本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种纳米粒、其制剂以及制备方法和应用
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
我国的恶性肿瘤的发生率和死亡率呈现逐年上升状态，严重危害我国人民的公共健康。目前，临床上常用的癌症治疗的手段包括，手术治疗，化疗，光疗，放疗，免疫治疗等。手术治疗转移和复发率高，化疗易产生耐药，且具有较大的全身毒性。1996年，光动力疗法(photodynamictherapy,pdt)经美国食品药品监督管理局(theusfoodanddrugadministration，fda)临床批准作为对恶性肿瘤的治疗手段。光动力治疗剂中二氢卟吩类(如二氢卟吩e6，ce6)由于其反应能力强、靶向性高以及毒副作用小等优点在肿瘤研究领域已经进行广泛的研究。但是，发明人发现，ce6极易吸湿，极易氧化，稳定性较差，限制了其在抗肿瘤领域的应用。肿瘤组织体积的增大及肿瘤细胞数量的增多使得肿瘤组织内血液需求量急剧增加，引起肿瘤内部血管紊乱及血供不足，无法为肿瘤细胞生长提供足够的氧，使得肿瘤细胞处于缺氧的状态。肿瘤本身乏氧，而且光动力治疗快速消耗氧气会加剧肿瘤部位的缺氧。此时肿瘤会通过分泌血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)从而促进血管大量生成，为其提供生长提供营养物质和排泄代谢废物。同时，新生血管也是肿瘤细胞向远处转移的重要通道，肿瘤细胞通过血管才能到达转移地点。
阿西替尼(axitinib,axt)作为酪氨酸激酶受体抑制剂中的一员，通过抑制肿瘤部位内皮生长因子受体(vegfr-1、vegfr-2和vegfr-3)，可以有效的治疗或缓解转移性肾细胞癌，肾癌等恶性肿瘤。但是，发明人发现，该药物水溶性差，一般作为口服制剂，或通过腹腔注射给药，导致其生物利用度较低，限制了其在临床上的应用。
临床上，单一的治疗方式，如手术治疗，化疗，放射性治疗等，并不能有效的治疗或延缓恶性肿瘤的进展。肿瘤免疫治疗由于其在肿瘤治疗中的高效性，已经成为近几年研究的热点，其通过增强自身免疫系统的力量去对抗肿瘤，利用源于自身或外界的物质，改善或恢复身体免疫系统的功能。主要有肿瘤疫苗，免疫检查点阻断以及嵌合抗原受体t细胞等手段，并且取得较为喜人的效果。但是，众多免疫治疗只能阻断肿瘤免疫抑制，并不能激活肿瘤自身的免疫应答。因此，提高肿瘤免疫原性，激活免疫应答成为提高肿瘤免疫治疗效果的关键。吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，ido)是一种细胞内含血红素的酶，催化色氨酸降解为犬尿氨酸，t淋巴细胞对体内色氨酸的浓度非常敏感，色氨酸缺乏会导致t淋巴细胞细胞周期停止。ido表达可以通过局部阻断t淋巴细胞增殖来抑制其免疫功能，通过使用色氨酸类似物如1-甲基-d-色氨酸(1-methyl-d-tryptophan,1mt)作为ido酶的竞争性抑制剂可以增加肿瘤部位t淋巴细胞的浸润，增强免疫效果。但是，发明人发现，单一的ido酶抑制剂的使用往往不能达到理想的免疫效果，主要是因为缺乏免疫反应中肿瘤抗原的产生，抗原的呈递过程受阻。而且，作为ido酶抑制剂的1mt由于其水溶性较差，生物利用度较低。以及，目前对1mt的结构改造主要是通过化学合成的方式在其羧基或氨基的位置修饰亲水性聚合物等改善其水溶性。但是化学合成往往过程复杂，产率较低，不利于工业转化。
技术实现要素：
因此，为了解决现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种基于白蛋白构建的可对肿瘤实现光疗、化疗和免疫治疗的三位一体的多功能纳米粒、包含该纳米粒的制剂以及其制备方法和应用。发明将三种药物通过一种简单的方法构建为可以对肿瘤实现光疗、化疗和免疫治疗的三位一体的多功能纳米治疗平台，可以解决ce6、axt、1mt本身药物性质不稳定，溶解性差，生物利用度低等问题，同时三种药物在同一纳米聚集体中可以避免多次分开给药，提高患者的依从性。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种纳米粒，其为以1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼和二氢卟吩e6三种治疗剂为活性成分的基于白蛋白构建的纳米聚集体。
