本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种靶向肝星状细胞的活性氧响应型药物载体。
背景技术：
肝纤维化是一种常见的损伤后代偿性疾病，往往是肝硬化和肝癌的前期阶段，伴随着肝功能损伤等病理变化，严重影响到人们的生活质量，现已成为一项尚无根治手段的国际性疾病。肝纤维化的病理特征之一在于严重的基质沉积，从而使肝脏出现瘢痕，影响到正常生理机能，在这一过程中，肝星状细胞（hsc）的活化位于中心环节，因此，通过针对肝星状细胞来设计药物是当今治疗肝纤维化的热点之一。目前常见的手段主要有抑制肝星状细胞产生基质、抑制肝星状细胞激活或者促进肝星状细胞凋亡等几种。因此，如何将药物特异性递送至肝星状细胞并在肝星状细胞中选择性释放药物便成为了肝纤维化治疗过程中的关键性问题之一。
纳米胶束是一种纳米级药物递送系统，为两亲性结构，可将疏水性药物包载在疏水性内核中，粒径多为10~200nm，制备容易，稳定性较强，经表面修饰特异性配体后，可实现对某些细胞的靶向效果，且通过对胶束嵌段的设计可实现胶束响应型断裂释药，是一种很理想的载药平台。
技术实现要素：
针对上述现有技术的不足，本发明以生物相容性极好的葡聚糖和硫辛酸为基础材料，制成具有活性氧响应性质的两亲性材料，然后在表面修饰cxcr4/sdf-1α轴的选择性拮抗剂amd3100，制备得到靶向肝星状细胞的活性氧响应型药物载体。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种靶向肝星状细胞的活性氧响应型药物载体，所述药物载体为表面修饰有amd3100的胶束纳米粒子，所述胶束纳米粒子由含有缩硫酮键的两亲性材料在水溶液中自组装形成；
所述含有缩硫酮键的两亲性材料一端为葡聚糖、另一端为含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物，葡聚糖和含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物通过酯键连接。
所述amd3100通过静电吸附作用修饰在胶束纳米粒子表面。
进一步地，所述含有缩硫酮键的两亲性材料通过以下步骤制备得到：
步骤1，将二氢硫辛酸和对甲苯磺酸（ptsa）溶解在甲苯中，搅拌，再加入2-甲氧基丙烯，搅拌反应，得到含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物；
步骤2，将含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物、4-（二甲基氨基）吡啶和二环己基碳二亚胺混合，在氮气保护下搅拌反应，反应结束后除去不溶物，加入葡聚糖，在氮气保护下搅拌反应，分别以乙醇水溶液和纯水进行透析，得到含有缩硫酮键的两亲性材料。
进一步地，步骤1中二氢硫辛酸、ptsa和2-甲氧基丙烯的摩尔比为1:(0.002-0.08):(0.1-5)。
进一步地，步骤2中葡聚糖的分子量为5-50kd。
进一步地，步骤2中含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物、4-（二甲基氨基）吡啶、二环己基碳二亚胺和葡聚糖单糖单元的的摩尔比1:(1-2):(0.5-2):(0.15-3)。
上述药物载体的制备方法，是将含有缩硫酮键的两亲性材料加至含水溶液中，即可得到药物载体。
进一步地，所述含水溶液选自纯水、5%w/v葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
上述药物载体在制备靶向肝星状细胞治疗药物中的应用。
本发明通过对人体内源性物质硫辛酸进行化学改性，获得具有缩硫酮单元的活性氧响应型结构，使载体能够在肝星状细胞内依托较高浓度活性氧实现响应型释药过程，进一步在载体表面通过静电吸附作用修饰amd3100，使载体能够特异性靶向肝星状细胞。将该载体应用于药物制剂领域，可实现肝纤维化治疗药物的有效包载和特异性释药，从而实现对肝纤维化的高效治疗并降低药物对正常细胞的毒副作用。本发明为肝纤维化递药提供了一种新的途径和思路。
