本发明属材料及生物
技术领域：
，涉及一种地西他滨纳米载体及在制备肿瘤荧光成像剂中的应用，是地西他滨纳米载体(cndhnnps)的构建，cndhnnps在增敏铂类抗癌药物奥沙利铂治疗低氧介导的耐药性肾癌中的应用，具有肿瘤荧光成像效果等方面的应用。技术背景肾癌的多耐药性是阻碍肾癌治疗的重大因素，(r.l.siegel,k.d.miller,a.jemal,cancerstatistics,2018.cacancerjclin.2018,68(1),7-30.)异常表观遗传改变和低氧肿瘤微环境被认为是化疗耐药的重要因素。(c.holohan,s.vanschaeybroeck,d.b.longley,p.g.johnston,cancerdrugresistance:anevolvingparadigm.natrevcancer.2013,13,714-726.)肾癌化疗耐药的表观遗传机制之一，即slc22a2(编码oct2蛋白)启动子区域表观遗传的高甲基化变异引起抗癌药物如奥沙利铂的耐药。(y.liu,x.zheng,q.yu,h.wang,f.tan,q.zhu,l.yuan,h.jiang,l.yu,s.zeng,epigeneticactivationofthedrugtransporteroct2sensitizesrenalcellcarcinomatooxaliplatin.scitranslmed.2016,8.348,348ra97-348ra97.)表观遗传现象的可逆性使其成为肾癌治疗的重要靶点。dna甲基化抑制剂5-aza-2'-脱氧胞苷(decitabine，dac)可降低slc22a2启动子的高甲基化，提高有机阳离子转运蛋白2(oct2)的表达，而oct2是肾小管上皮细胞基膜侧表达的重要药物转运蛋白，具有较强的铂类抗癌药物转运能力。[6]实体瘤低氧微环境可通过增强低氧诱导因子1α(hif-1α)介导的药物外排转运体p-糖蛋白(p-gp)的表达，阻碍了多种抗癌药物在癌细胞中的蓄积，从而增强耐药性。(d.samanta,d.m.gilkes,p.chaturvedi,l.xiang,g.l.semenza,hypoxia-induciblefactorsarerequiredforchemotherapyresistanceofbreastcancerstemcells.procnatlacadsci.2014,111,e5429-e5438.)74％的肾癌患者因vhl基因突变和双等位基因失活而导致hif-1α过度表达。(h.guo,p.german,s.bai,s.barnes,w.guo,x.qi,h.lou,j.liang,e.jonasch,g.b.mills,z.ding,thepi3k/aktpathwayandrenalcellcarcinoma.jgenetgenom,2015,42,343-353.)因此，有效缓解肿瘤低氧微环境结合表观遗传学治疗可成为逆转多药耐药(mdr)肾癌，增敏化疗药物的一种有前途的策略。最近的研究表明，基于血红蛋白(hb)的纳米平台用于肿瘤的低氧缓解已被广泛应用于增强光动力治疗和化疗。(l.feng,o.betzer,d.tao,t.sadan,r.popovtzer,z.liu,oxygennanoshuttlesfortumoroxygenationandenhancedcancertreatmen.ccschem.2019,1,239-250.)hb优良的生物相容性和生物安全性使得hb基氧纳米载体的研制在高效肿瘤靶向低氧缓解方面具有重要的应用价值。hb也是一种富含fe2 的蛋白，可作为引发铁凋亡的诱导剂。(b.hassannia,p.vandenabeele,t.vandenberghe,targetingferroptosistoironoutcancer.cancercell.2019,35,830-849.)由氧化应激和脂质过氧化积累引起的铁凋亡已成为治疗耐药癌症的一种新的治疗方法。过氧化氢在癌细胞中的过度表达有助于铁凋亡治疗的实现。(gy.liou,p.storz,reactiveoxygenspeciesincancer.freeradicres,2010,44(5),479-496.)然而，谷胱甘肽(gsh)在rcc中的异常高表达增加了活性分子的解毒作用，限制了铁凋亡的疗效。(is.harris,ae.treloar,s.inoue,m.sasaki,c.gorrini,kc.lee,ky.yung,d.brenner,cb.knobbe-thomsen,ma.cox,a.elia,t.berger,dw.cescon,a.adeoye,a.brüstle,sd.molyneux,jm.mason,wy.li,k.yamamoto,a.wakeham,hk.berman,r.khokha,sj.done,tj.kavanagh,cw.lam,tw.mak,glutathioneandthioredoxinantioxidantpathwayssynergizetodrivecancerinitiationandprogression.cancercell.2015,27,211-222.)