本发明属于分子生物学与生物医学领域，涉及nufip-1在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
背景技术：
2016年初，第三版脓毒症国际共识将脓毒症定义为机体应对感染时的失控反应所致威胁生命的器官功能障碍。新定义着重强调了机体应对感染时出现的失衡反应状态，这意味着脓毒症的防治也进入了新纪元，针对免疫紊乱的调理策略将具有重要临床价值。脓毒症根据发病过程可分为早期的全身炎症反应期(sirs)和后期的代偿性抗炎反应期(cars)。数据显示：脓毒症患者大多可以度过早期的sirs期，后期cars引起的免疫抑制是脓毒症患者死亡的主要原因。近年来，在免疫抑制阶段除了炎症反应失衡、免疫紊乱和凝血功能障碍外，自噬和淋巴细胞凋亡与脓毒症的关系越来越受到研究者的关注。
蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者，没有蛋白质就没有生命。而核糖体它是进行蛋白质合成的重要细胞器，在快速增殖、分泌功能旺盛的细胞中尤其多。研究表明：脓毒症状态下，机体代谢旺盛，需要核糖体参与合成大量蛋白质，而核糖体超负荷运作会引起自身损伤导致功能障碍，而自噬是维持自身稳态的重要机制之一。
自噬是一种高度保守的利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是真核生物特有的现象，在1962年被发现，根据底物进入溶酶体途径的不同可分为微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬；根据底物是否具有特异性可将自噬分为选择性自噬和非选择性自噬。其中细胞器自噬便是近年来研究比较多的选择性自噬之一。核糖体自噬现象于2008年由kraft教授在啤酒酵母中首次提出，其团队同时发现核糖体自噬与泛素化过程密不可分，ubp3p/bre5p是核糖体自噬发生必不可少的成分。2010年，batool教授发现cdc48和ufd3是ubp3发挥作用的协作者，同样是核糖体自噬发生不可或缺的成分。4年后，batool教授团队再次发现ltn1e3配体介导的去泛素化过程可以有效防止核糖体60s大亚基的选择性降解。
当前，核糖体自噬的相关研究主要集中在酵母、细胞系实验中，核糖体自噬相关的动物实验研究还未见报道。核糖体质量控制与人类疾病的相关性研究大多聚焦在因核糖体功能障碍导致的先天性疾病中，作为核糖体质量控制的重要组成部分，核糖体自噬与人类相关疾病具有什么样的相关性还是一片未知的领域，本申请选择危重症领域死亡率最高的脓毒症作为研究背景，是核糖体自噬领域与脓毒症领域的首次结合，有望探索出脓毒症治疗的一个新的干预靶点。
技术实现要素：
第一方面，本发明提供了促进核糖体自噬的物质在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
第二方面，本发明提供了促进核糖体自噬的物质在制备抑制t细胞凋亡的药物中的应用。
进一步，所述物质包括促进核糖体自噬的试剂、促进核糖体自噬的分子。
本发明的促进核糖体自噬的试剂包括雷帕霉素、海藻糖、锂盐等自噬诱导剂。
本发明的促进核糖体自噬的分子包括但不限于：atg1、vps34、beclin1、atg5、atg12、lc3、自噬增强基因smyd3、tceb3、catsper4、megf10、kif5c、atg7、rela、gab1、loc285647、gpr18、mbp、pdcl、stim1、nfkb1、tpr、pggt1b、nufip-1。
在本发明的具体实施方案中，促进核糖体自噬的分子是nufip-1。
第三方面，本发明提供了一种促进核糖体自噬的试剂，所述试剂包括促进nufip-1的试剂。
进一步，促进nufip-1的试剂包括促进nufip-1基因表达的试剂，促进nufip-1基因表达产物活性的试剂。
本申请中使用的术语“基因表达产物”指的是由基因编码并可以直接或间接通过基因转录产生的物质。包括rna基因产物(例如mrna)，dna基因产物(例如cdna)和多肽基因产物(例如蛋白)。
进一步，促进nufip-1基因表达的试剂包括促进nufip-1基因mrna表达的试剂、nufip-1蛋白表达的试剂。
更进一步，促进nufip-1基因表达的试剂包括nufip-1基因过表达载体。
更进一步，促进nufip-1基因表达产物活性的试剂包括促进nufip-1蛋白活性的试剂。
第四方面，本发明提供了一种抑制t细胞凋亡的药物组合物，所述药物组合物包括前面所述的促进核糖体自噬的物质。
第五方面，本发明提供了nufip-1在制备促进核糖体自噬的试剂中的应用。
进一步，所述试剂如前面所述。
第六方面，本发明提供了一种促进核糖体自噬的方法，所述方法包括施用促进nufip-1的试剂。
进一步，所述试剂如前面所述。
第七方面，本发明提供了一种预防或治疗脓毒症的方法，所述方法包括施用促进nufip-1的试剂。
所述试剂如前面所述。
作为可替代的技术方案，本发明提供了一种预防或治疗脓毒症的方法，所述方法包括施用促进核糖体自噬的物质。
所述物质如前面所述。
第八方面，本发明提供了一种抑制t细胞凋亡的方法，所述方法包括施用促进核糖体自噬的物质。
所述物质如前面所述。
本申请中使用的术语“试剂”指的是在主体或细胞上能产生预期生物学效应的实体。本技术领域已有许多治疗试剂并可以通过它们的效果识别出来。源于生物的治疗试剂例如包括生长因子、激素和细胞因子。本技术领域已有许多治疗试剂并可以通过它们的效果识别出来。例子包括小分子(例如药物)、抗体、多肽、蛋白(例如细胞因子、激素、可溶性受体和非特异性蛋白)、寡核苷酸(例如编码多肽的dna和rna、双链rna和反义rna)以及拟肽。