本发明中，如无特殊说明，本发明所述纳米粒也可以称为cam纳米粒或简写为camnps。
在本发明的实施方式中，所述纳米粒由1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼和二氢卟吩e6于白蛋白中聚集得到。
本发明的技术方案中，1mt、ce6和axt三者基于白蛋白形成纳米聚集体实现三者的协同使用，同时解决了1mt极性大、透膜性差、在体内易被代谢失活、水溶性差不可静脉注射等缺点，ce6极易被氧化、稳定性差、透膜性弱的缺点，以及axt水溶性差，只能作为口服制剂或通过腹腔注射给药从而导致生物利用度较低的缺点；并且，本发明的发明人在研究中发现，在本发明提供的纳米粒中，axt可以缓解由于ce6光动力治疗带来的促进血管新生，增加肿瘤转移风险的副作用；ce6的光动力治疗效果可以引起肿瘤细胞钙网蛋白外露，引起免疫原性细胞(immunogeniccelldeath,icd)死亡，导致肿瘤释放抗原，阿西替尼可以下调肿瘤微环境中的ido酶的含量，同时1mt可以抑制肿瘤微环境中已经存在的ido酶的活性，两者双管齐下，大大缓解ido酶对树突状细胞抗原处理呈递功能的抑制，进而激活t淋巴细胞，增强免疫效果；而且axt对肿瘤新生血管的抑制作用和增强的免疫作用均可以减少肿瘤的转移；本发明的技术方案最终实现对肿瘤光疗、化疗和免疫治疗三者协同治疗的效果。
在本发明的实施方式中，所述1mt、axt和ce6的质量比为8-12:8-12:5-15，在本发明的比例范围内，本发明所述纳米粒对三种药物均具有优异的包封率，包封率高于80％，质量比低于或高于该比例均会造成包封率的下降，尤其是，当1mt、axt和ce6的质量比为1:1:1时，对药物的包封率最好，可达到90％。
在本发明的实施方式中，所述人血清白蛋白溶液为人血清蛋白水溶液，其浓度为2-8mg/ml，随着白蛋白浓度的增加，对纳米粒稳定性影响不大，但会导致纳米粒的粒径增加，包封率下降，综合考量纳米粒稳定性、粒径、包封率等问题的情况下，白蛋白浓度在2-8mg/ml为宜，尤其优选为4mg/ml。
在本发明的实施方式中，所述纳米粒的粒径在80～300nm，为了满足实体瘤的高通透性和滞留效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect，epr)，本发明将粒径优选为～110nm(110nm左右)。
所述纳米粒的zata电势为-5.0～-15.0mv，由于纳米粒电势的绝对值越接近于25.0mv，纳米粒越不易发生聚沉，稳定性越高，所以本发明以-15.0mv为较优电势。
此外，在本发明的实施方式中，ce6和人血清白蛋白对本发明纳米粒的形成和稳定具有不可替代的作用，两者缺一不可。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备如上第一方面中所述的纳米粒的方法，其包括：将1mt、axt和ce6分别溶于溶剂中混合后，滴入至人血清白蛋白溶液中，超声，透析，即得。
在本发明的实施方式中，所述溶剂选自二甲基亚砜(dmso)、甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯等中的一种或多种，发明人发现，在上述溶剂中只有二甲基亚砜可以实现同时对ce6和axt均具有良好的溶解性，虽然1mt在此溶剂中溶解性较低，但是可以实现良好分散，所以以二甲基亚砜为优选溶剂。
在本发明的实施方式中，所述1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼或二氢卟吩e6溶于溶剂、以及三者的溶液混合时均需避光进行。
在本发明的实施方式中，1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼和二氢卟吩e6分别溶解于溶剂后的浓度分别为12-18mg/ml，优选分别为15mg/ml；
在本发明的实施方式中，所述人血清白蛋白溶液为人血清蛋白水溶液，其浓度为2-8mg/ml，优选为4mg/ml；
在本发明的实施方式中，将1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼和二氢卟吩e6的dmso混合溶液与人血清蛋白的水溶液的体积比的可行范围为1-5:20，为了更好的达到纳米粒治疗浓度和稳定性的要求，dmso与蒸馏水的体积比优选为3:20。