附图说明
图1为本发明的含有缩硫酮键的两亲性材料的合成路线示意图。
图2为二氢硫辛酸的1hnmr图谱。
图3为活性氧响应型硫辛酸类似物（rla）的1hnmr图谱。
图4为葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物（dex-rla）的1hnmr图谱。
图5为葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束的粒径（左）、tem表征（右）。
图6葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束对肝星状细胞的靶向效果。
图7葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束的体外活性氧响应型释放。
具体实施方式
纳米胶束是一种纳米级药物递送系统，为两亲性结构，可将疏水性药物包载在疏水性内核中，粒径多为10~200nm，制备容易，稳定性较强，经表面修饰特异性配体后，可实现对某些细胞的靶向效果，且通过对胶束嵌段的设计可实现胶束响应型断裂释药，是一种很理想的载药平台。
多糖具有良好的生物相容性、低毒性和生物可降解性，被广泛用于医药、化妆品、食品等领域，尤其葡聚糖是fda认可的药用辅料，其优良的生物相容性及可降解性使之被广泛应用于生物医药领域。由于其结构中含有大量的羟基，易于修饰成为功能多样的药用载体。
硫辛酸，是人体三羧酸循环的重要辅酶，自身及其还原性代谢物二氢硫辛酸都是极好的抗氧化剂，可以防止线粒体损伤和肝细胞凋亡，作为一种内源性物质，具有极高的安全性，且具有独特的分子结构特征：（1）二硫杂环戊烷环结构，其还原产物二氢硫辛酸在同一个分子上即包含两个游离硫醇基团，这样的结构使其成为一种优良交联剂，交联产物具有刺激响应性；（2）易于修饰的末端羧酸结构，交联产物还可进一步与其他功能分子连接起来；（3）两亲性分子结构，既溶于水又溶于脂，有良好的配伍性，有利于胶束的形成。这些独特结构十分有利于药物载体的设计。
趋化因子通过与体内表达的对应趋化因子受体的信号响应控制着细胞的迁移，其中趋化因子受体4（cxcr4）是趋化因子基质细胞衍生因子-1（cxcl12）的特异受体，在肝星状细胞表面高度表达，因此，cxcr4的选择性拮抗剂如amd3100等具有较好的肝星状细胞靶向能力。
本发明以生物相容性极好的葡聚糖和硫辛酸为基础材料，将其制成含有缩硫酮键的两亲性材料，两亲性材料的一端为葡聚糖、另一端为含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物，葡聚糖的羟基通过与硫辛酸缩聚物中的羟基形成酯键从而连接，缩硫酮键使得两亲性材料具有活性氧智能响应断裂键的结构。该两亲性材料在水溶液可自组装形成胶束，包载肝纤维化治疗药物。同时，本发明将cxcr4/sdf-1α轴的选择性拮抗剂amd3100修饰在胶束纳米粒子表面，使得胶束纳米粒子能够特异性靶向肝星状细胞；由于肝星状细胞内含量较高的活性氧，活性氧智能响应断裂键缩硫酮键使得胶束能够选择性在肝星状细胞内部断裂释放药物，通过靶向性和响应性这两种优势，减少药物对正常细胞的毒性，实现药物的特异性递药和选择性递药，增强药物的治疗效果，降低副作用。
如图1所示，硫辛酸在还原剂硼氢化钠的作用下生成带有2个硫醇基团的还原产物二氢硫辛酸，二氢硫辛酸在2-甲氧基丙烯的作用下发生缩合，形成缩硫酮键，带有缩硫酮键的产物通过酯键结合在葡聚糖上，形成最终产物。
在本发明的实施例中，选择分子量为10kd的葡聚糖用来制备两亲性材料，以索拉非尼作为模型药物制备载药胶束，然后香豆素6用以替代索拉非尼等抗肝纤维化药物，在488激发处有荧光，用来标记胶束，可示踪胶束在细胞内的分布情况。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
步骤（1）二氢硫辛酸的合成：
