本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种聚合氯喹芴甲基羰基纳米凝胶递送系统及其制备方法。
背景技术：
在中国，肿瘤近年来的发病率明显升高，而这其中又以恶性肿瘤患者居多，恶性肿瘤细胞的转移使患者的死亡率显著提升。传统化疗药物紫杉醇通过与细胞内微管蛋白结合，阻碍微观蛋白解离，从而阻滞细胞有丝分裂，促进肿瘤细胞的凋亡，为肿瘤治疗带来的希望。但由于紫杉醇极低的水溶性，传统紫杉醇注射剂需以聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇的混合溶液作为增溶剂，但聚氧乙烯蓖麻油会带来一系列过敏反应，用药前需对患者进行脱敏处理，给患者带来了痛苦。且紫杉醇注射剂由于缺乏组织特异性，在治疗乳腺癌的同时会对机体的其他正常器官组织产生严重的的毒副作用，如：骨髓抑制、神经毒性、过敏反应、消化道反应等。随着纳米科技和材料的发展，新型纳米凝胶递药系统展示出良好的临床应用潜能，给肿瘤的高效治疗提供了新策略。
纳米凝胶是由含有多官能团的亲水性或两亲性高分子聚多糖分散在水中后，通过物理或化学交联形成粒径小于200nm的三维网状结构系统。由于纳米凝胶内部具有三维网状结构，通过离子键、氢键、疏水力以及π-π共轭效应，可将药物包封于其内部结构中，在化疗药物的递送方面具有粒径小、血液循环时间长、生物相容性好、生物可降解等优点。但由于纳米凝胶多采用传统凝胶材料，不具有抗肿瘤转移功能，因而对于恶性晚期肿瘤治疗效果并不显著，因此，迫切寻求创新型纳米凝胶修饰策略用于恶性晚期肿瘤。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种聚合氯喹芴甲基羰基纳米凝胶递送系统及其制备方法，通过在聚多糖主链上同时修饰芴甲基羰基和氯喹，实现在抑制细胞内自噬水平、阻断肿瘤细胞转移的信号通路的同时，通过π-π共轭作用包载抗肿瘤药物紫杉醇，双管齐下恶性肿瘤的转移及增殖。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种聚合氯喹芴甲基羰基纳米凝胶递送系统，所述递送系统包括聚合氯喹芴甲基的纳米凝胶微粒和包裹在微粒中的抗肿瘤药物；
所述纳米凝胶微粒由修饰有羟基氯喹及芴甲氧羰基的聚多糖主链交联形成，聚多糖主链的分子量为5-200kd，羟基氯喹在聚多糖主链上的摩尔取代度为5%-50%，芴甲氧羰基在聚多糖主链上的摩尔取代度为1%-30%。
进一步地，所述聚多糖主链选自羟乙基淀粉、糊精、聚乙二醇、透明质酸、海藻酸、葡聚糖或壳聚糖，优选葡聚糖。
进一步地，所述抗肿瘤药物为含芳香环的抗肿瘤药物，如：喜树碱、阿霉素盐酸盐、紫杉醇、多西紫杉醇及姜黄素，优选紫杉醇。
上述递送系统的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，芴甲氧羰基对聚多糖主链的修饰：在极性溶剂中，在催化剂及脱水剂存在下，芴甲氧羰基供体与聚多糖主链上的羟基通过酯化反应连接，得到侧链修饰有芴甲氧羰基的聚多糖主链；
步骤2，羟基氯喹对聚多糖骨架的修饰：先在极性溶剂中，合成羟基氯喹-羰基二咪唑，然后在极性溶剂中，羟基氯喹-羰基二咪唑与侧链修饰有芴甲氧羰基的聚多糖主链反应，得到修饰有羟基氯喹及芴甲氧羰基的聚多糖主链；
步骤3，纳米凝胶递送系统的制备：将修饰有羟基氯喹及芴甲氧羰基的聚多糖主链和抗肿瘤药物一起溶解于有机溶剂中，在搅拌条件下将得到的有机溶液逐滴加入到含水溶液中，制得乳液，除去有机溶剂，即可得到纳米凝胶递送系统。
进一步地，步骤1中，所述芴甲氧羰基供体选自fmoc-甘氨酸、fmoc-l-鸟氨酸或n’-fmoc-l-赖氨酸。
进一步地，步骤1中，极性溶剂选自二甲亚砜、无水二甲基甲酰胺或四氢呋喃，，脱水剂为二环己基碳二亚胺，催化剂为二甲氨基吡啶。该反应步骤具体是将聚多糖主链溶解于极性溶剂中，分别加入脱水剂、催化剂及芴甲氧羰基供体，在惰性氛围下反应，产物经处理后得到侧链修饰有芴甲氧羰基的聚多糖主链。