具体地，在本发明的一些实施方式中，本发明所述纳米粒的制备方法包括：将1mt、axt和ce6分别溶于二甲基亚砜中，将上述溶液按照一定比例混合，在搅拌条件下逐滴滴入人血清白蛋白的水溶液中，利用人血清白蛋白的两亲性和ce6疏水相互作用形成稳定的纳米聚集体(于溶液中混悬)；将形成的混悬液用蒸馏水透析，除去游离的药物和有机溶剂。最终得到绿色纳米聚集混悬液，将制备的纳米混悬液置于冰箱内4℃冷藏避光保存。将得到的纳米混悬液滴在具有碳支持膜的铜网上，将样品置于阴凉处至水分挥干，在透射电子显微镜下观察其微观形态，得到cam纳米粒(camnps)形态。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种组合物或药物制剂，其包含如上第一方面中所述的纳米粒；或者，还可以进一步包含至少一种药学上可接受的辅料；根据药物制剂的剂型，本领域技术人员可根据需要选择适宜的辅料。
在本发明的实施方式中，所述药物制剂为口服制剂或注射剂，优选为静脉注射剂，本发明所述纳米粒粒径在110nm左右，性质稳定，适于静脉注射。在一些实施方式中，本发明的静脉注射液中每种药物的平均浓度可达450μgml-1。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物载体或药物递送系统，其包含如上所述本发明第一方面中所述的纳米粒。
本发明所述ce6是一种光疗药剂，在本发明的发明构思下，本领域技术人员有可能尝试其他光疗药剂，比如ir780碘化物(ir780)、新吲哚菁绿(ir820)等；以及，在本发明的公开下，本领域技术人言也可能会尝试其他化疗和免疫结合类的药物，比如索拉菲尼、阿帕替尼等多靶点的酪氨酸激酶抑制剂；如果存在，在实现本发明所公开的技术效果下，这些技术技术方案均应视为本发明发明构思下合理延展，应视为包含在本发明的技术方案中。
在本发明的第五方面，本发明还提供了本发明上述第一方面中所述的纳米粒或上述第三方面所述的组合物或药物制剂或上述第四方面中所述的药物载体或药物递送系统在制备用于预防和/或治疗癌症和/或肿瘤的药物中的应用。
在本发明的实施方式中，所述药物可以治疗或缓解良性肿瘤或恶性肿瘤；所述癌症或肿瘤包括但不限于黑色素瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌等实体瘤。
在本发明的实施方式中，本发明评估了1mt、axt、ce6、此三种药物的简单物理混合(mix)、以及本发明的cam纳米粒的体外细胞毒性以及对实体瘤的抑制作用，结果表明，在体外细胞毒性实验中，axt、ce6、物理混合物及cam纳米粒的抗肿瘤效果均具有浓度依赖性，从激光照射组来看，cam纳米粒的效果明显要强于物理混合组和单独原料药axt组、ce6组。同时，从非激光照射组来看，cam纳米粒组具有较好的生物相容性。在实体瘤抑制实验中，本发明的cam纳米粒相较于物理混合组mix以及原料药ce6组、1mt组、axt组，均具有更好的肿瘤抑制作用，具有更为优异的抑瘤效果。
相较于现有技术，本发明取得了以下有益效果：
(1)本发明首次制的camnps，此纳米粒不仅解决了ce6极易被氧化，稳定性差，膜通透性弱等缺点，还可在人血清白蛋白的水溶液中与axt共组装形成结构均一的纳米粒，解决了axt水溶性极差，仅可用于口服或腹腔注射的缺点。
(2)本发明制得的纳米静脉制剂cam纳米粒，载药量高，粒径均一，稳定性高，生物相容性好。
(3)cam纳米粒相比于其物理混合物显示较强的细胞毒性，且人血清白蛋白作为稳定剂生物相容性好，毒性低，为光疗，化疗和免疫治疗相结合的增强的抗肿瘤提供更多可能。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是实施例2中cam纳米粒(由实施例1制备)形成的紫外图谱；
图2是实施例3中cam纳米聚集体外观形态及聚集状态图；
图3是实施例4中cam纳米粒体外细胞毒性实验结果，a图为激光照射条件，b图为非激光照射条件；
图4是实施例5中cam纳米聚集体的体内抗肿瘤实验(采用单因素方差分析，统计学意义：*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1cam纳米粒的制备