因此，开发一种消耗gsh的表观遗传药物和血红蛋白为基础的氧输送纳米载体，可以实现促进化疗和铁凋亡的协同治疗，从而发展一种多耐药性肾癌治疗的新策略。硝基苯并恶二唑(nbd)是一种gsh特异性识别化合物，通过形成单取代巯基nbd-gsh消耗gsh。nbd作为荧光探针广泛应用于半胱氨酸(cys)和谷胱甘肽(gsh)的检测。(md.hammers,md.pluth,ratiometricmeasurementofhydrogensulfideandcysteine/homocysteineratiosusingadual-fluorophorefragmentationstrategy.analchem.2014,86(14),7135.)当cys存在时开启，呈现绿色荧光，当gsh存在时关闭荧光。这些特点使nbd具有gsh消耗和同时实现肿瘤荧光成像的潜在应用价值。壳聚糖(chs)具有肾靶向性，非常适合于肾癌的治疗。(xk.he,zx.yuan,xj.wu,cq.xu,wy.li,lowmolecularweighthydroxyethylchitosan-prednisoloneconjugateforrenaltargetingtherapy:synthesis,characterizationandinvivostudies.theranostics.2012,2(11),1054-1063.)因此，开发了一种地西他滨纳米载体，命名为cndhnnps。以4-羧基苯甲醛为中间连接体，schiff碱反应将表观遗传药物地西他滨装载于chs上，nbd-cl在chs上被羟基脱氯，形成醚键连接的nbd-chs。采用复乳法(w/o/w)制备cndhnnps，用聚乳酸-羟基乙酸(plga)包封hb和荧光染料尼罗红，形成cndhnnps的核，包被dac装载的chs、nbd-chs和羧甲基chs外表面。实验表明，cndhnnps成功地增加了oct2的转录和蛋白表达，增加了铂类化疗药物的摄入量。hb携氧减轻实体瘤的低氧状况，hif-1α和药物外排蛋白p-gp等相关基因下调，克服低氧相关的多药耐药。hb中卟啉环的铁中心催化过氧化氢转化为活性羟基自由基增加脂质过氧化。nbd-chs预先消耗阻碍铁凋亡的gsh。nbd-gsh的荧光猝灭与正常细胞的绿色荧光nbd-cys形成对比，并以尼罗红作为荧光共定位参考，实现肿瘤荧光成像。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种地西他滨纳米载体，是一种多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)，该载体通过以下构建步骤实现：(1)先以牛血红蛋白为基础，溶于水中，配制成10g/l的血红蛋白溶液，命名为溶液a。(2)再取适量的聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga溶于乙酸乙酯中，制备成18mg/ml的溶液，命名为溶液b。(3)取适量尼罗红，配制成1g/l溶液，命名为溶液c。(4)取400ul溶液a和溶液c，置于10ml离心管中，4℃冷冻超声滴加2ml溶液b,使用漩涡振荡器混匀，在超声波破碎仪中冰浴超声3mins，间隔20s，所得溶液经减压冷冻旋转蒸发，去除有机溶剂，使用离心机离心10000rpm，10mins，弃上清，使用蒸馏水洗涤3次后，使用冻干机冷冻干燥，加去离子水复溶后，得溶液d。(5)将溶液d加入1％的聚乙烯醇(pva)和普朗尼克f68(pluronicf68)的水溶液中，聚乙烯醇(pva)与普朗尼克f68(pluronicf68)的体积比为7：3，10000rpm离心10mins，弃上清，去离子水复溶，所得溶液命名为溶液e。(6)将壳聚糖(分子量为62060.98mw)(0.2mm)、硝基苯并恶二唑(nbd)-cl(0.2mm)、三乙胺(0.6mm)，加入5ml的二甲基甲酰胺(dmf)中，氮气保护，搅拌4小时，透析，冻干命名为改性壳聚糖a。(7)将壳聚糖(0.6mm)、对醛基苯甲酸(6.7mm)、4-二甲氨基吡啶(dmmap)(0.7mm)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)(12mm),加入60ml二氯甲烷中，氮气保护，反应48小时，5％盐酸、碳酸氢钠、氯化钠清洗3次，旋转蒸发，命名为中间体a。(8)将中间体a、地西他滨(0.66mm)、三乙醇胺(tea)(3.24mm)，加入20ml的二甲基亚砜中氮气保护，反应48小时，透析，冻干，命名为改性壳聚糖b。(9)将改性壳聚糖a、b和羧甲基壳聚糖，按40：40：20的质量比，制备成1mg/ml的溶液，充分搅拌30mins后,滴加溶液e，磁力搅拌孵育12hr，12000rpm离心30分钟，去离子水复溶，采用0.2微米滤膜滤菌，15000rpm离心5mins，弃上清，制备成冻干粉。使用前将其溶于水相溶液中(培养基/生理盐水)，然后采用通入医用氧气的方式对其进行氧装载，通过红外、紫外、扫描电镜和粒径分析仪进行验证。