进一步地，步骤2中极性溶剂选自丙醇、乙腈、无水二甲亚砜或无水二甲基甲酰胺，该反应步骤具体是将羟基氯喹与n,n’-羰基二咪唑分别溶解于极性溶剂中，在惰性氛围下使二者反应获得羟基氯喹-羰基二咪唑，然后将合成的羟基氯喹-羰基二咪唑与芴甲氧羰基的聚多糖主链溶于极性溶剂中，在惰性氛围下搅拌反应，处理后得到羟基氯喹及芴甲氧羰基的聚多糖主链。
进一步地，步骤3中有机溶剂选自二甲亚砜、四氢呋喃或二甲基甲酰胺，含水溶液选自纯水、5%w/v葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，修饰有羟基氯喹及芴甲氧羰基的聚多糖主链与抗肿瘤药物的质量比为1-100：1。
该纳米凝胶的给药方式为1-20mg/kg，每2-5天静脉注射或腹腔注射进入体内。
普通化疗药物具有严重的毒副作用，而单一给药系统难以实现多种药物的共同递送，且无法抑制恶性肿瘤的转移与增殖。因而本发明使用的聚合氯喹芴甲氧羰基纳米凝胶递送体系，可以在抑制细胞内自噬水平、阻断肿瘤细胞转移的信号通路的同时，通过π-π共轭作用包载抗肿瘤药物紫杉醇，双管齐下恶性肿瘤的转移及增殖。聚合氯喹芴甲基偶联物中各组分修饰量可控，所形成的纳米粒结构稳定，载药量高，是一种具有良好的生物安全性的多功能递送平台。利用本发明方案，可通过抑制自噬及阻断肿瘤转移信号通路的同时，抑制肿瘤细胞进一步增殖，双管齐下实现对恶性肿瘤的有效治疗。
附图说明
图1为实施例2中聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖的合成路线及得到的聚合氯喹芴甲基羰基葡聚糖的核磁共振氢谱图。
图2为实施例2中聚合氯喹芴甲基羰基葡聚糖包载抗肿瘤化疗药物紫杉醇的纳米凝胶示意图。
图3为实施例2中聚合氯喹芴甲基羰基纳米凝胶的（a）粒径分布、（b）透射电镜。
图4为实施例2中聚合氯喹芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶骨架包载紫杉醇纳米凝胶在不同药物浓度下对肿瘤细胞的杀伤作用。
图5为实施例2中聚合氯喹芴甲基羰基纳米凝胶载体的自噬抑制能力测定结果。
图6为实施例2中聚合氯喹芴甲基羰基纳米凝胶载体的cxcr4再分布实验测定结果。
图7为实施例2中聚合氯喹芴甲基羰基纳米凝胶载体抑制肿瘤细胞侵袭的结果。
图8为实施例2中聚合氯喹芴甲基羰基纳米凝胶载体体外抗肿瘤细胞转移的结果。
具体实施方式
纳米凝胶是含有多官能团的亲水性或两亲性高分子聚多糖分散在水中，常通过物理或化学交联形成粒径小于200nm的三维网状结构系统。由于纳米凝胶内部具有三维网状结构，通过离子键、氢键、疏水力以及π-π共轭效应，可将药物包封于其内部结构中，在化疗药物的递送方面具有粒径小、血液循环时间长、生物相容性好、生物可降解等优点。且由于纳米凝胶具有较小的粒径，从而具有较大的比表面积，便于进行化学修饰。由于芴甲基羰基具有芴环，可与含有芳香环的药物之间可发生π-π共轭作用，从而实现良好的药物包载效果，有效包载紫杉醇等具有芳香环的化疗药物，因此，在本发明中选择采用芴甲基羰基修饰在聚多糖主链，用以包载具有芳香环的化疗药物。
转移和侵袭是恶性肿瘤的主要生物学特征，转移过程复杂，主要是原发部位的肿瘤细胞脱离原发病灶，随着血液或淋巴液运输至靶器官，在继发部位不断增殖形成肿瘤细胞转移灶等步骤。其中涉及细胞自噬以及趋化因子及其受体等多重机制调控。细胞自噬是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程。近年来，随着细胞自噬的研究逐步深入，自噬与肿瘤转移之间的关系被揭示。肿瘤细胞自噬过程降解的桩蛋白可降低肿瘤细胞间黏附，而细胞间黏附作用的缺失是恶性转移瘤发生的必要条件之一，继而引起肿瘤细胞的迁移和浸润。因此，抑制自噬途径可减少肿瘤细胞内桩蛋白的降解，提高肿瘤细胞间黏附的特性，从而达到减少肿瘤细胞的转移的效果。