用分析天平精密分别称取一定量的1-甲基-d-色氨酸(1mt)、阿西替尼(axt)、二氢卟吩e6(ce6)，分散于二甲基亚砜(dmso)中，取一定量的上述三种溶液(三种溶液的浓度均分别为15mg/ml)冰浴条件下混匀得到混合物a。称取一定量人血清白蛋白溶于2ml蒸馏水中，人血清白蛋白的浓度为4mg/ml，在快速搅拌条件下将混合物a缓慢滴入上述反应溶液(混合物a与人血清白蛋白的体积比为3:20)中，搅拌15min，超声15min使得粒径更加均匀，得到绿色混悬液，1mt、axt、ce6的质量比为1:1:1。反应结束后，用蒸馏水透析3h,除去未结合的游离药物和有机溶剂。纳米粒的紫外图谱如图1所示，纳米粒粒径为～110nm，其外观形态及聚集状态如图2所示。
实施例2紫外分光光度法(uv)检测cam纳米粒中组成比例
精密分别量取1体积的cam纳米粒混悬液，加入9体积二甲基亚砜，冰浴超声30min，充分瓦解纳米粒结构，用蒸馏水：二甲基亚砜＝1：9的溶剂为稀释液，将上述溶液稀释适当的倍数。以蒸馏水：二甲基亚砜＝1：9的溶剂为空白参照，紫外扫描得其吸光度，结果如图1所示，通过计算稀释液在280nm,360nm,660nm处的吸光度值，可知新制备的cam纳米粒的中三种药物的质量比接近1:1:1，同时三种药物的平均包封率可达到80％以上。通过uv谱图(图1)可以证实cam纳米粒的成功制备。
实施例3cam纳米聚集体状态及形态
制得的cam纳米聚集体溶液过0.8μm滤头，前后状态变化如图2a所示。吸取10μl未过膜的cam纳米聚集体混悬液滴于碳支持膜铜网上，滤纸吸去多余液体，室温下晾干置于透射电镜下观察cam纳米聚集体形态。电镜照片如图2b，结果显示三种药物及人血清白蛋白在水中可以相互作用形成尺度均匀的纳米球形结构，其纳米直径可以满足其用于静脉注射的要求。
实施例4cam纳米粒的体外细胞毒性研究
1.细胞的培养
选取鼠源黑色素瘤细胞b16f10作为研究对象。取冻存细胞，用含有1％青霉素-链霉素溶液和10％胎牛血清的1640培养基于37℃、5％co2条件下培养，待细胞生长至高密度时传代，按比例转移至培养瓶中继续培养并进行细胞计数。
2.细胞毒性实验
b16f10细胞用于评估不同浓度1-甲基-d-色氨酸,阿西替尼,二氢卟吩e6,三种药物的物理混合物及cam纳米粒的暗毒性和光毒性。用培养基将待测目标化合物ce6,物理混合物，cam纳米粒各按照ce6的量稀释至1、2、4、6、8μgml-1。其中1-甲基-d-色氨酸,阿西替尼的浓度按照cam纳米粒中的浓度比例稀释。收集对数生长期的b16f10细胞，细胞以8×103个/孔的浓度加入96孔板中，孵育过夜后，加入不同浓度的目标化合物溶液200μl，设3个复孔。将细胞在37℃下培养6小时，弃去含药培养基并洗涤，更换新鲜不含药的完全培养基，其中，光毒组接受100mw/cm2的激光照射5分钟，波长为660nm。进一步温育20小时后，孵育后，每孔加入0.5％的mtt溶液10μl，继续孵育4h，然后弃尽孔内液体，每孔加100μldmso溶解，用酶标仪测定570nm处吸光度，按照下式计算细胞抑制率：
根据目标化合物的浓度及相应的抑制率如图3所示，由此可以得出结论，阿西替尼,二氢卟吩e6，物理混合物及cam纳米粒的抗肿瘤效果均具有浓度依赖性。从激光照射组来看，cam纳米粒的效果明显要强于物理混合组和单独原料药阿西替尼和二氢卟吩e6组。同时，从非激光照射组来看，cam纳米粒组具有较好的生物相容性。
由此，可由本实施例得出结论，cam纳米静脉制剂对鼠源黑色素瘤细胞株b16f10细胞有理想的抑制作用，起效快，杀伤力强。
实施例5cam纳米粒的体内抑瘤研究
1.动物模型建立
6至8周雌性c57bl/6小鼠用于建立体内抗肿瘤模型。b16f10细胞悬液(每只小鼠8×105个细胞)皮下接种到6至8周c57bl/6雌性小鼠的右胁腹区作为原位瘤。四天后，在每只小鼠的左胁腹区再次皮下接种8×105个b16f10细胞作为远位瘤。
2.动物体内抑瘤实验
接种后8天，肿瘤达到～80mm3，此时，称重小鼠，随机分成6组：生理盐水作为对照组，1mt、axt、ce6、mix、cam后五组作为实验组，其中，ce6、mix、cam三组在静脉给药6h后，对肿瘤进行激光照射，光源波长为660nm，功率为100w/cm2，照射时长为10分钟。每三天给予一次治疗，共治疗五次。每两天测量远位肿瘤体积，并根据以下等式计算肿瘤体积：
l表示最大直径(mm)，而w表示最小直径(mm)。