准确称取1.03g硫辛酸，温和搅拌下将其悬浮在25ml的0.2m碳酸氢钠水溶液中，得到浅黄色溶液。冰浴条件下，分小批加入0.38g硼氢化钠，添加总时间需大于十分钟。将所得溶液在冰浴条件下搅拌30分钟，然后转移至室温，再搅拌30分钟。将溶液再次冰浴，并用2m盐酸调节至ph＝1。用氯仿（10ml×3）萃取混合物，并用无水硫酸镁干燥过夜。蒸发溶剂，并将获得的油状物在在真空干燥箱中干燥。
步骤（2）活性氧响应型硫辛酸类似物（rla）的合成：
准确称取284mg步骤（2）产物和2mg对甲苯磺酸（ptsa）溶解在5ml甲苯中，室温搅拌10分钟。加入0.5g5å分子筛，搅拌10分钟。加入30mg2-甲氧基丙烯，室温搅拌4h。将溶液过滤并通过旋转蒸发浓缩以得到rla，其为白色固体。
步骤（3）葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物（dex-rla）的合成：
准确称取100mg步骤（2）产物，加入60mg4-（二甲基氨基）吡啶和140mg二环己基碳二亚胺，在氮气保护下温和搅拌反应24h，真空抽滤除去不溶物，加入50mg葡聚糖（10kd），在氮气保护下温和搅拌反应24h。以乙醇：水=0.5:1为透析介质，以8-14kd透析袋为半透膜，透析12h；以纯水为透析介质，以8-14kd透析袋为半透膜，透析48h。透析后，冻干，并保存在-80°c以便以后使用。
步骤（4）葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束的制备方法：
称取2mg葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物，600μg索拉非尼，溶解在200μl二甲基亚砜中，室温搅拌下将其缓慢滴加至含有50μg/mlamd3100的5mlpbs（ph=7.4）中。将所得的纳米颗粒悬浮液在3500rpm的条件下进行超滤（eppendorfag22331hamburg，mwco3000）30分钟以去除dmso和游离的索拉非尼，然后通过0.22μm尼龙针筒式过滤器以得到最终的尺寸合适的纳米颗粒。
实施例2
步骤（1）二氢硫辛酸的合成：
准确称取1.03g硫辛酸，温和搅拌下将其悬浮在25ml的0.2m碳酸氢钠水溶液中，得到浅黄色溶液。冰浴条件下，分小批加入0.38g硼氢化钠，添加总时间需大于十分钟。将所得溶液在冰浴条件下搅拌30分钟，然后转移至室温，再搅拌30分钟。将溶液再次冰浴，并用2m盐酸调节至ph＝1。用氯仿（10ml×3）萃取混合物，并用无水硫酸镁干燥过夜。蒸发溶剂，并将获得的油状物在在真空干燥箱中干燥。
步骤（2）活性氧响应型硫辛酸类似物（rla）的合成：
准确称取284mg步骤（2）产物和2mgptsa溶解在5ml甲苯中，室温搅拌10分钟。加入0.5g5å分子筛，搅拌10分钟。加入30mg2-甲氧基丙烯，室温搅拌4h。将溶液过滤并通过旋转蒸发浓缩以得到rla，其为白色固体。
步骤（3）葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物（dex-rla）的合成：
准确称取100mg步骤（2）产物，加入60mg4-（二甲基氨基）吡啶和140mg二环己基碳二亚胺，在氮气保护下温和搅拌反应24h，真空抽滤除去不溶物，加入50mg葡聚糖（10kd），在氮气保护下温和搅拌反应24h。以乙醇：水=0.5:1为透析介质，以8-14kd透析袋为半透膜，透析12h；以纯水为透析介质，以8-14kd透析袋为半透膜，透析48h。透析后，冻干，并保存在-80°c以便以后使用。
步骤（4）葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束的制备方法：
称取2mg葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物，600μg香豆素6，溶解在200μl二甲基亚砜中，室温搅拌下将其缓慢滴加至含有50μg/mlamd3100的5mlpbs（ph=7.4）中。将所得的纳米颗粒悬浮液在3500rpm的条件下进行超滤（eppendorfag22331hamburg，mwco3000）30分钟以去除dmso和游离的香豆素6，然后通过0.22μm尼龙针筒式过滤器以得到最终的尺寸合适的纳米颗粒。