羟基氯喹是一种用于控制疟疾临床症状并预防疟疾的药物。近年来研究表明，经典小分子自噬抑制剂羟基氯喹具有碱性，可在溶酶体内堆积改变溶酶体内酸度，导致水解功能减退，进而减少桩蛋白的降解，从而减少肿瘤转移，在治疗恶性肿瘤方面有一定前景。另一方面，趋化因子通过与对应的趋化因子受体结合从而调控着细胞的迁移。趋化因子是细胞因子超家族中具有化学趋化性的小分子蛋白质，在机体肿瘤发生及转移中发挥重要作用。趋化因子受体cxcr4使趋化因子受体家族中的一员，广泛存在于肿瘤细胞表面，趋化因子sdf-1是cxcr4唯一的内源性配体，在一些常见的肿瘤转移部位表达，如：肺、肝、淋巴结及骨髓等，提示其与肿瘤细胞特异性转移有关。这些sdf-1高度表达的器官为高表达cxcr4的肿瘤细胞的转移、浸润以及进一步的增殖提供了肥沃的土壤。
尽管纳米给药系统在治疗大多数肿瘤方面取得了一定成就，但由于纳米凝胶多采用传统凝胶材料，不具有抗肿瘤转移功能，因而对于恶性晚期肿瘤治疗效果并不显著。因此，迫切寻求创新型纳米凝胶修饰策略用于恶性晚期肿瘤。
羟基氯喹属于4-氨基喹诺酮类药物，起初羟基氯喹作为抗疟药应用于临床，后发现羟基氯喹可以作为自噬抑制剂影响肿瘤。羟基氯喹可通过抑制桩蛋白降解，从而减少肿瘤细胞内桩蛋白的降解，提高肿瘤细胞间黏附的特性，从而达到减少肿瘤细胞的转移的效果。与化疗药物联用，在晚期恶性肿瘤（转移性乳腺癌、胶质母细胞瘤）及黑色素瘤方面具有较好疗效，且可有效减少肿瘤转移的发生，延长患者生存期，且耐受性及安全性良好。
因此，本发明提供了一种具有抗肿瘤细胞转移功能载体包载化疗药物聚合氯喹芴甲基纳米凝胶递送系统，以亲水性聚多糖作为亲水主链，侧链修饰具有通过细胞自噬抑制起到抑制肿瘤细胞转移的小分子自噬抑制剂羟基氯喹（hcq），同时侧链修饰可通过π-π共轭包载化疗药物紫杉醇的基团芴甲氧羰基，包载化疗药物，有效抑制肿瘤细胞的增殖与转移，双重协同治疗晚期恶性肿瘤。
所述亲水性聚多糖主链具有亲水性且富含羟基，易于进行取代修饰。本发明中，聚多糖主链选自羟乙基淀粉、糊精、聚乙二醇、透明质酸、海藻酸、葡聚糖、壳聚糖中的一种。由于葡聚糖分子量较小，因而相较于其他高分子量聚多糖主链水溶性较好，优选葡聚糖（dex）。
在形成纳米凝胶时，芴甲基羰基（fmoc）可与富含芳香环的化疗药物通过π-π共轭作用包裹药物形成纳米粒。考虑到聚多糖主链的富含羟基特性，因而选择尾端具有羧基的化合物进行反应。在本发明中，选自fmoc-甘氨酸、fmoc-l-鸟氨酸、n’-fmoc-l-赖氨酸中的一种或几种作为芴甲基羰基供体，优选fmoc-甘氨酸。
进一步地，由于聚合氯喹芴甲氧羰基纳米凝胶骨架载体可通过π-π共轭作用有效包载化疗药物，实现被动靶向递送。为实现较好的载药效果，同时避免聚合氯喹与芴甲基羰基发生自聚，芴甲基羰基在聚多糖主链的摩尔取代度不得高于30%。
进一步地，由于氯喹疏水性较高，为保证聚合氯喹芴甲基羰基纳米凝胶载体在水中的溶解性，因此羟基氯喹在聚多糖主链上的取代度不得高于50%。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
聚合氯喹-芴甲基羰基糊精纳米凝胶载药系统的制备方法
步骤1，羟基氯喹的制备：将0.6g硫酸羟基氯喹溶解于2ml纯水中，在不断搅拌的条件下，加入过量的30%氨水直至白色不溶产物不再继续增多，加入二氯甲烷萃取4-6次，收集有机相并加入适量无水硫酸钠过夜，减压蒸出溶剂，得到最终脱盐产物。
步骤2，芴甲基羰基糊精的合成：将210mg糊精溶解于2ml二甲基甲酰胺中，分别加入206mg二环己基碳二亚胺，24mg4-二甲氨基吡啶以及297mgfmoc-甘氨酸，惰性气体环境下反应12-24h，除去不溶物后，将反应液加入10倍量无水乙醚中，在转速3000rpm条件下离心3min，弃上清获得白色粘稠状固体产物，用超纯水将产物溶解后透析，冻干得芴甲基羰基糊精。投料摩尔比为1：1：0.2：0.5-1，优选1：1：0.2：1。
