本发明涉及一种丹参酮ⅱa与mir-29b抑制剂联合在制备治疗肌腱粘连的药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
肌腱粘连是指肌腱损伤修复过程中由于周围组织的增生和侵入造成的肌腱运动功能障碍。外伤术后肌腱粘连是肌腱损伤后常见问题之一，由于粘连发生的普遍性和肌腱愈合需要足够的强度才能进行早期功能锻炼的矛盾因素，故迄今为止仍无有效的解决方法。肌腱粘连发生的原因可能为机械性和化学性损伤。损伤后诱发间质细胞和肥大细胞释放多种活性物质,包括凝血酶、组胺、肝素及其它血管活性物质,使组织产生炎性反应,毛细血管通透性增加,大量浆液渗出。这些渗出物如不能被分解吸收,则会使纤维蛋白积聚,继而发生纤维细胞浸润和新生毛细血管的长入,最终形成粘连。从肌腱愈合的角度来看，目前认为肌腱愈合由内、外两种修复机制完成。内源性修复机制通过肌腱细胞增生修复损伤肌腱，而外源性修复机制通过腱周组织增生,成纤维细胞增生和炎症细胞的增生修复损伤肌腱，所以肌腱自身强度主要取决于内源性修复机制，而外源性修复则主要形成粘连。所以理想的肌腱修复模式是在肌腱断端提前启动内源性机制，使肌腱愈合具备足够强度，再在腱周组织通过抑制外源性机制来防治粘连。
目前发现与肌腱损伤修复过程有关的主要细胞因子包括：转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β，tgf-β)、骨形态发生蛋白12(bonemorphogeneticprotein-12，bmp-12)、胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor-ⅰ，igf-1)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)，血小板源性生长因子(plateledderivedgrowthfactor，pdgf)等。其中tgf-β1/smad3是创伤修复过程中较为常见的重要信号通路，是组织发生病理性纤维化的因素之一。朴英杰等针对tgf-β1对人胚腱细胞的剂量效应和时间效应以及tgf-β1对细胞周期及增殖指数的影响进行观察，结果发现tgf-β1可刺激腱细胞dna合成，且指出tgf-β1可能通过促进腱细胞增殖参与肌腱的修复。beredjiklian等通过对羊胚胎肌腱损伤模型研究发现，胚胎肌腱损伤后是无瘢痕愈合，而胚胎环境中tgf-β1及其mrna含量明显低于成年组织，这提示胚胎的无瘢痕愈合机制可能就是这种低浓度的tgf-β1环境造成的。malmstrom等研究发现tgf-β1通过促使成纤维细胞和巨噬细胞的募集、血管的生成、刺激胶原的产生、下调基质金属蛋白酶的活性和增加基质金属蛋白酶抑制剂的活性而发挥作用，是一个在急性炎症及伤口愈合中起重要作用的细胞因子，它的过分表达可导致过度瘢痕增生和纤维化。
丹参酮ⅱa为唇形科鼠尾草属植物丹参(salviamiltiorrhizabunge)的有效成份，具有抗菌、消炎、扩张血管、抗血小板凝集等作用。刘成海等以tgf-β1刺激的体外原代培养大鼠hsc活化，同时以丹参酸作用，结果发现丹参酸抑制细胞胶原分泌、α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-sma)与纤维蛋白酶原激活物抑制因子的蛋白表达，并且抑制细胞质与细胞核内smad2、3的蛋白表达，说明丹参酸抗肝纤维化、抑制hsc活化的机制在于抑制tgfβ1在hsc的信号转导。对小鼠的肝纤维化实验中也发现丹参酮ⅱa通过抑制tgf-β1/smad3信号通路促进细胞ⅰ型胶原mrna表达，降低肝组织igfbp7的表达，从而发挥其抗肝纤维化作用。孙兴旺等证实丹参酮ⅱa通过调控tgf-β1/smad和nf-κb通路来减少肾5/6切除的大鼠肾脏纤维化。同时丹参酮iia磺酸钠通过抑制tgf-β/smad通路激活而改善部分膀胱出口阻塞的大鼠模型中的膀胱纤维化。
