～1.5mnacl溶液再生qsepharosetmxl层析柱，再用1.5～2倍柱体积的1mnaoh溶液对其进行清洗、灭菌处理。
(2)层析操作
层析柱用8～12倍柱体积的pbs缓冲液平衡，然后上样中间产物1，上样体积为15～40％柱体积，上样和洗脱线流速控制在30～45cm/h，收集第一洗脱峰(紫外检测器波长280nm)，得到目标产物(图2)。
实施例2、纯化疫苗的效果评估
1、疫苗的性质检测
按《中国药典》三部(2015版)[14]的要求，采用vero细胞残余蛋白检测试剂盒检测宿主细胞蛋白含量，计算宿主细胞蛋白去除率(表1)；dna探针杂交法检测宿主细胞dna残余量，确认其是否符合质量标准；qpcr法对dna进行定量检测，计算宿主细胞dna去除率(表2)；elisa法检测狂犬病病毒糖蛋白含量，计算糖蛋白回收率(表3)；lowry法检测总蛋白含量，计算蛋白去除率(表4)。结果如下：
表1宿主细胞蛋白含量检测结果
表2宿主细胞dna含量检测结果
表3糖蛋白含量检测结果
表4总蛋白含量检测结果
2、疫苗的形态检测
狂犬病毒糖蛋白作为狂犬病疫苗的主要保护性抗原，其含量和3个主要抗原位点空间构想决定了疫苗的效价[15,16]。在实际生产中，狂犬病病毒在细胞中复制、组装过程时，会产生一些游离的小分子糖蛋白颗粒，这些小分子糖蛋白颗粒会被免疫实验检测到，但由于未结合在完整病毒颗粒上，其免疫原性低，不会引起患者产生免疫力。因此，在纯化过程中将游离的小分子糖蛋白颗粒去除，可以提高疫苗有效成分的相对含量，排除杂质的干扰。本研究中，通过透射电镜观察病毒粒子形态，考察了分子筛层析后和两级层析后有效成分的构象完整性，结果分别如图3、4，说明两级层析后的纯化病毒液中完整弹状病毒颗粒的含量明显高于传统单步分子筛层析。
3、疫苗成品质量检测
以上述纯化病毒液为原料配制得到的疫苗制剂，按《中华人民共和国药典》2015年三部收录的“冻干人用狂犬病疫苗(vero细胞)”制品检定规程的方法或所述药典通则规定的有关方法对其进行质量检测，并与现行版国家药典同类制品标准进行对比(表5)。
表5疫苗成品检测
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。
1.一种灭活狂犬疫苗的生产方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)以vero细胞为病毒宿主接种并培养狂犬疫苗毒株，收获病毒浓缩液；
(2)病毒灭活；
(3)分子筛层析联用阴离子交换层析制备得纯化的灭活狂犬疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤为：
1)将复苏后的单层vero细胞以含牛血清的细胞培养基培养成均匀单层细胞；
2)将培养好的vero细胞接种终末反应器，进行生物反应器细胞培养；
3)向上述步骤2)中培养完毕的vero细胞中接种培养狂犬病病毒毒种；
4)病毒接种培养3天后开始收获病毒液，连续收集4～6天并合并病毒液后，浓缩病毒液获得病毒浓缩液，收获的病毒液总蛋白不超过10mg/ml。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述的生物反应器细胞培养的参数为：
生物反应器的体积75l～300l；
培养参数为：温度36.5±1℃、ph7.25±0.2、po230.0～80.0％、灌流量1～5个反应器工作体积/24小时、培养96～120小时后细胞数应达到(4.0～10.0)×106cells/ml；
所述的接种狂犬病病毒毒种的参数为：
按0.01～0.1moi接种狂犬病病毒毒种；
培养参数为：温度33～37℃、ph6.8～8.0、po230.0～80.0％、灌流量为1～5个反应器工作体积/24小时；
所述的浓缩病毒液方法为：经0.2～0.45μm孔径滤芯澄清，再经300kd的膜包浓缩40～80倍。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：
1)按1：4000比例加入β-丙内酯原液，置2～8℃灭活48～72小时；
2)随后37℃水解2～4小时。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)的具体步骤为：首先进行分子筛层析，然后进行阴离子交换层析。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的分子筛层析技术参数为：
1)层析介质sepharose4fastflow，层析柱高度70～80cm；
2)平衡、洗脱缓冲液为ph7.2～8.2的6～60mmpbs(50～500mmnacl)，优选的，平衡、洗脱缓冲液为ph7.4～7.9的12～50mmpbs(100～400mmnacl)；
3)平衡缓冲液用量为直至柱后流出液ph7.2～8.2，优选的，平衡缓冲液用量为1.7～2.3个柱体积；
4)上样样品为步骤(2)获得的病毒灭活液，上样体积为3～8％柱体积；
5)上样、洗脱流速30～45cm/h，优选的，上样、洗脱流速为35～40cm/h；
6)使用紫外检测器检测波长280nm处的吸收值，收集第一个洗脱峰，得到粗纯疫苗。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析技术参数为：
1)层析介质qsepharosetmxl，层析柱高度20～40cm；
2)平衡缓冲液为ph7.2～8.2的6～60mmpbs(50～500mmnacl)，洗脱缓冲液为ph6.8～7.8的6～60mmpbs(50～1000mmnacl)，优选的，平衡缓冲液为ph7.4～7.9的12～50mmpbs(100～400mmnacl)，洗脱缓冲液为ph7.1～7.6的12～50mmpbs(300～800mmnacl)；
3)上样样品为层析后的粗纯疫苗，上样体积为15～40％柱体积；
4)上样、洗脱流速30～45cm/h，优选的，上样、洗脱流速35～40cm/h；
5)平衡缓冲液用量为8～12个柱体积；
6)使用紫外检测器检测波长280nm处的吸收值，收集第一个洗脱峰，获得纯化的灭活疫苗产品。
技术总结