第九方面，本发明提供了一种预防或治疗脓毒症的药物组合物，所述药物组合物的活性成分是前面所述的促进核糖体自噬的物质。
除活性成分之外，本发明的药物组合物还包括可药用的载体。
本申请中使用的短语“可药用的”指那些符合明智的医疗判断、适合于与人类或动物组织接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症、具有合理的获益/风险比的试剂、化合物、材料、组合物和/或剂型。
本申请中使用的短语“可药用的载体”指的是药学上可接受的材料、组合物或赋形剂，例如液体或固体的充填剂、稀释液、赋形剂或者是溶剂封装材料，其参与运送或运输试剂从一器官或身体的一部分至另一器官或身体的另一部分。每一种载体都必须“可接受”，即能与制剂的其他组分相容并且不会对病人有害。可用作可药用载体的材料的例子包括:(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，例如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、蓖麻油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；c11)多元醇类，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲试剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格式溶液；(19)乙醇；(20)ph缓冲溶液；(21)聚酯类、聚糖酸酯和/或聚酸酐；以及(22)其他药学制剂中应用的无毒生物相容的物质。
附图说明
图1显示利用体内实验检测脓毒症状态下nufip-1表达情况的免疫印迹图；
图2显示利用体外实验检测lps刺激下nufip-1表达情况的免疫印迹图；
图3显示利用细胞系实验检测lps刺激下nufip-1表达情况的免疫印迹图；
图4显示利用体内实验检测nufip-1与lc-3b/lysotracker共定位情况的荧光图；
图5显示利用体外实验检测nufip-1与lc-3b/lysotracker共定位情况的荧光图；
图6显示利用细胞系实验检测nufip-1与lc-3b/lysotracker共定位情况的荧光图；
图7显示利用透射电镜观察脓毒症状态下自噬溶酶体及其内部核糖体数量变化的电镜图；
图8显示利用免疫印迹检测nufip-1表达变化对凋亡相关蛋白表达影响的结果图；
图9显示利用tunel法检测lps刺激对t细胞凋亡影响的统计图；
图10显示利用tunel法检测nufip-1表达对t细胞凋亡影响的统计图，其中，a：正常状态；b：脓毒症状态。
具体实施方式
检测技术(方法)
本发明的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于rna在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将rna逆转录成dna。
核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的dna的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些dna片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板dna进行测序。
核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ish)、微阵列和southern或northern印迹。原位杂交(ish)是一种使用标记的互补dna或rna链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ish)中的特异性dna或rna序列的杂交。dnaish可用于确定染色体的结构。rnaish用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mrna和其他转录本(例如，ncrna)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ish也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncrna)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，pcr)需要在扩增前将rna逆转录成dna(例如，rt-pcr)，而其他扩增技术则直接扩增rna(例如，tma和nasba)。
通常称为pcr的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；tma的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和ph的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个rna拷贝自身催化地生成另外的拷贝；lcr的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补dna寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为nasba的基于核酸序列的扩增；使用rna复制酶(通常称为qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。