中医药学是中华民族灿烂文化的重要组成部分，也是目前我国在世界上最有影响的学科领域之一。中医“治未病”的理念由来已久，《黄帝内经·素问》第一篇《四气调神大论》中“圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱……夫病已成而后药之，乱已成而后治之，譬犹渴而穿井，斗而铸锥，不亦晚乎”的论述，开创了中医对这一领域的独特认识和精辟见解。“瘀在痹初”理论指导治疗早期肌腱粘连，即属于“治未病”的“既病防变”方面。符合向“预防转化治疗”策略。利用药物对疾病前期或高危人群进行预防自然成为国际循证医学的热点。这是全球医疗卫生行业的发展趋势。因此早期肌腱粘连的干预是患者的需要，也是卫生事业发展的需要。
肌腱粘连是肌腱损伤后常见的并发症，其防治一直是科学界普遍关注的问题。如何使肌腱在损伤或修复后少发生或不发生粘连，尽快恢复其滑动功能，同时又不影响肌腱本身的愈合是现有的技术难题，目前仍没有有效的药物及方法能彻底解决肌腱粘连的问题。局部注射中医药具有整体动态调整和个体化治疗的优势，同时西药精确而快速的治疗效果，也是患者良好依从性的保障。因此采用中医药联合基因治疗早期预防肌腱粘连是目前临床急需的。顺应国家、社会和个人的需求，给患者带来切实的利益，可给国家、社会、家庭及个人带来远大的经济效益及社会效益。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种丹参酮ⅱa与mir-29b抑制剂联合在制备治疗肌腱粘连的药物中的应用，以解决现有技术中的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种丹参酮ⅱa与mir-29b抑制剂联合在制备治疗肌腱粘连的药物中的应用。
作为优选，所述的应用是在mir-29b抑制剂之后使用丹参酮ⅱa。
作为优选，所述的应用是在mir-29b抑制剂之后0-72h使用丹参酮ⅱa。最佳方案是，所述的应用是在mir-29b抑制剂之后4-8h使用丹参酮ⅱa。
一种治疗肌腱粘连的药物，该药物包含丹参酮ⅱa与mir-29b抑制剂。最佳方案是，所述药物的给药方式为注射。
mirna是一种短链的非编码rna，参与了基因的翻译抑制以及mrna的降解过程，在代谢、细胞增殖、分化、细胞凋亡以及发育中具有重要的作用。对肝纤维化患者的研究发现，在肝纤维化的早期和晚期，mirna-16，mirna-146a，mirna-221和mirna-222的血清水平均显着上调。刘等在博来霉素诱导的纤维化小鼠的肺部以及ipf患者的肺部中发现其mir-21显著上调，增加的mir-21水平通过促进了tgf-β1在成纤维细胞中的促成纤维活性，从而导致了肺纤维化的发生。而mirna-29水平的降低也被发现与包括心脏，肝脏，肾脏和皮肤以及ssc在内的多个器官的纤维化有关，这表明它可能是核心的“fibromirna”。在人胎肺成纤维细胞imr-90细胞中敲除mir-29后发现，许多由tgf-β1上调的纤维化相关基因表达显著降低，胶原蛋白受抑制，证实了mir-29对肺纤维过程中重要通路tgfβ1的影响。在糖尿病大鼠体内，mir-29b可通过负调节tgf-β1/smad3介导的纤维化和抑制sp1/nf-κb驱动的炎症反应，从而抑制糖尿病肾病的发生。本课题组在对大鼠跟腱细胞的研究中发现，mir-29b抑制剂可逆转壳聚糖引起mir-29b、tgf-β1、smad3和p21表达的改变。
考虑到丹参酮ⅱa及mir-29b对组织纤维化的调控作用均可通过tgf-β1/smad3途径实现，因此本发明创新的采用丹参酮ⅱa和mir-29b抑制剂的联用，即结合中医药和基因治疗手段，以实现肌腱粘连的临床治疗，并且制备治疗肌腱粘连方面的药物。
本发明通过分子细胞及生物多层面验证丹参酮ⅱa(tsa)联合mir-29b抑制剂对肌腱损伤后粘连形成的抑制作用。所有数据用平均值±标准差表示。三组及三组以上的比较采用anova分析，两组之间的比较采用student’st-test方法，所有分析均使用spss17.0软件完成。p<0.05认为在统计学上有显著性差异。