本发明的另一个目的是提供所述的地西他滨纳米载体(cndhnnps)在制备肿瘤荧光成像剂中的应用。所述肿瘤优选肾癌。本发明的载体应用于增敏奥沙利铂在治疗低氧介导的耐药性肾癌，并验证其肿瘤荧光成像效果。通过以下步骤实现：(1)在769-p细胞中加入一定浓度的多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)，在低氧与常氧条件下孵育一定时间，将细胞用pbs缓冲液洗两次，加入甲醇固定15min。加入0.5μmol/l4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色液室温避光作用15min。将染色后的细胞置于倒置荧光显微镜下观察。(2)在769-p和os-rc-2细胞中加入一定浓度的多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)，以及奥沙利铂终浓度为9.5nm-11nm，在低氧下孵育一定时间，加入0.5mg/mlmtt继续孵育4h。加入200μl二甲基亚砜孵育10min，酶标仪570nm处读取吸光度值。吸光度值越小，细胞成活量越低，表明待测药物奥沙利铂毒性越大。(3)在769-p细胞中加入一定浓度的多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)，在低氧与常氧条件下孵育一定时间，提取细胞总rna，通过rt-rcr仪测定基因的表达。(4)在769-p细胞加入一定浓度的多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)，在低氧与常氧条件下孵育一定时间，提取细胞蛋白，通过western-blot技术测定基因的蛋白表达。(5)通过实验动物小鼠，在注射一定浓度的多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)，通过小动物活体成像技术，考察荧光成像效果。(6)在注射一定浓度的多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)及奥沙利铂后，考察其抗肿瘤能力。本发明的积极效果是：(1)通过实现氧气释放缓解肿瘤低氧，逆转低氧介导的肾癌多耐药性，通过抑制hif-1α和多耐药性基因mdr1的表达，进而降低药物外排转运蛋白p-gp的表达，实现增敏效果。(2)通过表观遗传学药物地西他滨的释放，实现slc22a2启动子区域的去甲基化，增加oct2的表达，增强肾细胞癌对化疗药物奥沙利铂的摄取实现增敏效果。(3)在实验动物上实现增敏奥沙利铂在治疗低氧介导的耐药性肾癌效果。(4)本发明构建的多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)具有肿瘤荧光成像的效果。附图说明图1a是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)的透射电镜图。图1b是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)的粒径分析图。图2是低氧诱导因子hif-1α和多耐药性基因mdr1的转录表达。图3是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)有效实现氧输送缓解低氧微环境，标尺20μm。图4是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)降低药物外排转运体p-gp的蛋白表达效果。图5是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)增加有机阳离子转运体oct2的表达。图6是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)增加有机阳离子转运体oct2蛋白表达的免疫荧光成像。图7是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)增加抗癌药物奥沙利铂的生物蓄积。图8是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)的吸收光谱。图9是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)对谷胱甘肽及半胱氨酸的荧光特异性识别，分别在(a)380nm(nbd)、(c)410nm(血红蛋白)、(e)580nm(尼罗红)有吸收，通过与5-25nm的gsh与cys共孵育，表明cndhnnps的上修饰的nbd可与(b、d)gsh与(a、c)cys特异性反应，分别导致荧光猝灭及绿色荧光增强作用，为后续的肿瘤荧光成像提供条件。图10是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)与多种氨基酸的反应荧光发射强度情况，其中(a)激发波长380nm。(b)激发波长410nm。