本发明的蛋白通过抗原-抗体反应测量。更特别是，抗原-抗体反应可以根据本领域已知的定量或定性免疫测定方案进行。免疫测定形式可以包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(elisa)、放射性免疫测定(ria)、夹心测定、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、流式细胞术、荧光辅助的细胞分选(facs)、酶底物显色测定和抗原-抗体聚集。
载体
本发明的过表达载体可以是任何合适的过表达载体，并且可以被用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计以用于增殖和扩增或者用于表达或者用于这两种的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自：puc系列(fermentaslifesciences,glenburnie,md)、pbluescript系列(stratagene,lajolla,ca)、pet系列(novagen,madison,wi)、pgex系列(pharmaciabiotech,uppsala,sweden)以及pex系列(clontech,paloalto,ca)。也可使用诸如λgt10、λgt11、λzapii(stratagene)、λembl4和λnm1149的噬菌体载体。植物表达载体的实例包括pbi01、pbi101.2、pbi101.3、pbi121和pbin19(clontech)。动物表达载体的实例包括peuk-cl、pmam和pmamneo(clontech)。过表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体。在本发明的实施方案中，载体慢病毒载体。
在实施方案中，可以使用标准重组dna技术来制备本发明的过表达载体。可以将环状或线性表达载体的构建体制备为含有在原核或真核宿主细胞中发挥功能的复制系统。复制系统可以来源于，例如colel、2μ质粒、λ、sv40、牛乳头瘤病毒等。
过表达载体可以包含调控序列，如转录和翻译起始和终止密码子，视情况而定并且考虑载体是基于dna的还是基于rna的，其对于待引入载体的宿主细胞的类型(例如细菌、真菌、植物或动物)是特异的。过表达载体可以包含限制位点以促进克隆。
过表达载体可以包含允许对转化或转染的宿主细胞进行选择的一种或多种标志物基因。标志物基因包括抗微生物剂抗性(例如对抗生素、重金属等的抗性)，在营养缺陷型宿主中互补以提供原营养等。用于本发明的表达载体的合适的标志物基因包括，例如新霉素/g418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因以及氨苄西林抗性基因。
过表达载体可以包含与以下序列可操作地连接的天然或非天然的启动子：启动子的选择，例如强、弱、可诱导的、组织特异性的和发育特异性的，在本领域普通技术人员的能力内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在本领域普通技术人员的能力内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、rsv启动子或鼠干细胞病毒的长末端重复中存在的启动子。
可以将本发明的过表达载体设计为瞬时表达、稳定表达或者设计为这两种。另外，可以将过表达载体制备为组成型表达或诱导型表达。
药物组合物
本发明提供了包括促进核糖体自噬的物质(活性成分)的药物组合物。在一方面，本发明提供了可药用的组合物，所述组合物包括有效治疗量的活性成分与一种或多种药学上可接受的载体(添加物)和/或稀释剂配方。在另一方面，本方面的活性成分可以通过上述方式给予或与可药用载体的混合物一起给予，并可以与其他试剂联合给予。联合治疗包含连续的、同时的和分开或共同给予一种或多种本发明的活性成分，其中第一次给予的疗效在随后给予的物质给予前并不消失。
本发明的药物组合物可以特定配制以固体或液体形式给予，包括：(1)口服给药，例如，灌服剂(水或非水溶液或混悬剂)、片剂例如那些舌用的靶向用于含服、舌下和系统吸收的丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂；(2)非消化道给药，例如，皮下给药、肌肉注射、静脉注射或硬膜外注射例如灭菌溶液或混悬剂、或控释制剂；(3)局部涂药，例如皮肤用乳剂、软膏或控释贴片或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内给药，例如，阴道环、乳剂或泡沫；(5)舌下给药；(6)眼部给药；(7)经皮给药；(8)鼻腔给药。
用于口服给药的本发明的药物的液体制剂形式包括药学上可接受的乳剂、微乳、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分外，液体制剂还可以包含本技术领域中广泛使用的惰性稀释剂，举例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酷、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3一丁二醇、油类(特别是棉子油、花生油、玉米油、胚芽油和蓖麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和山梨聚糖脂肪酸酯，或它们的混合物。
除了稀释剂、口服组合物还可以包括佐剂如润湿剂、乳化和助悬剂、甜化剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除了活性成分外，混悬剂还可以包含助悬剂如环氧乙烷异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨醇酯、微晶纤维素、间羟基铝、皂粘土、琼脂和黄耆胶，和它们的混合物。