本发明首先通过体外实验确定tsa的最佳大鼠体内应用浓度0.1μm，并在原代大鼠成纤维细胞中进行阴性对照、tsa、mir-29b干扰腺病毒及tsa和mir-29b干扰腺病毒共同干预，观察细胞增殖和蛋白表达情况。结果显示，治疗组与对照之间、治疗组之间各结果均有统计学差异(p<0.05)。从炎症因子表达来看，tsa治疗降低了tgf-β1和samd3水平的表达，mir-29抑制剂显著上调了tgf-β1和smad3的表达，两者联合应用时tgf-β1和samd3的表达水平显著高于仅使用tsa处理的细胞，但与使用mir-29b抑制剂处理的细胞相比显著减弱。这表明tsa和mir-29b抑制剂均以同一条途径为靶点，这意味着两者的结合可以触发内源性途径，并操纵外源性途径的靶向晚期。cck-8分析和荧光活化细胞分选(facs)分析表明，用mir-29b抑制剂处理的细胞显著增加了细胞增殖，而tsa处理的细胞显著降低了细胞增殖，当tsa和mir-29b抑制剂同时作用于细胞时，细胞增殖能力显著低于mir-29b抑制剂，但高于tsa处理的细胞，在细胞凋亡分析中观察到同样的趋势。
进一步的，本发明进行的体内实验研究首先将所有大鼠随机分为6组，1组为假手术组不做肌腱损伤处理，其余5组大鼠在制作跟腱损伤大鼠模型后，于跟腱损伤处标记定位，随机分为mir-29b抑制组(治疗组)4组、阴性对照注射组(对照组)1组，每3天于标记处进行一次mir-29b干扰腺病毒或者空病毒体内转染注射。治疗组的4组分别于术后即刻、术后6小时、术后24小时、术后72小时于跟腱标记处注射丹参酮ⅱa注射液0.5ml，每次注射持续1周。对大鼠进行一般行为学观察，3周后处死。取跟腱损伤区组织行大体观察、组织病理分析及生物力学测定。细胞层面结果表明tsa和mir-29b抑制剂联合治疗能显著减少凋亡细胞的数量，且mir-29b抑制剂联合术后6小时注射tsa的凋亡细胞水平最接近于未处理组。分子层面上，治疗组的tfg-β和smad3水平均显著低于对照组，但仍高于未处理组；同时，与对照组相比，治疗组的ⅰ型胶原水平和cyclind显著增加，但组内无显著差异。组织学观察中，在经mir-29b抑制剂和tsa治疗的组中，胶原纤维和成纤维细胞数量增加且排列良好，对照组胶原纤维及成纤维细胞数量明显增加，排列不规则。大体研究表明治疗组比对照组跟腱粘连少，且所有治疗条件下的肌腱最大负荷均高于对照组，p<0.05，有统计学差异。且所有治疗条件下的肌腱最大负荷均高于对照组。
本发明的试验结果表明，在肌腱断端使用mir-29b抑制剂可以激活tgf-β1/smad3途径，启动内源性修复机制，随后使用tsa能够阻碍tgf-β1/smad3途径，抑制外源性修复机制。因此，两种治疗手段的结合可以防止肌腱粘连，保证肌腱的强度。丹参酮ⅱa与mir-29b抑制剂联合可以制备治疗肌腱粘连的药物，从而给临床防治肌腱粘连带来新的思路。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为mir-29b干扰腺病毒和tsa作用下mir-29b、tgf-β1和smad的动态变化图，其中，a：mtt法测定tsa的细胞毒性，b：qpcr检测mir-29的表达，c：在不同条件下测定tgf-β1mrna和蛋白表达水平，d：在不同条件下，用qpcr(n＝3)检测smadmrna的表达，westernblotting检测蛋白表达水平(n＝1)；
图2为mir-29b干扰腺病毒和tsa治疗对细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响图，a：用cck8kit检测细胞增殖,b：facs检测细胞凋亡,c：不同条件下原代分离细胞的细胞周期分析；
图3为建立大鼠跟腱损伤模型后，药物作用对mir-29b表达及细胞凋亡的影响图，其中，a：qpcr定量mir-29b的表达，b：tunel法检测凋亡细胞的频率；
图4为mir-29b抑制剂和tsa处理对tgf-β1、p21和smad3表达的影响图，a：qpcr法检测tgf-β1mrna表达，n＝3；b：qpcr法检测p21mrna表达，n＝3；c：qpcr检测samd3mrna表达；
图5是肌腱组织胶原表达及组织学变化分析图，其中，a：各组ⅰ型胶原的产生，b：各组大鼠肌腱组织ⅲ型胶原的产生，c：苏木精伊红染色(he染色)和masson染色(x200)，d：cyclind的表达；
图6是肌腱强度分析图，其中，a：最大负荷的生物力学分析，b：内膜周围粘连的评价；
图2至图6中，n＝3，p值*<0.05，**<0.01，***<0.005，****<0.001。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。
