本发明属于抗肿瘤纳米材料制备领域，涉及一种具有癌细胞杀伤功能的级联反应磁性金属有机框架纳米粒子的制备方法。
背景介绍
纳米酶是一类具有类似天然酶生物催化能力的纳米材料。模拟过氧化物酶的纳米酶是其中重要的一类，有着广泛的应用前景。这一类纳米酶以含铁的磁性纳米粒子为代表，除此以外还有五氧化二钒(v2o5)，硫化铜(cus)，过氧化铜(cuo2)，氧化石墨烯(go)等。一部分这类纳米酶的反应机理涉及到高氧化性的羟基自由基的产生，因而也为该类材料带来广泛的生物医学应用，例如抗菌，杀伤癌细胞等。在目前的研究中，含铁的磁性纳米粒子是最常见的一类纳米酶，可以与过氧化氢通过芬顿反应产生高毒性的羟基自由基用于抗肿瘤或抗菌。但是肿瘤部位的过氧化氢浓度难以实现高效的反应。而肿瘤的快速生长需要大量的葡萄糖作为营养物质。葡萄糖氧化酶(gox)可以特异性地、高效地将葡萄糖转化为葡萄糖酸，同时生成过氧化氢，一方面为芬顿反应提供足够的过氧化氢反应生成高毒性的羟基自由基，另一方面也可以消耗葡萄糖，抑制癌细胞的生长。值得一提的是，在金属有机框架(mof)纳米粒子中，若fe不作为金属离子配位存在于框架中，也可通过矿化的方式形成具有铁磁性的磁性结构存在于纳米粒子中。此时，含fe的磁性结构既可作为芬顿反应的反应中心，使纳米粒子具有过氧化物酶的特性，也可以为纳米粒子提供磁性，促进纳米粒子的胞吞以及磁靶向，来高效定点杀死癌细胞，减少对正常细胞的伤害。同时mof纳米粒子也可以作为负载gox的载体，负载gox后可以与mof中的含铁的磁性结构构成级联的反应体系，消耗葡萄糖的同时反应生成羟基自由基，从而实现癌细胞的有效杀伤。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种具有癌细胞杀伤功能的级联反应磁性mof纳米粒子的制备方法。本发明制备的负载gox的磁性mof纳米粒子能够发生级联反应同时粒子具有磁性，可以利用粒子磁性来促进细胞胞吞和磁靶向，达到高效定点杀死癌细胞的目的同时减少对其他部位的影响。
本发明采用以下技术方案实现：
一种具有癌细胞杀伤功能的级联反应mof纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)将咪唑类有机配体、七水合硫酸亚铁(feso4·7h2o)和金属配体溶解于去离子水中，使其浓度分别为0.05-0.4g/ml、0.01-0.06g/ml和0.01-0.06g/ml，于室温静置孵育4h-24h。孵育结束后离心去除上清液，加入去离子水洗涤粒子3次，得到磁性mof纳米粒子；
2)将步骤1)所得的mof纳米粒子分散到水中,加入gox使其浓度均为1-10mg/ml，于4℃-30℃静置孵育3h-12h，结束后离心去除上清液，加入水洗涤粒子，离心去除上清液从而得到级联反应磁性mof纳米粒子。
上述技术方案中，进一步地，所述的咪唑类有机配体是2-甲基咪唑、乙基咪唑或咪唑-2-甲醛。
上述技术方案中，进一步地，所述的金属配体来源于二水合醋酸锌(zn(oac)2·2h2o)、硝酸锌(zn(no3)2)或四水合醋酸钴(co(oac)2·4h2o)。