实施例3
本实施例与实施例1、2的区别在于，未采用amd3100进行表面修饰。
步骤（1）二氢硫辛酸的合成：
准确称取1.03g硫辛酸，温和搅拌下将其悬浮在25ml的0.2m碳酸氢钠水溶液中，得到浅黄色溶液。冰浴条件下，分小批加入0.38g硼氢化钠，添加总时间需大于十分钟。将所得溶液在冰浴条件下搅拌30分钟，然后转移至室温，再搅拌30分钟。将溶液再次冰浴，并用2m盐酸调节至ph＝1。用氯仿（10ml×3）萃取混合物，并用无水硫酸镁干燥过夜。蒸发溶剂，并将获得的油状物在在真空干燥箱中干燥。
步骤（2）活性氧响应型硫辛酸类似物（rla）的合成：
准确称取284mg步骤（2）产物和2mgptsa溶解在5ml甲苯中，室温搅拌10分钟。加入0.5g5å分子筛，搅拌10分钟。加入30mg2-甲氧基丙烯，室温搅拌4h。将溶液过滤并通过旋转蒸发浓缩以得到rla，其为白色固体。
步骤（3）葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物（dex-rla）的合成：
准确称取100mg步骤（2）产物，加入60mg4-（二甲基氨基）吡啶和140mg二环己基碳二亚胺，在氮气保护下温和搅拌反应24h，真空抽滤除去不溶物，加入50mg葡聚糖（10kd），在氮气保护下温和搅拌反应24h。以乙醇：水=0.5:1为透析介质，以8-14kd透析袋为半透膜，透析12h；以纯水为透析介质，以8-14kd透析袋为半透膜，透析48h。透析后，冻干，并保存在-80°c以便以后使用。
步骤（4）葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束的制备方法：
称取2mg葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物，800μg索拉非尼，溶解在200μl二甲基亚砜中，室温搅拌下将其缓慢滴加至5mlpbs（ph=7.4）中。将所得的纳米颗粒悬浮液在3500rpm的条件下进行超滤（eppendorfag22331hamburg，mwco3000）30分钟以去除dmso和游离的索拉非尼，然后通过0.22μm尼龙针筒式过滤器以得到最终的尺寸合适的纳米颗粒。
图2、3、4为图1所示合成路线中三步化学反应产物的1hnmr谱图。图2中关键峰为1和5峰（1.32(s,1h),1.28(s,1h)），表征了硫醇键；图3中关键峰为7峰（1.51(s,6h)），表征了甲基的存在；图4中存在葡聚糖的异头质子氢（4.68(s,1h)），图4上图存在缩硫酮键中的甲基，而下图（加入10mmh2o224h后）缩硫酮键中的甲基基本消失，可说明缩硫酮键在活性氧存在下发生断裂。
图5为葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物胶束于动态光散射仪测定粒径分布及透射电镜下观察粒子的形貌特征。由图5中可看出所述制备的聚合物纳米粒是平均粒径为100纳米的均匀球形粒子。
1、葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束对肝星状细胞的靶向能力
所用肝星状细胞为hsc-t6细胞系，为实验室保存，在市面上能够容易买到。将对数生长期的肝星状细胞hsc-t6以1~5*104个/孔加入共聚焦皿中，过夜培养至贴壁。将经amd3100表面修饰和未经amd3100表面修饰的纳米胶束分别用dmem培养基等稀释成适当浓度，分别加至细胞中孵育4h，弃去培养液，用pbs洗3遍以去除未被细胞摄取的胶束颗粒，用共聚焦显微镜观测细胞的成像情况。