以下实施例中：mir-29b、aav-293细胞、mir-29b干扰腺病毒、mir-29b抑制剂均由广州锐博生物科技有限公司提供。
本发明的核心是提供一种丹参酮ⅱa与mir-29b抑制剂联合在制备治疗肌腱粘连的药物中的应用，称其为具体实施方式一，该方法包括以下步骤：
实施例1
一、mir-29b干扰腺病毒定制
使用mirnasponge海绵吸附结构构建mir-29b干扰重组质粒，同包装质粒phelper和paav-rc共转染aav-293细胞；转染3天后，裂解细胞收集aav病毒颗粒；离心、超滤浓缩并纯化病毒上清液；用荧光定量pcr法测定病毒滴度，分装保存mir-29b干扰腺病毒(mir-29bshrna腺病毒)和空载腺病毒(mir-29bnc腺病毒)总量各1^10^11pfu。
二、大鼠跟腱损伤模型制作
实验动物：sd大鼠，雄性，350g左右，spf级，由浙江大学医学院实验动物中心提供。
大鼠跟腱损伤模型制作：腹腔注射氟烷(50mg/kg)。右后肢上止血带，足跟纵切口，打开跟腱鞘管，挑出跟腱横行切断，用5-0ti-cron不可吸收缝线(covidien,langhorne,pa,usa)；改良kessler法缝合跟腱，腱鞘和皮肤闭合用5-0surgipro滑线(covidien,langhorne,pa,usa)直接缝合。造模型后，于跟腱损伤处带线或标记，方便给药定位，大鼠后肢夹板固定。
三、原代大鼠成纤维细胞的分离和培养
取造模后的sd大鼠跟腱损伤部位肌腱，以经氨苄青霉素-硫酸链霉素-pbs漂洗三遍后去除腱周组织，充分剪碎肌腱按1：1体积比投入0.25％胰酶-200u/ml胶原酶iv的dmem培养基中，37℃消化作用2小时。1200rpm离心10分钟，取沉淀以无血清dmem洗涤、离心2次后，以含10％胎牛血清dmem培养基重悬，加入培养皿，在37℃，5％co2的环境下贴壁2小时后去除原有培养基，分离出成纤维细胞，行常规培养及传代。所分离细胞采用常规he染色镜检及免疫细胞化学染色检测col1、col3表达鉴定是否为成纤维细胞。
实施例2tsa和mir-29b抑制剂对大鼠成纤维细胞的作用
1、mtt(单核细胞直接细胞毒性测定)筛选最适合的丹参酮浓度
取实施例1中处于对数生长期、生长状态良好的大鼠成纤维细胞消化并制成单细胞悬浮液，以2000个/孔的密度，接种于96孔板中，加培养液至终体积100μl，设立1个空白对照组，6个不同浓度tsa处理组(0.001um，0.01um，0.1um，1um，10um，20um)，每组设置5个复孔，于37℃，5％co2的环境下培养，细胞贴壁后继续培养24h，加入20μl5mg/ml的mtt后继续培养4h。弃去含mtt的培养基，加入150μldmso再孵育30min，用多功能酶标仪检测于490nm波长的吸光值。吸光值反映细胞活力强弱。试验结果见图1a，结果表明，1μm的tsa显著降低了细胞的存活率，因此，本发明人在本研究中使用0.1μmtsa。
以下试验取实施例1中处于对数生长期、生长状态良好的大鼠成纤维细胞消化并制成单细胞悬浮液，以2000个/孔的密度，接种于96孔板中，加培养液至终体积100μl，设立2个阴性对照组，分别为1个空白对照组和1个mir-29bnc腺病毒转染组；及4个治疗组，分别为mir-29b干扰腺病毒转染组、0.1μmtsa治疗组、mir-29bnc腺病毒 0.1μmtsa治疗组、mir-29b干扰腺病毒 0.1μmtsa治疗组，每组设置5个复孔，于37℃，5％co2的环境下培养，细胞贴壁后继续培养24h。
2、cck8检测细胞增殖：胰酶消化、收集对数生长期细胞，按照1×105cell/ml密度重悬细胞，在96孔板中进行铺板，每孔加入10μlcck8后，37℃培养4h，酶标仪测定各孔吸光值od450检测细胞增殖水平。实验结果见图2a，
由图2a可知，与阴性对照组对比，用mir-29b干扰腺病毒处理的细胞显著增加了细胞增殖，而tsa处理的细胞显著降低了细胞增殖，而当tsa和mir-29b抑制剂同时作用于细胞时，本发明人发现与mir-29b抑制剂相比，细胞增殖能力显著降低，并且高于tsa处理的细胞。