(c)激发波长580nm。1.ala2.asp3.glu4.ile5.phe6.ser7.thr8.val9.pro10.gsh11.tyr12.leu13.met14.cys。图11是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)对肾癌细胞进行荧光成像效果。图12是通过ivis荧光活体成像系统考察多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)对小鼠肿瘤的荧光成像效果。图13是荧光共聚焦显微镜下观察肿瘤石蜡切片考察多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)对肿瘤的荧光成像效果。图14是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)引起铁凋亡相关基因的表达增加。图15是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)联用奥沙利铂(终浓度10nm)的细胞毒性。图16是多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)增敏奥沙利铂的体内抗肿瘤效果，其中(a)给药流程图，(b)实验期间各组肿瘤体积增长图，(c)实验结束时各组肿瘤重量，(d)各实验组相对对照组的肿瘤抑制率，(e)各实验组相对对照组的肿瘤生长率，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。具体实施方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例11.1多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)的制备及表征(1)先以牛血红蛋白为基础，溶于水中，配制成10g/l的血红蛋白溶液，命名为溶液a。(2)再取适量的聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga溶于乙酸乙酯中，制备成18mg/ml的溶液，命名为溶液b。(3)取适量尼罗红，配制成1g/l溶液，命名为溶液c。(4)取400ul溶液a和溶液c，置于10ml离心管中，4℃冷冻超声滴加2ml溶液b,使用漩涡振荡器混匀，在超声波破碎仪中冰浴超声3mins，间隔20s，所得溶液经减压冷冻旋转蒸发仪，去除有机溶剂，使用离心机离心10000rpm，10mins，弃上清，使用蒸馏水洗涤3次后，使用冻干机冷冻干燥，加去离子水复溶后，得溶液d。(5)将溶液d加入1％的聚乙烯醇(pva)和普朗尼克f68(pluronicf68)的水溶液中，聚乙烯醇(pva)与普朗尼克f68(pluronicf68)的体积比为7：3，10000rpm离心10mins，弃上清，去离子水复溶，所得溶液命名为溶液e，(6)将壳聚糖(分子量为62060.98mw)(0.2mm)、nbd-cl(0.2mm)、三乙胺(0.6mm)，加入5ml的dmf中，氮气保护，搅拌4小时，透析，冻干命名为改性壳聚糖a。(7)将壳聚糖(0.6mm)、对醛基苯甲酸(6.7mm)、4-二甲氨基吡啶(0.7mm)和edc(12mm),加入60ml二氯甲烷中，氮气保护，反应48小时，5％盐酸、碳酸氢钠、氯化钠清洗3次，旋转蒸发，命名为中间体a。(8)将中间体a、地西他滨(0.66mm)、三乙醇胺(3.24mm)，加入20ml的二甲基亚砜中氮气保护，反应48小时，透析，冻干，命名为改性壳聚糖b。(9)将改性壳聚糖a、b和羧甲基壳聚糖，按40：40：20的质量比，制备成1mg/ml的溶液，充分搅拌30mins后,滴加溶液e，磁力搅拌孵育12hr，12000rpm离心30分钟，去离子水复溶，采用0.2微米滤膜滤菌，15000rpm离心5mins，弃上清，制备成冻干粉。使用前将其溶于水相溶液中(培养基/生理盐水)，然后采用通入医用氧气的方式对其进行氧装载。取适量cndhnnps，去离子水重悬，滴至透射电镜铜网上，采用2％磷钨酸溶液染色1分钟，吸去多余的染色液，晾干，通过透射电镜观察(图1a)。取适量cndhnnps，去离子水重悬，加入1.5ml的比色皿，使用粒径分析仪进行检测(图1b)。实施例2多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)逆转低氧介导的多耐药性2.1降低低氧诱导因子hif-1α及其介导的耐药性基因mdr1的表达(1)将肾细胞癌769-p的低氧模型，与多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)共孵育48小时，使用用总rna提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)按照说明书从冰冻人肝组织中提取细胞总rna，采用核酸蛋白测定仪测定rna的浓度和纯度，用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)将总rna逆转录成cdna。