本发明用于口服给药的剂型可以是胶囊、扁胶囊、丸剂、片剂、锭剂(使用芳香基底，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄耆胶)、粉剂、颗粒剂或水或非水液体的溶液或混悬剂、或者是水包油或油包水的液体乳、或者是酏剂或糖浆剂、或者是锭剂(用惰性基底如明胶和甘油，或者是蔗糖和阿拉伯胶)和/或口洗剂等，每一种都包含一定量的本发明的活性成分。木发明的活性成分也可以用大丸、药糖剂或糊剂给药。
用于口服给药的本发明固体药物剂型中(胶囊、片剂、丸剂、锭剂、粉剂、颗粒剂等)，活性成分是与一种或多种药学上可接受的载体相混合，所述药学上可接受的载体如枸橼酸钠或磷酸二钙，和/或以下任何一种：(1)填充剂或增充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)润湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐类以及碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡油；(6)吸收促进剂，如季按化合物；(7)润湿剂，如十六醇、单硬脂酸甘油酷以及非离子型表面活性剂；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙烯二醇、十二烷基硫酸钠以及它们的混合物，以及(10)着色剂。
在胶囊剂、片剂和丸剂中，药物组合物还可以包含缓冲剂。类似的固体组合物可以在软壳和硬壳明胶胶囊中用作填充剂，所述固体组合物辅料如乳糖或牛乳糖，以及高分子量聚乙二醇等。
片剂可以可选地与一种或多种辅料通过挤压或模压来制备。普通挤压片剂可以通过粘合剂(例如，明胶或羟丙甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羧甲基淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模压片剂可以通过适当的机器模压已用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。
本发明药物组合物的片剂和其他固体剂型，如锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂可以压痕或包衣和包壳，如肠溶衣和其他药物制剂领域中已知的包衣。所述片剂和其他固体剂型同样也可以配方使所给予活性成分达到缓释或控释，例如，不同分量的羟丙甲基纤维素可以提供不同的释放速度，其他聚合物基质、脂质体和/或微球体。本发明的组合物可以配方以供速释，如冷冻干燥。它们可以通过例如过除菌膜或通过在无菌固体组合物中加入灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物中使用前即溶于无菌水或其他无菌注射用介质。这些组合物可选地还包含遮光剂并且可以是能释放活性组分的组合物，所述活性组分只在或更多的是在胃肠道的某一特定部位释放，起到缓释的作用。可用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡类。活性成分也可以制成微囊形式，可以适当的与一种或多种上述组分一同制剂。
本发明的药物组合物用于直肠或阴道给药的制剂可以是栓剂，所述栓剂可以通过将一种或多种本发明的活性成分与一种或多种适当的惰性辅料或载体例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯相混合来制备，所述栓剂蜡或水杨酸酯室温下为固体但体温下为液体，因此可以在直肠内或阴道内融化并释放活性化合物。
本发明中适用于阴道给药的剂型同样还包括含有本技术领域内适当药物载体的阴道环、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾剂。
本发明活性成分用于局部或透皮给药的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。活性化合物以无菌条件下与药学上可接受的载体相混合，任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂可以根据需要相混合。
除包含本发明的一种活性成分外，软膏剂、糊剂、乳剂和凝胶剂还可包含辅料如动物和植物脂肪、油类、蜡类、石蜡、淀粉、黄耆胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅酮类、皂粘土、硅酸、滑石粉和氧化锌或它们的混合物。
除包含本发明的活性成分外，粉末剂和喷雾剂还可包含辅料，如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。此外喷雾剂还可包含常用的抛射剂如氯代氟代烃类和挥发性未取代烃类例如丁烷和丙烷。
透皮贴剂具有使本发明的化合物定向递释至身体的优点。这种药物剂型可以通过使化合物溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收促进剂同样也可以用于增加化合物穿过皮肤的量。透皮的速度可以通过添加一层控释膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中并控制。
适用于非消化道给药的本发明的药物剂型由一种或多种本发明的活性成分与一种或多种可药用的无菌等渗水或非水的溶液、分散液、混悬液或乳剂组合组成，或与临用前重组为无菌注射溶液或混悬液的无菌粉末组合组成，所述无菌粉末可以包含糖类、醇类、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使溶液与受体血液等渗的溶质、助悬剂或增稠剂。