3、流式细胞仪检测细胞周期：用不同浓度的tsa培养细胞24小时，然后用碘化丙啶染色，流式细胞仪检测dna含量。
取对数生长期各分组细胞,然后在预冷的100％甲醇中固定和透化。室温下添加碘化丙啶(50μg/ml)和rnasea(125μg/ml)，共孵育45分钟进行染色，200目尼龙网膜过滤细胞后使用流式细胞仪facscalibur(bectondickinson公司)分析细胞周期(试验结果见图2c)。
收集分离培养的成纤维细胞，胰蛋白酶消化后，用预冷的pbs洗涤，重悬于100μlbindingbuffer。然后添加2μlannexinv-fitc和5μlpi到细胞中避光室温下孵育15分钟。再添加400μlbindingbuffer后上机反应。软件分析细胞凋亡率(试验结果见图2b)。
上述实验结果显示，tsa处理的细胞在g1期的细胞比例较高，而tsa诱导的细胞凋亡率高于对照细胞。此外，与mir-29b干扰腺病毒治疗组相比，tsa治疗组g2期和s期的细胞比例随之降低。同时，当tsa和mir-29b干扰腺病毒同时作用于细胞时，本发明人还观察到细胞凋亡明显减少，g1期细胞比例略高于单纯tsa，而mir-29b抑制剂则相反。
综上所述，结果表明mir-29b能够促进细胞增殖，tsa可以降低这些作用。
4、qpcr检测tgf-β1，smad3，mir-29b的含量变化：取对数生长期各分组细胞,以0.25％胰酶消化，溶液1200rpm离心10分钟及pbs洗涤、离心2次后细胞用trizol法提取总rna，紫外分光光度法测定总rna浓度，采用表1所述的引物序列(下同)及实时荧光pcr试剂盒(takara)检测tgf-β1、smad3、mir-29b，采用2-△△ct方法计算基因表达的相对比值，以u6作为内参基因。试验结果见图1b、c(左)、d(左)。
表1qpcr检测所用引物
mircorna反义链通用引物：rprimer：ccagtgcagggtccgaggtatt(seqidno.11)。
由图1b数据可知，本发明人观察到mir-29b干扰腺病毒的应用明显降低成纤维细胞mir-29b的表达，tsa处理显著增强mir-29b的表达，用tsa和mir-29b干扰腺病毒同时处理细胞抵消了处理的效果，表明在双重处理的样品中mir-29b没有显著变化。而由图1c、d数据可知tgf-β1和smad在mrna和蛋白水平上表达的动态变化相同。
5、westernblot(wb)检测tgf-β1,p-smad3，smad3：常规提取各处理组细胞的全蛋白，12000rpm,4℃离心15min，取上清采用bca试剂盒对提取的蛋白质进行浓度测定，每个样本取30μg的总蛋白进行10％sds-page胶电泳分离，湿法蛋白质转至0.22微米孔径pvdf膜上，将膜与相应一抗在4℃共孵育过夜，再与hrp标记的二抗(1:2000)于室温下孵育90min。用ez-ecl化学发光检测试剂盒进行显影，检测组织中细胞p21、tgf-β1、smad3、p-smad3含量。quantityone软件进行条带灰度分析。β-actin作为内参蛋白。试验结果见图1c(右)、d(右)。
由图1c(右)、d(右)数据可知，本发明人发现tsa治疗降低了tgf-β1和samd3水平的表达。相反，mir-29干扰腺病毒组显著上调了tgf-β1和smad3的表达。当同时使用tsa和mir-29干扰腺病毒处理细胞时，tgf-β1和samd3的表达水平显著高于仅使用tsa处理的细胞，但与使用mir-29b干扰腺病毒处理的细胞相比显著减弱。
该结果显示tsa和mir-29b抑制剂均以同一条途径为靶点，这意味着两者的结合可以触发内源性途径，并操纵外源性途径的靶向晚期。
实施例3tsa和mir-29b抑制剂对大鼠跟腱粘连的防治作用
取实施例1造模后的sd大鼠45只，随机分为6组，每组5只，1组为假手术组不做肌腱损伤处理，其余5组大鼠随机分为4组为mir-29b抑制组(治疗组)、1组为阴性对照注射组(对照组)两大组，每3天于标记处进行一次mir-29b干扰腺病毒或者空病毒体内转染注射(10^9pfu/只/次)。治疗组4组大鼠分别于术后即刻、术后6小时、术后24小时、术后72小时于跟腱标记处注射tsa注射液0.5ml，每次注射持续1周。3周后处死。