(2)根据人hif-1α、mdr1的dna序列设计两条rtpcr引物。hif-1α引物1)forward:5’-tcaccacaggacagtacaggatgc-3’242)reverse:5’-ccagcaaagttaaagcatcaggttcc-3’26mdr1引物3)forward:5’-gaggaagacatgaccaggtatgc-3’234)reverse:5’-gtgttaagctccccaacatcg-3’21gapdh引物5)forward:5’-aggtgaaggtcggagtca-3’186)reverse:5’-ccttcttgccagtcttttag-3’20以cdna为模版进行rtpcr，反应体系和反应条件如下：cdna1μl5×sybrpremix5μlroxdye1μlprimer2μl灭菌水2μl基因定量用microsoftexcel进行计算：内参基因gapdh(referencegene)的表达量设为1，目的基因(targetgene)的相对表达量为2ctr-ctt。(3)采用prism5(graphpadsoftwareinc)进行作图分析。如图2所示，通过cndhnnps的处理，使得低氧感应因子hif-1α及多耐药基因下降，表明多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)缓解低氧及其介导的多耐药性问题。2.2缓解肾癌低氧微环境(1)在细胞爬片上培养肾细胞癌769-p的低氧模型，更换无血清培养基加入荧光氧探针[ru(dpp)3]cl2(10μg/ml)，加入多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)继续培养24小时。(2)移除培养基，1×pbs洗3次，加入4％甲醛固定15分钟，1×pbs洗3次，dapi染细胞核10分钟，1×pbs洗3次，取爬片，晾干。(3)采用放荧光猝灭封片液，制备装片，在荧光共聚焦显微镜下观察。(见图3)，荧光氧探针[ru(dpp)3]cl2的荧光强度随着cndhnnps的应用而减少，表明多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)可以有效实现氧输送，缓解低氧微环境。2.3降低药物外排转运蛋白p-gp的表达(1)将肾细胞癌769-p的低氧模型，与多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)共孵育48小时，使用ripa裂解液，预加入蛋白酶抑制剂pmsf(1mm)、leupeptin(0.5μg/l)、pepstatin(0.7μg/l)。收集细胞，加入裂解液，涡旋，4℃旋转2小时，13000rpm离心13分钟，取上清。(2)蛋白质浓度测定采用紫外分光光度计od280读数进行相对定量，将蛋白液浓度调整为相同。进行sds-page蛋白电泳。电泳胶体系如下表1：表1向组织蛋白液内加入1/4体积的5×sdsloadingbuffer(dtt50mmol/l)，煮沸5分钟，冷却离心，12000rpm，5分钟，取上清，上样，每孔5μl。电泳条件：90v，30min；120v，2h。(3)取大小合适的pvdf膜，甲醇预润1分钟，浸泡于电转液中。海绵、滤纸也预先浸泡在电转液中。电泳结束后，取出凝胶，浸泡于电转液中。下述物品按照从负极(黑)至正极(红)的顺序组装成转印夹层：海绵、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵。将装好的转印夹层置于充满电转液的转印槽内，冰浴下200ma电转2h。(4)转膜结束后，取出pvdf膜，用1×tbst洗涤，5分钟3次。而后置于封闭液中室温下封闭1h。分别加入anti-p-gp及anti-gapdh抗体，4℃孵育过夜。次日，用1×tbst洗涤，5分钟3次。然后加入donkeyanti-rabbit及goatanti-mouse荧光二抗，室温下孵育1h。再经1×tbst洗膜，5分钟3次。选择800nm荧光通道对oct2和gapdh进行扫描成像(图4)。实施例3多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)增加药物摄取转运体oct2的表达,增敏奥沙利铂抗多耐药肾癌的效果3.1增加阳离子药物转运体oct2的表达(1)将肾细胞癌769-p的低氧模型，与多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)共孵育48小时，使用用总rna提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)按照说明书从冰冻人肝组织中提取细胞总rna，采用核酸蛋白测定仪测定rna的浓度和纯度，用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)将总rna逆转录成cdna。(2)根据人ssl22a2的dna序列设计两条rt-pcr引物。