本发明的原理是：在本发明癌细胞杀伤功能的级联反应磁性mof纳米粒子的制备方法中，通过金属离子或者金属离子簇和有机配体之间的配位作用在溶剂中配位，进一步生长成mof纳米粒子。在粒子的生长过程中，加入的fe2 不断发生矿化反应从而在纳米粒子中形成磁性结构。将磁性mof纳米粒子与gox混合孵育一段时间可通过静电相互作用实现gox在粒子表面的负载，最终得到级联反应磁性mof纳米粒子。gox可以将葡萄糖转化成过氧化氢，磁性mof纳米粒子中的铁结构在过氧化氢的存在下产生高的芬顿反应活性，利用过氧化氢高效反应产生羟基自由基，羟基自由基具有非常高的氧化能力，会对癌细胞的磷脂、蛋白质以及dna等生物大分子进行氧化，从而达到杀死癌细胞的目的。此外，gox催化反应消耗葡萄糖，也可以切断癌细胞的营养供应，增强杀伤效果。在磁场的作用下，级联反应磁性mof纳米粒子可以迅速被癌细胞胞吞，若在特定区域施加磁场，粒子可以进行磁靶向定位治疗，相比于不具有磁性的纳米粒子具有更优秀的癌细胞杀伤效果的同时可以减小对正常细胞的伤害。
本发明的有益效果在于：
本发明所用原料来源广泛，制备过程简单可控，可以放大规模；可以利用磁性mof纳米粒子中的铁进行级联反应，可以利用癌细胞生长的葡萄糖产生羟基自由基杀死癌细胞；纳米粒子的磁性结构使粒子带有磁性，可以利用磁性促进粒子胞吞并进行磁靶向，对特定部位肿瘤进行杀伤。
附图说明
图1a)是不负载gox的磁性mof纳米粒子的扫描电镜照片，b)是负载有gox的级联反应磁性mof纳米粒子的扫描电镜照片。
图2)是未负载和负载gox的磁性mof纳米粒子在室温下的磁化曲线。
图3a)是级联反应磁性mof纳米粒子的反应活性与ph值的关系，b)是该粒子的反应活性与温度的关系。
图4a)和b)是利用二甲基吡啶氮氧化物检测级联反应磁性mof纳米粒子在酸性和中性两个条件下的羟基自由基的生成情况。
图5是级联反应磁性mof纳米粒子的癌细胞杀伤效果情况。
图6是利用细胞活性氧探针检测级联反应磁性mof纳米粒子在癌细胞中产生羟基自由基的情况。
图7是细胞层次上级联反应磁性mof纳米粒子磁靶向杀死癌细胞的活死细胞共染色图。
具体实施方式
以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实施例1
1)将2-甲基咪唑、七水合硫酸亚铁(feso4·7h2o)和二水合醋酸锌(zn(oac)2·2h2o)溶解于去离子水中，使其浓度分别为0.224g/ml、0.03g/ml和0.03g/ml，于室温静置反应24h。反应结束后离心去除上清液，加入去离子水洗涤粒子3次，扫描电镜照片见图1a)。
2)将步骤1)所得的磁性mof纳米粒子分散到水中,加入gox。两者浓度分别为5mg/ml和4mg/ml，于4℃静置孵育12h，反应结束后离心去除上清液，加入水洗涤粒子3次从而得到级联反应磁性金属有机框架纳米粒子。
实施例2
步骤同实施例1，但在步骤1)中用乙基咪唑代替2-甲基咪唑，成功制得了级联反应磁性mof纳米粒子。
实施例3
步骤同实施例1，但在步骤1)中用四水合醋酸钴(co(oac)2·4h2o)代替二水合醋酸锌(zn(oac)2·2h2o)，成功制得了级联反应磁性mof纳米粒子。
本发明方法制备的具有癌细胞杀伤功能的级联反应磁性mof纳米粒子的电镜照片见图1b)。图1a)为不负载gox的磁性mof纳米粒子的扫描电镜照片。从图中可知，负载gox前后粒子形态均为菱形十二面体。
图2是未负载和负载gox的磁性mof纳米粒子的磁化曲线。从图中可知，是否负载gox对粒子的磁性几乎不会造成影响，负载前后均具有铁磁性。
图3a)是级联反应磁性mof纳米粒子的反应活性与ph值的关系，b)是该粒子的反应活性与温度的关系。从图中可知，该粒子在ph＝4以及45℃具有最优的级联反应活性。