1、一般观察：对大鼠的精神状态、活动度、皮毛、体重、跟腱创面愈合情况等进行动态观测。所有大鼠均存活，创口一期愈合，无感染及后肢废用等情况发生。
2、大体观察：sd大鼠处死后切开术区皮肤及皮下组织，分别暴露肌腱缝合处组织、腱鞘及肌腱，观察肌腱断端的炎性反应，肉芽增生及肌腱愈合及粘连情况。评分标准为：ⅰ级，肌腱周围无粘连；ⅱ级，肌腱缝合处有少量局限性，薄膜样粘连，肌腱滑动稍受限；ⅲ级，小块带状疏松粘连，和肌腱表面易分离，肌腱滑动部分受限；ⅳ级，较大面积的中等致密粘连，有一定移动性，肌腱滑动明显受限；ⅴ级，大面积的致密粘连，肌腱与鞘管、皮下广泛粘连，滑动性极差。肌腱愈合情况以ⅰ级、ⅱ级为优，ⅲ级为良，ⅳ级、ⅴ级为差。试验结果见图6b，结果证明各治疗组肌腱愈合情况均优于对照组。
3、生物力学测定：处死大鼠后，解剖分离出跟腱及跟腱连接的跟骨，注意将腱周粘连组织清除干净，防止影响实验结果。施加预负荷1n，调整跟腱张力后归零。将最大距离定为6.50mm，分别以0.05mm/s(生物力学慢拉实验)和1mm/s(生物力学快拉实验)的速度拉伸跟腱至断裂。通过wintest力学测试软件读取极限载荷及跟腱的实际拉伸长度，计算其韧度＝负荷/应变(n/mm)，观察其断裂部位，记录肌腱原长、应变比例、最大负荷、最大应变。试验结果见图6a。
由图6a数据可知，结果表明，所有治疗条件下的最大负荷均高于对照组，虽仍低于未处理组，肌腱无法完全愈合，但仍提示早期诱导内源性修复机制可提高肌腱强度，减少肌腱粘连。
4、组织学观察：取各组大鼠受处理肌腱组织以4％多聚甲醛浸泡固定，脱钙处理后脱水，石蜡包埋、切片备用。苏木精伊红染色(he染色)和masson三色染色(x200)行组织学观察,光镜下分析：成纤维细胞，胶原纤维，炎性细胞。试验结果见图5c，由图5c数据可知，在所有组中，本发明人观察到与未经治疗的对照组相比，修复部位的成纤维细胞和胶原组织增生且排列良好。
图3为建立大鼠模型，按图3所示1～6组不同条件处理。治疗3周后处死大鼠。tunnel染色检测细胞凋亡率，荧光显微镜下结果(图3b)显示，tsa和mir-29b抑制剂联合治疗能显著减少凋亡细胞的数量。
值得注意的是，本发明人观察到先用mir-29b抑制剂治疗并6小时后用tsa治疗的大鼠相比，其他治疗组的凋亡细胞水平略低，而与未处理组相比相近，表明不同的治疗时间点可以产生不同的治疗效果。
5、分子生物学观察：qpcr检测mir-29b抑制剂在大鼠模型中的作用，结果表明(图3a)，与未处理组相比，所有抑制剂治疗均显著抑制mir-29brna的表达。
qpcr及wb检测tgf-β1、p21和smad3的表达水平，结果表明(图4)tgf-β1、p21和smad3在mrna和蛋白质水平上表达一致，治疗组显著降低了其表达，但仍然高于健康对照组，这表明该治疗可能无法完全愈合肌腱，需要进一步详细研究。
免疫组化法检测肌腱组织胶原表达，图5a、b、d是肌腱组织胶原表达及组织学变化分析图。免疫组化法检测各组3周时胶原i的表达水平。a：各组ⅰ型胶原的产生，b：各组大鼠肌腱组织ⅲ型胶原的产生，d：cyclind的表达：各组第3周肌腱组织的组织学评价。根据图5a、b、d的结果显示ⅰ、ⅲ型胶原(coli/iii)在肌腱组织内的表达呈现相反的趋势；当延迟添加tsa治疗时coli的蛋白质水平增加，而cyclind与未处理组相比显著增加，但在处理组之间没有差异。该结果证实，联合应用tsa与mir-29b抑制剂可通过抑制tgf-β1/smad3通路，减少胶原纤维表达，最终减少粘连形成。
体外实验表明，tsa处理显著增强mir-29b的表达，tsa可以降低tgf-β和smad3的表达，抑制细胞增殖、促进凋亡，而mir-29b抑制剂则相反。而同时使用tsa和mir-29抑制剂时，细胞凋亡显著减少，tgf-β和samd3的表达水平显著高于仅使用tsa处理的细胞，但与使用mir-29b抑制剂处理的细胞相比显著减弱，证明mir-29b抑制剂和tsa的联合应用可以有效预防肌腱粘连，提高肌腱强度。作用机制为，mir-29b抑制剂可以激活tgf-β/smad3途径，触发内源性途径，诱导成纤维细胞高度增殖。体内实验显示，所有治疗条件下，大鼠跟腱损伤处的胶原纤维和成纤维细胞的数量和排列情况均优于对照组，大鼠跟腱的最大负荷均高于疾病模型，尤其是在mir-29b抑制剂治疗6h后添加tsa，在我们的大鼠模型中产生的细胞毒性最小，抑制肌腱粘连和对于愈合后肌腱粘连强度增强的效果更好。