可用于本发明药物组合物的适当的水或非水载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙烯醇等)和它们适当的混合物，植物油例如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。流动性可以通过例如包衣材料如卵磷脂的使用、通过保持分散剂中必需的粒径以及使用表面活性剂来保持。
在一些情况下，为了延长药物效果，需要减缓从皮下或肌肉内注射的药物吸收的速度。可以通过使用结晶的液体或疏水的非晶形材料混悬液来实现。药物吸收的速度依赖于药物溶出度，溶出度反过来依赖于晶粒大小和结晶形式。此外，胃肠外给药的延迟吸收可以通过将药物溶解或混悬在油类运载体中来实现。
另外，本发明的药物组合物还可包括用于治疗脓毒症的其他药物。本发明的的活性成分与用于治疗脓毒症的其他药物可以制备成单独的制剂形成联合应用，也可两者制备成一种制剂形式以组合物的形式应用。
可用于本发明的脓毒症治疗药物主要包括抗感染药物(例如抗生物)和辅助治疗药物(例如缩血管药物、正性肌力药物、β受体阻滞剂)两类，治疗效果取决于感染类型及其严重程度。
提供以下说明以便于理解本发明。通常，应当理解，如果没有对术语进行其它限定，应当认为它们具有本领域通常接受的含义和意义。本文所用的术语仅用于描述具体的实施方案，而不用于限定本发明的范围，本发明的范围仅受到随附的权利要求的限定。
在本发明的实践中，使用了分子生物学中的许多常规技术。这些技术在以下文献中有详细描述，例如：molecularcloning:alaboratorymanual，第3版，j.f.sambrook和d.w.russell编著，coldspringharborlaboratory出版社，2001；以及dnamicroarrays:amolecularcloningmanual，d.bowtell和j.sambrook编著，coldspringharborlaboratory出版社，2002。
实施例1脓毒症状态下nufip-1与核糖体自噬的变化
一、体内实验
分别提取c57野生型和clp小鼠的脾脏t淋巴细胞，比较两组核糖体自噬发生情况，包括利用westernblot检测nufip-1、核糖体自身蛋白rpl-7和rpl-26的表达情况；利用激光共聚焦检测nufip-1与lc-3融合荧光；利用透射电镜观察核糖体形态学的改变，自噬小体的形成。
具体步骤：
1.小鼠基本信息
c57bl/6小鼠购自于北京华阜康生物科技有限公司，雄性，6-8周龄，体重为20±2g，符合无特定病原体(specificpathogenfree，spf)级标准，实验动物饲养室温度控制在25±2℃，湿度控制在40-60％，光照/黑暗周期为12h，自由进食和饮水。
2.脓毒症小鼠模型建立与鉴定步骤
盲肠结扎穿孔术(clp)是经典的构建实验性脓毒症动物模型的方法。
2.1.术前准备：术前禁食不禁饮12h；
2.2.麻醉：左手握持小鼠，大拇指与示指捏住小鼠头部皮肤，小拇指与无名指紧捏左下肢，暴露外侧皮肤，左手持1ml注射器于左侧下腹腔侧斜30度进针约0.5cm，0.5％水合氯醛200μl腹腔麻醉；
2.3.固定：待小鼠全身麻醉后，刺激后肢无反应，仰卧位固定于手术板上，双上肢压于橡皮条下，双下肢使用橡皮条捆扎后固定或者直接压在另一橡皮条下；
2.4.消毒：碘伏棉球消毒3遍，沿腹正中呈放射状消毒或者呈“z”状消毒。消毒范围约为手术切口外1cm；
2.5暴露：使用眼科弯镊提起腹正中线，剑突下约1cm处皮肤，眼科剪剪开约0.5cm开口，暴露腹膜，使用眼科弯镊提起腹膜，略微剪开，插入剪刀尖部扩开腹膜，暴露盲肠；
2.6结扎：使用3号线结扎1/2长度盲肠(自盲肠根部到末端为总长度)，保证肠管内容物不能回流为佳；
2.7穿孔：使用针头于结扎段盲肠1/2处自肠系膜血管侧贯穿盲肠一次，并且挤出少许肠内容物，防止穿孔闭合；
2.8缝合：将盲肠轻柔的还纳于腹腔中，使用眼科镊提起皮肤和腹膜逐层缝合；
2.9补液：术毕颈部皮下予0.9％生理盐水1ml抗休克治疗，术后自由进食水，保持室温恒定。
脓毒症小鼠模型的鉴定
术后症状的观察：clp术后小鼠出现明显嗜睡、竖毛、寒颤、腹泻和厌食等症状。一周死亡率的观察：clp术后小鼠24h死亡率为10-30％，72h死亡率为30-50％，一周死亡率为50-70％。
3.t淋巴细胞提取步骤
3.1小鼠脾脏的提取：小鼠断颈处死后右侧卧位固定，用酒精棉球消毒腹胸部位3遍，剪开腹部皮肤，留取脾脏，置于预冷的pbs中；
3.2单个核细胞的提取：将小鼠脾脏组织用活塞在钢网上研磨，用缓冲液洗平皿和滤网，收集细胞悬液，1200rpm离心5min后去上清，加入4mlpbs制成细胞悬液后，小心加入到4ml淋巴细胞分离液中(细胞悬液：分离液＝1：1)，3000rpm离心15min，可见中间层云雾状低密度细胞层，小心吸出后用pbs离心洗涤1次，计数细胞；
3.3磁珠孵育和磁性分选：采用minimacs免疫磁性分离系统进行t细胞分选；
3.3.1磁珠孵育
(1)完全弃上清，每107细胞在90μlpbs缓冲液中重悬；
(2)每107细胞加入10μlanti-micecd4 microbeads；
(3)混匀，4℃孵育10min。
3.3.2磁性分选
(1)将ls分选柱放入macs磁场中，1ml缓冲液小心润洗分选柱；
(2)加入500μl细胞悬液，让阴性细胞流出；
(3)用3ml缓冲液冲洗分选柱；
(4)将分选柱从磁场中拿出，放在干净离心管中，加入5ml缓冲液洗脱细胞；
(5)洗涤细胞后，计数获得的细胞数。
4.原代cd4 t淋巴细胞的培养