利用一种特异性检测羟基自由基的试剂二甲基吡啶氮氧化物来检测该粒子在酸性和中性条件下生成羟基自由基的情况，粒子浓度为100μg/ml，葡萄糖浓度为10mmol/l，二甲基吡啶氮氧化物的浓度为30mmol/l，粒子、葡萄糖和二甲基吡啶氮氧化物反应10分钟，结果见图4a)和b)。从图中可知，该粒子在ph＝5的条件下最终反应得到羟基自由基，而在中性条件下则不会产生。
为检测该粒子抗肿瘤性能，将其与宫颈癌细胞(hela)在有无磁铁吸引下共培养1h，洗去粒子后再继续培养24h，通过cck8试剂盒测定细胞活性，以不负载葡萄糖氧化酶的粒子(fe@zif-8)、自由的葡萄糖氧化酶作为对照，粒子的浓度为20,35,45,70,140μg/ml，抗肿瘤结果见图5。从图中可知，负载gox的磁性mof纳米粒子在磁场作用下可以显著杀死癌细胞，比未加磁场的粒子、未负载gox的磁性金属有机框架纳米粒子和自由酶具有更好的杀伤效果。
为检测该粒子在细胞中产生羟基自由基的情况，将级联反应磁性mof纳米粒子有或无磁场下与hela细胞共培养1h，洗去粒子后再培养2h，用细胞活性氧探针(dcfh-da)检测细胞内活性氧产生情况，粒子浓度为35μg/ml细胞荧光照片见图6，可以明显看出磁场处理后的磁性粒子相比未加磁场可以产生更多的羟基自由基。
在细胞层面上检测级联反应磁性mof纳米粒子的磁靶向能力，在磁场作用下粒子与hela细胞在培养盘中共培养3h，粒子在磁场的作用下会靶向至磁场位置处并对磁场位置处的细胞进行杀伤，因此可以降低对其他位置细胞的伤害。培养后，用钙黄绿素/碘化丙啶对hela细胞进行活死细胞共染色，染色结果见图7，可以看出无磁场位置绝大部分细胞存活，表现为绿色；有磁场位置绝大部分细胞死亡，表现为红色。从而证明了级联反应磁性金属有机纳米粒子的磁靶向杀死细胞能力。
1.一种具有癌细胞杀伤功能的级联反应磁性金属有机框架纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)将咪唑类有机配体、七水合硫酸亚铁和金属配体溶解于去离子水中，使其浓度分别为0.05-0.4g/ml、0.01-0.06g/ml和0.01-0.06g/ml，于室温静置孵育4h-24h，反应结束后离心去除上清液，加入去离子水洗涤粒子，离心去除上清液得到磁性金属有机框架纳米粒子；
2)将步骤1)所得的金属有机框架粒子分散到水中,浓度为1-10mg/ml，再加入葡萄糖氧化酶，浓度1-10mg/ml，于4℃-30℃静置孵育3h-12h，反应结束后离心去除上清液，加入去离子水洗涤粒子，离心去除上清液从而得到级联反应磁性金属有机框架纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤功能的级联反应磁性金属有机框架纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的咪唑类有机配体是2-甲基咪唑、乙基咪唑或者咪唑-2-甲醛。
3.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤功能的级联反应磁性金属有机框架纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的金属配体是二水合醋酸锌、硝酸锌或者四水合醋酸钴。
4.一种具有抗肿瘤功能的级联反应磁性金属有机框架纳米粒子，其特征在于，采用如权利要求1-3任一项所述的方法制备得到。
5.如权利要求4所述的纳米粒子的用途，其特征在于，用于制备治疗癌症的药物。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的药物与磁场共同作用。
技术总结