在各种治疗14天后，处死小鼠以取出肿瘤称重。并根据以下公式计算每组小鼠肿瘤的抑制率：
wc表示生理盐水组的平均肿瘤重量，而wt表示其他组的最终肿瘤重量。
结果如图4所示，六组中，cam组肿瘤体积最小(贴近横坐标轴的最下方曲线)，并且第3-15天之间几乎无变化，抑制肿瘤效果明显优于其他五组。
本发明实施例中首次制得含有1mt,axt,ce6三种药物的稳定纳米静脉制剂，此纳米静脉制剂不仅解决了1mt极性大，透膜性差，在体内易被代谢失活等缺点，还解决了1mt和axt水溶性差，不可静脉注射的缺点，同时还增强了ce6的稳定性。而且还可在水中自组装形成结构均一的纳米粒。制备得到的cam纳米粒静脉注射制剂，不仅稳定性好，而且保存时间长，还可批量生产，易于储存与运输，为工业生产提供可能。细胞实验表明cam静脉纳米粒制剂对黑色素瘤细胞的杀伤力强，选择性好。同时，体内实验证明cam纳米制剂具有良好的肿瘤抑制作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种纳米粒，其为以1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼和二氢卟吩e6三种治疗剂为活性成分的基于白蛋白构建的纳米聚集体。
2.根据权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒由1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼和二氢卟吩e6于白蛋白中聚集得到；
优选地，所述1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼和二氢卟吩e6的质量比为8-12:8-12:5-15，优选为1:1:1。
3.根据权利要求1或2所述的纳米粒，其特征在于，所述白蛋白为人血清白蛋白，优选为人血清白蛋白的水溶液；
优选地，所述白蛋白的浓度为2-8mg/ml，优选为4mg/ml。
4.根据权利要求1或2所述的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的粒径为80-300nm，优选为110nm；优选地，所述纳米粒的zata电势的范围为-5.0～-15.0mv。
5.权利里要求1至4中任一项所述的纳米粒的制备方法，其包括：将1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼和二氢卟吩e6分别溶于溶剂中混合后，滴入至人血清白蛋白溶液中，超声，透析，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在本发明的实施方式中，所述溶剂选自二甲基亚砜、甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯等中的一种或多种，优选为二甲基亚砜。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼或二氢卟吩e6溶于溶剂中时需避光进行；
优选地，1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼和二氢卟吩e6分别溶解于溶剂后的浓度分别为12-18mg/ml，优选分别为15mg/ml；
优选地，所述人血清白蛋白溶液为人血清蛋白水溶液，其浓度为2-8mg/ml，优选为4mg/ml；
优选地，将1-甲基-d-色氨酸、阿西替尼和二氢卟吩e6的dmso混合溶液与人血清蛋白的水溶液的体积比1-5:20，优选为3:20。
8.组合物或药物制剂，其包含权利要求1至4中任一项所述的纳米粒；或者，还可以进一步包含至少一种药学上可接受的辅料；
优选地，所述药物制剂为口服制剂或注射剂，优选为静脉注射剂。
9.药物载体或药物递送系统，其包含权利要求1至4中任一项所述的纳米粒。
10.权利要求1至4中任一项所述的纳米粒或权利要求8中所述的组合物或权利要求9中所述的药物载体或药物递送系统在制备用于预防和/或治疗癌症和/或肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述药物可以治疗或缓解良性肿瘤或恶性肿瘤；
优选地，所述癌症或肿瘤选自黑色素瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌。
技术总结