综上，本发明证实，在肌腱断端使用mir-29b抑制剂可以启动内源性修复机制，随后使用tsa能够抑制外源性修复机制，从而实现肌腱粘连减少的目的。尤其是在mir-29b抑制剂治疗6h后添加tsa，在本发明所述的大鼠模型中产生的细胞毒性更小，抑制肌腱粘连和对于愈合后肌腱粘连强度增强的效果更好。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
以上对本发明所提供的丹参酮ⅱa与mir-29b抑制剂联合在制备治疗肌腱粘连的药物中的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110>浙江大学医学院附属第一医院
<120>丹参酮ⅱa与mir-29b抑制剂联合在制备治疗肌腱粘连的药物中的应用
<130>whly20-019
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(1-f)
<400>1
cactcccgtggcttctagtg20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(1-r)
<400>2
ggactggcgagccttagttt20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(2-f)
<400>3
acagcaggtcaagaggagta20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(2-r)
<400>4
ctgagcctgtttcgtgtcta20
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(3-f)
<400>5
cctccaattcagagcgcttc20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(3-r)
<400>6
atagcactgtcactgaggca20
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(4-f)
<400>7
cgcttcggcagcacatatac20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(4-r)
<400>8
aaatatggaacgcttcacga20
<210>9
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(5-f)
<400>9
tgcgctagcaccatttgaaatca23
<210>10
<211>52
<212>dna
<213>人工序列(5-s)
<400>10
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaacactga52
<210>11
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(rprimer)
<400>11
ccagtgcagggtccgaggtatt22
1.一种丹参酮ⅱa与mir-29b抑制剂联合在制备治疗肌腱粘连的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用是在mir-29b抑制剂之后使用丹参酮ⅱa。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用是在mir-29b抑制剂之后0-72h使用丹参酮ⅱa。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用是在mir-29b抑制剂之后4-8h使用丹参酮ⅱa。
5.一种治疗肌腱粘连的药物，其特征在于：该药物包含丹参酮ⅱa与mir-29b抑制剂。
6.根据权利要求5所述的治疗肌腱粘连的药物，其特征在于：所述药物的给药方式为注射。
技术总结