将分离纯化的cd4 t淋巴细胞以2x106/ml的比例在含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中进行体外培养，加入5μg/ml的刀豆蛋白a(cona)以促进原代cd4 t淋巴细胞的增殖，细胞孵箱培养条件为37℃，5％co2浓度。
5.westernblot步骤
5.1蛋白提取及定量
收集取各组细胞，pbs润洗2次，离心后移除上清，用滤纸吸干残余液体，分别提取t细胞中的胞浆蛋白和胞核蛋白：
(1)预估细胞体积，按照比例加入胞质提取液a(ceba)，添加蛋白酶抑制剂(1:50)和磷酸酶抑制剂(1:100)，冰上孵育20分钟，每5min涡旋10s；
(2)离心：4℃离心1000gx5min，沉淀中含有粗提的核蛋白；
(3)胞浆蛋白提取：将离心后的上清转移至新的ep管中，4℃离心12000gx5min，收集上清，上清即为胞浆蛋白提取物；
(4)将上述中的粗提核蛋白用100μlceba及5μlcebb重悬，涡旋10s，冰上孵育1min；
(5)离心：4℃离心1000gx5min，收集沉淀；
(6)100μlceba再次洗涤核沉淀1次，4℃离心1000gx5min；
(7)按比例加入胞核提取液(neb)，涡旋混匀；
(8)冰上孵育30min，每5min涡旋10s；
(9)胞核蛋白提取：4℃离心12000gx5min，收集上清，上清即为胞核蛋白提取物；
(10)取少量样本用于蛋白定量(约2.5μl)，其余-20℃暂存备用。采用bradford法对蛋白进行定量分析，配制反应体系后，37℃反应30分钟，用酶标仪测定样本562nm处吸光度值，用统计软件制作蛋白含量标准曲线，根据蛋白定量标准曲线计算各组样本的蛋白含量。
5.2电泳样本的处理
取待测样本，计算一定量蛋白所需的样本体积数，以蛋白提取液将体积补至24μl，再加入5xsds上样缓冲液6μl，终体积为30μl，95℃水浴5min，以备电泳。
5.3sds聚丙烯酰胺凝胶的配制
10％分离胶的配制：去离子水：4ml，30％丙烯酰胺：3.3ml，4x分离胶缓冲液：2.6ml，10％过硫酸胺：0.1ml，temed：4μl。4％积层胶的配制：4x积层胶缓冲液：1.25ml,去离子水：3.05ml，30％丙烯酰胺：0.67ml,10％过硫酸胺：50μl,temed：5μl。用1ml加样器从制胶槽(1.5mm厚)左上角缓慢加入(注意不要有气泡)，至梳子齿下缘约1cm处，以去离子水封顶，室温静置1h使其聚合。待分离胶聚合后，倾出去离子水，按上述方法灌入积层胶，插入梳子，室温静置30min使其聚合。
5.6加样及电泳
待积层胶聚合后，小心拔除梳子，将胶板安装至电泳槽上，加1xsds电泳缓冲液，内部缓冲液超过凝胶上缘，外部缓冲液达1/2高度即可。加入待测样本，将电泳槽与电泳仪相连接，设定电泳条件为恒压95v(50min)，待溴酚蓝前沿进入分离胶后，将电压调至125v，待溴酚蓝迁移至胶的下缘时(约需70min)停止电泳。取出胶板，去除积层胶，分离胶胶块去其marker侧上角示标记，浸入1xsds电泳缓冲液以备电转膜。
5.7电转移
准备转移膜(pvdf膜)，浸入甲醇中待用。按照滤纸、胶、pcdf膜及滤纸的顺序在阴极板上依次排好，盖上阳极压板，转移电流按0.8-3ma/cm2的比例，转膜时间约50min。
5.8封闭
将电转后的pcdf膜置于预先配制好的封闭液中(含10％脱脂牛奶的封闭洗涤液(tbs-t溶液))，室温孵育2h。
5.9抗体孵育及膜显影
靶蛋白特异性抗体(1:1000tbs-t溶液)与转移膜于4℃孵育过夜。tbs-t溶液洗膜3次，每次5min。转移膜与辣根过氧化酶偶联二抗溶液(1:5000tbs-t溶液)室温孵育1h。tbs-t洗膜3次后。采用ecl显影液于成像仪中进行显影、成像，imagelab软件对各条带的灰度值进行比较。
6.激光共聚焦显微镜观察nufip-1与自噬体和溶酶体共定位
(1)收集细胞，pbs离心洗涤3次，每次1500rpm离心5min；
(2)4％多聚甲醛室温固定1h；
(3)pbs离心洗涤3次，每次1500rpm离心5min；
(4)0.3％tritonx-100室温破膜20min；
(5)pbs洗涤3次，每次1500rpm离心5min；
(6)1％bsa溶液室温封闭1h；
(7)兔抗小鼠nufip-1一抗(1:200,1％bsa溶液)4℃孵育过夜；
(8)pbs洗涤3次，每次1500rpm离心5min；
(9)荧光偶联抗兔二抗(1:200,1％bsa溶液)室温孵育1h；
(10)pbs洗涤3次，每次1500rpm离心5min；
(11)加入lyso-tracker或者荧光直标lc-3b室温孵育1h；
(12)pbs洗涤3次，每次1500rpm离心5min，弃上清；
(13)100μlpbs溶液与细胞充分混匀；
(14)制片：准备载玻片，吸取40ul细胞悬液滴在载玻片上，吸取10ul的dapi溶液于细胞悬液中，盖上盖玻片；
(15)激光共聚焦显微镜下观察nufip-1与自噬体及溶酶体共定位的情况。
7.透射电镜观察核糖体自噬的形成
收集细胞样本，pbs缓冲液洗涤3次后，完全弃上清，2.5％戊二醛固定，经丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色后，采用透射电镜观察细胞内核糖体自噬的形成。
二、体外实验
野生型c57小鼠，提取脾脏t淋巴细胞，给予lps刺激，比较对照组和lps刺激组核糖体自噬发生情况，包括利用westernblot检测nufip-1、核糖体自身蛋白rpl-7和rpl-26的表达情况；利用激光共聚焦检测nufip-1与lc-3融合荧光；利用透射电镜观察核糖体形态学的改变，自噬小体的形成。
具体步骤：
1.lps溶液的配制：在无菌操作台中，将1mglps粉末用1ml的pbs充分混匀，得到浓度为1mg/ml的lps溶液，-20℃保存；