步骤3，聚合氯喹-芴甲基羰基糊精的合成：将步骤1所得200mg羟基氯喹和389mgn,n'-羰基二咪唑分别溶解于3ml二甲基甲酰胺中，在惰性气体保护下，逐滴加入n,n'-羰基二咪唑溶液，继续搅拌反应4-6h。加入5ml二氯甲烷与2ml水终止反应后，加入20ml二氯甲烷溶液，并用超纯水洗涤5-10次去除过量的n,n’-羰基二咪唑，收集有机相，减压蒸出溶剂，得到羟基氯喹-羰基二咪唑。上述反应羟基氯喹和n,n’-羰基二咪唑的投料摩尔比为1：3-6，优选1：4。
将200mg羟基氯喹-羰基二咪唑和100mg步骤3制备的芴甲基羰基糊精溶于二甲亚砜中，惰性气体保护下搅拌反应4天。将反应液加入10倍量的无水乙醚中，抽滤，固体用超纯水溶解后透析，冻干得聚合氯喹-芴甲基羰基糊精。
步骤4，包载紫杉醇的聚合氯喹-芴甲基羰基糊精纳米凝胶的制备：取10mg制备得到的聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖合成物以及紫杉醇共同溶解在100μl有机溶剂中，得到聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖与紫杉醇的混合有机溶液。所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷及四氢呋喃，优选四氢呋喃。上述的聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖的偶联物与紫杉醇的投料质量比为1-50：1，优选5：1。
取10ml水溶液，将混合有机溶液逐滴加至水溶液中，并不断搅拌。超声400w，超声温度20℃，超声时间3min，37℃下减压蒸发有机溶剂。即得到载有化疗药物紫杉醇的聚合氯喹-芴甲基羰基糊精纳米凝胶，其载药量为5%。所述的水溶液选自纯水、生理盐水、磷酸盐缓冲液等，优选磷酸盐缓冲液。上述有机混合溶液与水溶液的体积比为1：1-100，优选1：10~1：50。
实施例2
聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶载药系统的制备方法
步骤1，羟基氯喹的制备：将0.6g硫酸羟基氯喹溶解于2ml纯水中，在不断搅拌的条件下，加入过量的30%氨水直至白色不溶产物不再继续增多，加入二氯甲烷萃取4-6次，收集有机相并加入适量无水硫酸钠过夜，减压蒸出溶剂，得到最终脱盐产物。
步骤2，芴甲基羰基葡聚糖（hf）的合成：将164mg葡聚糖溶解于2ml二甲基甲酰胺中，分别加入206mg二环己基碳二亚胺，24mg4-二甲氨基吡啶以及297mgfmoc-甘氨酸，惰性气体环境下反应12-24h，除去不溶物后，将反应液加入10倍量无水乙醚中，在转速3000rpm条件下离心3min，弃上清获得白色粘稠状固体产物，用超纯水将产物溶解后透析，冻干得芴甲基羰基葡聚糖（hf）。投料摩尔比为1：1：0.2：0.5-1，优选1：1：0.2：1。
步骤3，聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖（cq-hf）的合成：将步骤1所得200mg羟基氯喹和389mgn,n'-羰基二咪唑分别溶解于3ml二甲基甲酰胺中，在惰性气体保护下，逐滴加入n,n'-羰基二咪唑溶液，继续搅拌反应4-6h。加入5ml二氯甲烷与2ml水终止反应后，加入20ml二氯甲烷溶液，并用超纯水洗涤5-10次去除过量的n,n’-羰基二咪唑，收集有机相，减压蒸出溶剂，得到羟基氯喹-羰基二咪唑（cq-cdi）。上述反应羟基氯喹和n,n’-羰基二咪唑的投料摩尔比为1：3-6，优选1：4。
将200mg羟基氯喹-羰基二咪唑和100mg步骤3制备的芴甲基羰基葡聚糖溶于二甲亚砜中，惰性气体保护下搅拌反应4天。将反应液加入10倍量的无水乙醚中，抽滤，固体用超纯水溶解后透析，冻干得聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖（cq-hf）。