由图6中可以看出，①图为未经amd3100表面修饰的葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束，信号最弱，证明无amd3100表面修饰时胶束的肝星状细胞靶向能力较弱；②图为经amd3100表面修饰的葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束，信号最强，证明经amd3100表面修饰时胶束的肝星状细胞靶向能力较强；③图为预先孵育游离amd31001h后孵育经amd3100表面修饰的葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束，信号较②图明显减弱，说明预先孵育amd3100后，胶束与肝星状细胞的结合位点被游离amd3100抢占，证明胶束的肝星状细胞靶向能力确实是由于表面的amd3100修饰。由此可知，在分别加入等量两种胶束后，明显孵育有amd3100修饰胶束细胞的亮于孵育无amd3100修饰胶束的细胞，说明amd3100修饰赋予了胶束肝星状细胞靶向能力。
2、葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束的体外活性氧响应型释放
通过透析法体外分析了药物在有/无活性氧存在时的释放情况。h2o2是实验室内最常用的一种活性氧，也是体内大多数活性氧成分的转化产物。将索拉非尼浓度为20μg/ml的5ml胶束溶液放入密闭的透析袋（mwco3500）中。随后，将透析袋浸入含有1％十二烷基磺酸钠的50mlpbs（ph7.4，含或不含1mmh2o2）中，并置于37°c水浴中，以100rpm的速度进行机械振荡。在每个预定的时间间隔0、0.25、0.5、1、2、4、5、6、16、24、42、和48h，从每个小瓶中取5ml溶解介质并用等量的预热新鲜透析液代替。将样品冻干并重新溶解在2mldmso中。通过紫外吸光度检测法使用270nm激发波长检测样品中索拉非尼含量，从而计算累积释放速率。
图7为葡聚糖-活性氧响应型硫辛酸类似物纳米胶束的体外活性氧响应型释放，释放介质分两组，区别仅为有/无1mmh2o2（一种常见的活性氧产生来源），由图中可以看出，无1mmh2o2时药物释放较慢且较不彻底，有1mmh2o2时药物释放较快且较彻底，证明了胶束在体外的活性氧响应性质。
1.一种靶向肝星状细胞的活性氧响应型药物载体，其特征在于：所述药物载体为表面修饰有amd3100的胶束纳米粒子；
所述胶束纳米粒子由含有缩硫酮键的两亲性材料在水溶液中自组装形成；
所述含有缩硫酮键的两亲性材料一端为葡聚糖、另一端为含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物，葡聚糖和含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物通过酯键连接。
2.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于：所述含有缩硫酮键的两亲性材料通过以下步骤制备得到：
步骤1，将二氢硫辛酸和对甲苯磺酸溶解在甲苯中，搅拌，再加入2-甲氧基丙烯，搅拌反应，得到含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物；
步骤2，将含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物、4-（二甲基氨基）吡啶和二环己基碳二亚胺混合，在氮气保护下反应，反应结束后除去不溶物，加入葡聚糖，继续在氮气保护下反应，得到含有缩硫酮键的两亲性材料。
3.根据权利要求2所述的药物载体，其特征在于：步骤1中二氢硫辛酸、对甲苯磺酸和2-甲氧基丙烯的摩尔比为1:(0.002-0.08):(0.1-5)。
4.根据权利要求2所述的药物载体，其特征在于：步骤2中葡聚糖的分子量为5-50kd。
5.根据权利要求2所述的药物载体，其特征在于：步骤2中含有缩硫酮键的硫辛酸缩聚物、4-（二甲基氨基）吡啶、二环己基碳二亚胺和葡聚糖单糖单元的的摩尔比1:(1-2):(0.5-2):(0.15-3)。
6.权利要求1所述的药物载体的制备方法，其特征在于：将含有缩硫酮键的两亲性材料加至含水溶液中，即可得到药物载体。
7.根据权利要求6的制备方法，其特征在于：所述含水溶液选自纯水、5%w/v葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
8.权利要求1所述的药物载体在制备靶向肝星状细胞治疗药物中的应用。
技术总结