2.采用macs磁性分选系统分离纯化小鼠脾脏cd4 t细胞，进行体外培养，给予500ng/mllps刺激6h、12h、24h、48h、72h后收集细胞。通过westernblot检测核糖体自噬受体nufip-1和核糖体蛋白rpl-7、rpl-26的蛋白表达，初步明确lps刺激t细胞24h后核糖体自噬的活化最为明显。
3.进一步选取不同浓度lps刺激(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)t细胞24h，收集细胞，通过westernblot检测发现500ng/mllps刺激时t细胞核糖体自噬的活化最为明显，表明500ng/mllps刺激t细胞24h能有效启动细胞内核糖体自噬。
三、细胞系实验
人源jurkat细胞给予lps刺激，比较对照组和lps刺激组核糖体自噬发生情况。
具体步骤：
本实验选用的jurkat细胞系购自于中国ctcc公司，将jurkat细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基(含青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml及l-glutamine)重悬后，置于37℃、5％co2孵箱中进行体外培养。lps刺激jurkat细胞量效和时效实验同体外实验，收集刺激后jurkat细胞后，采用westernblot检测核糖体自噬受体nufip-1和核糖体蛋白rpl-7、rpl-26的蛋白表达，观察发现500ng/mllps刺激人jurkat细胞24h能有效启动细胞内核糖体自噬。
四、实验结果
(1)westernblot结果
脓毒症状态下nufip-1、p62、beclin-1明显上调，核糖体自身蛋白rpl-7、rpl-26显著下降(图1-图3)，图1和图3中c6、c24、c72表示clp造模后6h、24h、72h；图3中l6、l24、l72表示lps刺激后6h、24h、72h。
(2)激光共聚焦结果
脓毒症状态下，可以明显观察到nufip-1从胞核向胞浆的穿梭过程，并且nufip-1与溶酶体表面标志物lysotracker、nufip-1与lc-3b的共定位明显强于对照组(图4-图6)。
(3)透射电镜结果
在电镜放大100000倍视野下可以观察到：脓毒症状态下，自噬溶酶体的形成明显增加，且自噬溶酶体内有大量核糖体的聚集(图7)。
综上，通过体内、体外、细胞系实验发现：体内clp组相比于假伤组(sham)，体外、细胞系lps刺激组相比于空白对照组(con)，nufip-1介导的核糖体自噬明显上调。上述结果表明，脓毒症状态下，nufip-1介导的核糖体自噬明显上调。体内clp模拟脓毒症环境、体外lps刺激可以诱导nufip-1介导的核糖体自噬。
实施例2脓毒症状态下核糖体自噬对t细胞功能的影响
通过悬浮细胞专用慢病毒在rna水平干扰和过表达jurkat细胞中nufip-1基因，分别观察在nufip-1正常表达、干扰表达和过表达情况下jurkat细胞的凋亡情况。通过tunel法测t细胞凋亡、westernblot检测凋亡相关蛋白(caspase-3，bax，bcl-2)比较不同组间t细胞凋亡的情况，具体如下。
1、慢病毒转染
具体步骤：
1.1干扰慢病毒和过表达慢病毒构建
(1)载体酶切：按照固定比例和顺序配制酶切体系，轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带；
(2)目的基因片段的获取：通过genbank搜索目的基因的序列，通过病毒载体构建框架，合成单链引物，引物退火后形成双链dna；
(3)退火引物与载体进行连接：通过t4dnaligase将双酶切线性化的载体和退火双链dna连接，16℃连接1-3h；
(4)转化：将10μl交换反应产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μllb培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h；
(5)菌落pcr鉴定：配制反应体系，震荡混匀，短暂离心。在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μl鉴定体系中，吹打混匀，置于pcr仪中进行反应；
(6)测序：将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素lb液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序，对测序结果与目的基因序列进行比对分析；
(7)质粒抽提：将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的lb液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒；
(8)质粒转染和慢病毒收获：转染前48h，用胰蛋白酶消化对数生长期的hek293t细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5x106细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养。48h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；转染前1h更换为含2％血清培养基；向一灭菌离心管中加入所制备的各dna溶液(gv/cv载体质粒20μg、phelper1.0载体质粒15μg、phelper2.0载体质粒10μg)，与相应体积的转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml的转染体系，在室温下温育15min；转染体系缓慢滴加至hek293t细胞的培养液中，混匀，在37℃、含5％co2细胞培养箱中培养；培养6h-8h后弃去含有转染体系混和物的培养基，加入10ml的pbs液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含2％血清的细胞培养基12ml，于37℃、含5％co2培养箱内培养48h；