图1为聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖的合成路线及得到的聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖的核磁共振氢谱图，结果证明实施本实例所制备的产物为聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖。
步骤4，包载紫杉醇的聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶（cq-hf/ptx）的制备：取10mg制备得到的聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖合成物以及紫杉醇共同溶解在100μl有机溶剂中，得到聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖与紫杉醇的混合有机溶液。所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷及四氢呋喃，优选四氢呋喃。上述的聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖的偶联物与紫杉醇的投料质量比为1-50：1，优选5：1。
取10ml水溶液，将混合有机溶液逐滴加至水溶液中，并不断搅拌。超声400w，超声温度20℃，超声时间3min，37℃下减压蒸发有机溶剂。即得到载有化疗药物紫杉醇的聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶（cq-hf/ptx），其载药量为7%。所述的水溶液选自纯水、生理盐水、磷酸盐缓冲液等，优选磷酸盐缓冲液。上述有机混合溶液与水溶液的体积比为1：1-100，优选1：10~1：50。
图2为聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶制备过程的示意图。
步骤5，包载紫杉醇的芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶（hf/ptx）的制备：取10mg制备得到的芴甲基羰基葡聚糖合成物以及紫杉醇共同溶解在100μl有机溶剂中，得到芴甲基羰基葡聚糖与紫杉醇的混合有机溶液。所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷及四氢呋喃，优选四氢呋喃。上述的芴甲基羰基葡聚糖的偶联物与紫杉醇的投料质量比为1-50：1，优选5：1。
取10ml水溶液，将混合有机溶液逐滴加至水溶液中，并不断搅拌。超声400w，超声温度20℃，超声时间3min，37℃下减压蒸发有机溶剂。即得到载有化疗药物紫杉醇的聚合芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶（hf/ptx），其载药量为7%。所述的水溶液选自纯水、生理盐水、磷酸盐缓冲液等，优选磷酸盐缓冲液。上述有机混合溶液与水溶液的体积比为1：1-100，优选1：10~1：50。
将得到的纳米凝胶溶液用分子量为8000kda的透析袋透析12小时，每2小时更换一次去离子水，除去多余的紫杉醇游离药，得到聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶溶液。
图3为包载紫杉醇的聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶的动态光散射测定粒径分布及透射电镜下观察粒子的形貌特征考察。由图中可看出所述制备的纳米凝胶平均粒径为180nm的双层球形粒子，显示已成功制备后续使用的包载紫杉醇的聚合氯喹-芴甲基羰基纳米凝胶（cq-hf/ptx）