oct2引物7)forward:5’-aagaatggggatcacaatgg-3’208)reverse:5’-agatgtggacgccaagattc-3’20反应体系，及计算如1.1，具体数据见图5。(3)将肾细胞癌769-p的低氧模型，与多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)共孵育48小时，使用ripa裂解液，预加入蛋白酶抑制剂pmsf(1mm)、leupeptin(0.5μg/l)、pepstatin(0.7μg/l)。收集细胞，加入裂解液，涡旋，4°旋转2小时，13000rpm离心13分钟，取上清。进行sds-page蛋白电泳，体系和操作如1.3(图5)。(4)细胞用4％多聚甲醛固定，1×pbs三次洗涤。然后用pbst(1×pbs/0.1％triton)处理10min，用1×pbs冲洗3次，每次5min。室温下用密封液密封细胞1h。加入抗oct2(1:200，1μ/ml)(abcam)或兔igg(1μ/ml)(sigma)，室温孵育2小时，pbst三次洗涤细胞，每次10分钟。随后的避光操作。加入alexa-fluor488donkey(分子探针)或抗兔igg(santacruz)，室温孵育30min，1×pbs洗涤3次，每次10min。加入1×pbs(含1μm/ml胸液)，室温孵育10min，1×pbs洗涤细胞10min，制成显微镜玻片进行免疫荧光成像(图6)。表明多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)可以有效增加阳离子转运体oct2的表达。3.2增加的oct2转运体增加对铂离子抗癌药物奥沙利铂的摄取icp-ms检测细胞内铂离子的蓄积,样品在通风橱中进行了icp-ms预处理。用1×pbs洗涤细胞两次，细胞刮刀收集，移入5ml玻璃离心管。浓硝酸与过氧化氢的比例为1:2，用耐酸垫圈覆盖，80℃水浴振荡消解(1hr)。冷却至室温，用体积氨水中和。加入超纯水稀释至10ml，0.2μm滤膜去除杂质，icp-ms工作参数如下表2，结果见图7。表2实施例4多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)对谷胱甘肽的特异性识别及消耗4.1多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)对谷胱甘肽及半胱氨酸的荧光特异性识别(1)多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)的吸收光谱由紫外可见吸收光谱仪测定。分别与5-25nm的gsh和cys共孵育，在吸收峰波长下测定荧光强度(图8)。(2)将丙氨酸(ala)，天冬氨酸(asp)，谷氨酸(glu)，异亮氨酸(ile)，苯丙氨酸(phe)，丝氨酸(ser)，苏氨酸(thr)，缬氨酸(val)，脯氨酸(pro)，谷胱甘肽(gsh)，酪氨酸(tyr)，亮氨酸(leu)，甲硫氨酸(met)，半胱氨酸(cys)各25nm，与cndhnnps共孵育，4小时，在酶标仪上测定荧光强度(ex：380，410，580nm)。见图9，表明其对cys具有特异性荧光识别作用，产生绿色荧光(图10)。4.2多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)对谷胱甘肽及半胱氨酸的特异性识别在肿瘤荧光成像效果中的应用。(1)多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)与肾细胞癌769-p，及gsh(25nm)、cys(25nm)预处理的细胞共孵育，12小时，移除培养基，1×pbs洗3次4％多聚甲醛固定，1×pbs三次洗涤，dapi染细胞核10分钟，1×pbs洗3次，荧光共聚焦显微镜观察(图11)。在高表达gsh的肾癌细胞中，cndhnnps显示荧光猝灭，而在凋亡染色质碎片中，及cys预处理对照中显示绿色荧光。图11中肾细胞癌gsh高表达导致阳性对照(gsh，25nm)出现暗荧光，而在一些凋亡细胞染色质片段中，阴性对照也出现绿色荧光，表明cndhnnps具有肿瘤荧光成像效果，标尺20μm。(2)多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)采取静脉注射的方式，对荷瘤裸鼠进行给药，在12小时后，通过ivis荧光活体成像系统对荧光肿瘤成像进行考察(图12)，图12为活体成像实验(光谱)显示cndhnnps的发射荧光集中在肿瘤周围形成环状结构，(ex:400nm)进一步研究共定位参考尼罗红，肿瘤核心(ex:580nm)出现强荧光，提示cndhnnps在肿瘤中积聚和消耗了高表达的gsh。(3)对静脉注射多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)的荷瘤裸鼠，进行安乐死，取瘤块，石蜡包埋，切片，荧光显微镜下考察荧光成像效果(图13)，图13为在荧光共聚焦显微镜下观察肿瘤石蜡切片，nil-red的红色荧光不仅出现在肿瘤中心，也出现在癌旁组织，而ndb-cys的绿色荧光仅出现在癌旁组织中，表明cndhnnps具有肿瘤荧光成像效果标尺50μm。