(9)慢病毒浓缩与纯化：根据细胞状态，收集转染后48h的hek293t细胞上清液，于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片及杂质；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至beckman超速离心机内,于4℃,25000rpm离心2h后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒对应体积保存液，轻轻反复吹打沉淀进行重悬操作。沉淀经充分溶解后，10000rpm离心5min，取上清按要求分装，准备样品待检测；
(10)慢病毒质量检测：慢病毒的质量控制要点包括物理状态检测、安全性检测及病毒滴度检测。通过荧光法测定滴度和滴度分析，最后得出我们构建的干扰慢病毒滴度分别是：212病毒＝1x109tu/ml；213病毒＝8x108tu/ml；214病毒＝1x109tu/ml；过表达病毒滴度＝4x108tu/ml。
1.2慢病毒转染
(1)接种细胞：用完全培养基制备1x105个/ml的细胞悬液，接种在96孔板中，每孔接种体积是200μl，加入hitransb-2感染增强液8μl；
(2)感染细胞：根据预实验结果，悬浮细胞专用慢病毒在感染指数(moi)＝30即可达到较好的感染效果，因此正式实验时，根据moi为30计算所需病毒体积(病毒体积＝moix细胞数目/病毒滴度)加入到细胞中并混匀，在37℃细胞孵箱中培养12-16h；
(3)感染后换液：将各孔中细胞收集到干净的1.5mlep管中，1800rpm离心5min，去掉上清液，更换为完全培养基，轻轻混匀后放回培养板中继续培养；
(4)荧光显微镜观察感染效率及细胞生长状态，适时进行细胞换液，保持细胞活性，感染约72h后，流式细胞术检测感染效率，待细胞长至所需数量后进行后续实验。
1.3干扰慢病毒和过表达慢病毒的验证
为了验证干扰慢病毒和过表达慢病毒的效果，采用westernblots验证干扰或过表达慢病毒转染后nufip1的表达情况，观察发现：与空载体病毒比较，干扰慢病毒组nufip1的表达明显降低，而过表达组nufip1表达较空载体病毒组显著升高。
2、westernblot检测
具体步骤：同实施例1。
3、tunel法检测
通过碧云天tunel一步法凋亡检测试剂盒检测nufip-1正常表达组、干扰表达组和过表达组的凋亡情况发现，具体步骤参见产品说明书。
3、实验结果
(1)westernblot
与对照组相比，当nufip-1过表达时，核糖体自噬明显增强，jurkat细胞内的凋亡执行蛋白caspase-3剪切体明显下降，凋亡抑制蛋白bcl-2和bax则明显增加。说明nufip-1介导的核糖体自噬可以有效缓解jurkat细胞的凋亡(图8)。
(2)tunel法
与非lps刺激组相比，lps刺激组t细胞凋亡水平明显上调，表明脓毒症状态下t细胞凋亡增加(图9)
lps刺激条件下，与干扰阴性组(阴1)相比，nufip-1干扰表达组(212组)凋亡水平明显上调；与过表达阴性对照组(阴2)相比，nufip-1过表达组凋亡水平有一定程度的下降(图10)。
上述结果表明，nufip-1介导的核糖体自噬可以有效缓解jurkat细胞的凋亡，有望成为脓毒症治疗的一个新的靶点。
1.促进核糖体自噬的物质的应用，其特征在于，所述应用包括以下任一项所述的应用：
(1)在制备抑制t细胞凋亡的药物中的应用。
(2)在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
优选地，所述物质包括促进核糖体自噬的试剂、促进核糖体自噬的分子。
更优选地，促进核糖体自噬的分子是nufip-1。
2.一种促进核糖体自噬的试剂，其特征在于，所述试剂包括促进nufip-1的试剂；优选地，促进nufip-1的试剂包括促进nufip-1基因表达的试剂，促进nufip-1基因表达产物活性的试剂；更优选地，促进nufip-1基因表达的试剂包括nufip-1基因过表达载体。
3.一种抑制t细胞凋亡的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的促进核糖体自噬的物质。
4.一种预防或治疗脓毒症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的促进核糖体自噬的物质。
5.nufip-1在制备促进核糖体自噬的试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂包括权利要求2所述的试剂。
7.一种促进核糖体自噬的方法，其特征在于，所述方法包括施用促进nufip-1的试剂。
8.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述试剂包括权利要求4-6中任一项所述的试剂。
9.一种抑制t细胞凋亡的方法，其特征在于，所述方法包括施用促进核糖体自噬的物质。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述促进核糖体自噬的物质包括权利要求1所述的促进核糖体自噬的物质。
技术总结