1、聚合氯喹-芴甲基羰基-葡聚糖纳米载体及包载紫杉醇的纳米凝胶体外细胞毒性测定
步骤1，将乳腺癌细胞4t1细胞接种于96孔板中，细胞密度为5000个/孔，利用含10%胎牛血清的1640培养基进行培养。待细胞密度增长至60%-70%时，将不同浓度的聚合氯喹-芴甲基羰基纳米凝胶与细胞共孵育48小时。
步骤2，加入20μl3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（mtt），孵育4小时，弃去孔内溶液，加入200μl二甲亚砜溶解活细胞所产生的紫色甲臢，利用酶标仪在570nm波长下测定各孔吸光度，并计算细胞存活率。
图4为聚合氯喹-葡聚糖纳米凝胶的体外细胞毒性试验。
hf为未包载紫杉醇的芴甲基羰基纳米凝胶组，cq-hf为未包载紫杉醇的聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶组。左图中可看出未包载紫杉醇的的纳米载体毒性较低，说明聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶具有较好的安全性。ptx为市售紫杉醇注射剂，hfnanogels为包载紫杉醇的芴甲基羰基纳米凝胶组，hfhnanogels为包载紫杉醇的聚合氯喹-芴甲基纳米凝胶组。左图中包载紫杉醇的纳米凝胶显示出明显高于市售紫杉醇注射剂的毒性，这可能是由于氯喹内化cxcr4的作用，使得纳米凝胶的细胞摄取能力有着显著提升，从而使得细胞毒性增强。
2、聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶的质子缓冲能力测定
取10mgcq-hf与hf，以及等量的羟基氯喹溶解于5ml氯化钠水溶液中，将溶液的初始ph调至10.3。后利用0.1m的盐酸溶液滴定，记录每加入50μl0.1m盐酸后溶液ph的变化，直至ph降低至3结束。hcq为游离羟基氯喹组，hf为未包载紫杉醇的芴甲基羰基纳米凝胶组，cq-hf为未包载紫杉醇的聚合氯喹-芴甲基纳米凝胶组。图5为纳米载体体外质子缓冲能力滴定图。由图中可看出所聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖较不含聚合氯喹的聚合物具有优异的的质子缓冲能力，可作为高效的自噬抑制剂，用于抑制晚期恶性肿瘤的转移。
3、聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶的体外细胞自噬抑制功能的考察
蛋白质印记法测定自噬相关蛋白lc3的方法：将乳腺癌细胞4t1细胞接种于6孔板中，利用含10%的胎牛血清的1640培养基进行培养。待细胞密度增长至60%-70%时，以将游离氯喹（hcq）、芴甲基羰基-葡聚糖纳米凝胶（hf）、羟基氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶（cq-hf）与细胞共孵育12小时。弃去孔内溶液，加入细胞裂解液，冰上孵育15分钟后，离心取上清液。上清液加入sds-page上样缓冲液后，通过sds-page凝胶电泳进行分离，分离出的蛋白转移至pvdf上，并以5%的bsa进行室温封闭1小时。并用自噬相关蛋白lc3抗体与二抗孵育后，在超灵敏ecl显影液下进行显色。
图6为蛋白质印记法测定的lc3蛋白表达量的结果。由图中可以看出，聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶有lc3b/lc3a比值高于其他组，说明该纳米凝胶具有明显的自噬抑制功能，从而可达到抑制细胞迁移的作用。
4、聚合氯喹-芴甲基羰基葡聚糖纳米凝胶的体外cxcr4拮抗功能的考察
将人骨肉瘤细胞u2os表达cxcr4受体以绿色荧光蛋白进行标记，以每孔1×105个细胞种于共聚焦皿中培养24小时，分别加入不同制剂孵育30分钟后，用100μl分析液（含2mml-谷氨酰胺、1