实施例5多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)诱导铁凋亡增敏奥沙利铂对耐药性肾癌的治疗效果5.1铁凋亡相关基因的表达将肾细胞癌769-p的低氧模型，与多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)共孵育48小时,使用用总rna提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)按照说明书从冰冻人肝组织中提取细胞总rna，采用核酸蛋白测定仪测定rna的浓度和纯度，用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)将总rna逆转录成cdna。计算如1.1(图14)。表1rt-pcr引物序列acsl4引物9)forward:5’-attcttctccgcttacactc-3’2010)reverse:5’-ccttcttgccagtcttttag-3’20cox2引物11)forward:5’-ccacttcaagggagtctgga-3’2012)reverse:5’-aagggccctggtgtagtagg-3’20结果表明,多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)载体处理后，细胞铁凋亡相关基因acsl4和cox2表达上升，说明多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)消耗gsh进而诱导铁凋亡。5.2多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)联合奥沙利铂的细胞毒性mtt法检测cndhnnps联合奥沙利铂的毒性作用。首先，将os-rc-2和769-p细胞系分别接种在两个48孔板中，密度分别为1×102细胞/孔(n＝5)。低氧条件下新鲜培养基24h生长情况。取出培养基，用1×pbs洗涤。实验组在低氧条件下，以不同浓度的cndhnnps治疗，在72h内用ohp(10μm)的最佳剂量，对照组用0.1％dmso处理席。然后用mtt法测定细胞活力。培养基以新鲜培养基代替，每席添加40μg1g/lmtt，低氧37℃培养4h。去除mtt培养基，用100μml二甲基亚砜溶解福尔马赞，其中50μl于96孔板中通过酶标仪595nm分析(图15)。5.3多功能的地西他滨纳米载体(cndhnnps)增敏奥沙利铂的体内抗癌作用6周龄雄性balb/c-nu小鼠由上海slack实验动物有限公司订购。所有动物实验方案均经浙江大学药物科学学院伦理委员会批准。rcc细胞os-rc-2在生理盐水中重悬，皮下注射于裸鼠右侧(1×107细胞)。当肿瘤体积达到90-100mm3时开始实验。cndhnnps联合ohp组(2.2 10mg/kg)、奥沙利铂(ohp)组(10mg/kg)、dac组(3.3mg/kg)和对照组(生理盐水)。具体给药时间见图16中的图a.记录瘤块生长情况，当实验结束，对各组进行安乐死，取瘤块，称重，计算抑制率。cndhnnps联合ohp组具有较强的抑瘤作用，相对肿瘤生长率(t/c)为9.69％，抑瘤率为89.93％(图16中的图d)。相比之下，ohp组和dac组的相对肿瘤生长率(t/c)分别高达59.6％和65.2％，高于40％的有效标准(图16中的图e)。序列表<110>浙江大学<120>地西他滨纳米载体及在制备肿瘤荧光成像剂中的应用<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>1tcaccacaggacagtacaggatgc24<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>2ccagcaaagttaaagcatcaggttcc26<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>3gaggaagacatgaccaggtatgc23<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>4gtgttaagctccccaacatcg21<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>5aggtgaaggtcggagtca18<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>6ccttcttgccagtcttttag20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>7aagaatggggatcacaatgg20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>8agatgtggacgccaagattc20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>9attcttctccgcttacactc20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>10ccttcttgccagtcttttag20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>11ccacttcaagggagtctgga20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>12aagggccctggtgtagtagg20当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种地西他滨纳米载体，其特征在于，所述载体通过以下制备步骤实现：
(1)将牛血红蛋白溶于水中，配制成10g/l的血红蛋白溶液，命名为溶液a；
(2)取聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga溶于乙酸乙酯中，制备成18mg/ml的溶液，命名为溶液b；
(3)取尼罗红，配制成1g/l溶液，命名为溶液c；
(4)取溶液a和溶液c，置于10ml离心管中，4℃冷冻超声滴加溶液b,使用漩涡振荡器混匀，在超声波破碎仪中冰浴超声3分钟，间隔20秒，所得溶液经减压冷冻旋转蒸发，离心，弃上清，用蒸馏水洗涤3次后，使用冻干机冷冻干燥，加去离子水复溶后，得溶液d；
(5)将溶液d加入1％的聚乙烯醇和普朗尼克f68的水溶液中，聚乙烯醇与普朗尼克f68的体积比为7：3，10000rpm离心10mins，弃上清，去离子水复溶，所得溶液命名为溶液e；
(6)将壳聚糖、硝基苯并恶二唑-cl、三乙胺，加入二甲基甲酰胺中，氮气保护，搅拌4小时，透析，冻干命名为改性壳聚糖a；
(7)将壳聚糖、对醛基苯甲酸、对二甲氨基吡啶和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,加入二氯甲烷中，氮气保护，反应48小时，5％盐酸、碳酸氢钠、氯化钠清洗3次，旋转蒸发，命名为中间体a；
(8)将中间体a、地西他滨、三乙醇胺，加入的二甲基亚砜中氮气保护，反应48小时，透析，冻干，命名为改性壳聚糖b；
(9)将改性壳聚糖a、b和羧甲基壳聚糖，按40：40：20的质量比，制备成1mg/ml的溶液，充分搅拌30mins后,滴加溶液e，磁力搅拌孵育12小时，离心30分钟，去离子水复溶，采用0.2微米滤膜滤菌，离心，弃上清，制备成冻干粉，使用前将其溶于水相溶液中，然后采用通入医用氧气的方式对其进行氧装载，水相溶液为培养基/生理盐水。
2.根据权利要求1所述的一种地西他滨纳米载体，其特征在于，步骤(6)所述壳聚糖的分子量为62060.98mw。
3.权利要求1所述的地西他滨纳米载体在制备肿瘤荧光成像剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)在769-p细胞中加入一定浓度的地西他滨纳米载体，在低氧与常氧条件下孵育，将细胞用pbs缓冲液洗两次，加入甲醇固定，加入0.5μmol/ldapi染色液室温避光作用15min，将染色后的细胞置于倒置荧光显微镜下观察；
(2)在769-p和os-rc-2细胞中加入地西他滨纳米载体，以及奥沙利铂终浓度为9.5nm-11nm，在低氧下孵育，加入0.5mg/mlmtt继续孵育，加入200μldmso孵育10min，酶标仪570nm处读取吸光度值，吸光度值越小，细胞成活量越低，表明待测奥沙利铂毒性越大；
(3)在769-p细胞中加入地西他滨纳米载体，在低氧与常氧条件下孵育，提取细胞总rna，通过rt-rcr仪测定基因的表达；
(4)在769-p细胞加入地西他滨纳米载体，在低氧与常氧条件下孵育，提取细胞蛋白，通过western-blotting技术测定基因的蛋白表达；
(5)通过实验动物小鼠，注射多功能的地西他滨纳米载体，通过小动物活体成像技术，考察荧光成像效果；
(6)在注射地西他滨纳米载体及奥沙利铂后，考察其抗肿瘤能力。
技术总结本发明提供地西他滨纳米载体及在制备肿瘤荧光成像剂中的应用。采用复乳法制备，牛血红蛋白、荧光染料尼罗红、聚乳酸‑羟基乙酸共聚物等进行乳化，再包裹载有地西他滨的壳聚糖，NBD修饰的壳聚糖，除菌，制成冻干粉。使用前溶于水相，进行氧装载。本发明基于769‑P和OS‑RC‑2肾癌细胞系，并构建低氧细胞模型和荷瘤小鼠模型。结果表明，CNDHNNPs改善缺氧微环境，减少药物外排，地西他滨增加肿瘤化疗药物摄取，增敏化疗。并催化增加脂质过氧化，结合铁凋亡治疗。本发明为肾癌治疗提供了靶向肿瘤低氧及高甲基化结合铁死亡的新方案和药物递送体系并实现肿瘤荧光成像。本发明设计合理，重复性强。
技术研发人员：曾苏;王泽阳;余露山
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2020.03.16
技术公布日：2020.06.09
