本发明属于整形美容技术领域，具体涉及一种富血小板血浆（prp）的软组织填充剂及其制备方法。
背景技术：
随着生活水平的提高，人们对气质外形的要求越来越高，抗皱已成为越来越多人的需求。人们在追求美的同时对相关产品的安全性也有了更高的要求。传统的皮下注射玻尿酸可以实现暂时的除皱，但是效果并不能够持久，一但植入材料降解，皱纹及凹陷又会重新出现。
自体脂肪，因来源于自体组织，不存在免疫排斥风险，具有良好的相容性，被认为是最理想的整形移植物，但脂肪移植后最大的问题是存活率太低，易发生脂肪液化，效果维持时间短，严重限制了脂肪移植的应用。近年来，人们发现，细胞生长因子可以促进自身胶原纤维再生，但体内的因子容易被降解，短时间内起不到促进组织再生的功能。自体富血小板血浆（prp）是自体血小板的浓缩体，含有丰富的血小板，其所含的多种生长因子，其比例与体内正常比例相似，有助于促进骨、软骨的缺损修复，引导软组织再生及预防感染等，被广泛应用于各种外科手术、心脏手术以及整形手术。血小板中的大量生长因子，如血小板衍生生长因子（pdgf）、转化生长因子-β(tgf-β)、胰岛素样生长因子（igf）、表皮生长因子（egf）、血管内皮生长因子（vegf）、成纤维细胞生长因子（fgf）等，这些生长因子能精确的自我定位到损伤部位，控制炎症，从不同方面对细胞和组织再生起到促进作用，从而加速损伤组织的修复。近些年该技术已被广泛应用于整形美容行业，并且效果也得到求美者的认可，但是人们也同时发现单独应用prp的效果并不持久。
中国专利cn104739862a公开了一种prp与svf的混合物，将两者直接进行混合，用于美容注射填充。这种组合物相较单纯使用prp可以提高一定的填充效果，但prp不能为svf提供可可靠的三维生长空间，细胞成活率低，皱纹修复持续时间短。另外，该发明的prp来源为脐带血，并非自体血液，也存在病毒传播和免疫排斥的风险。
综合来看，目前，美容注射填充材料方面，单纯透明质酸钠填充剂、自体脂肪移植填充、以及自体脂肪提取物与prp混合的填充物均有应用，整体注射美容市场鱼龙混杂，但真正相容性好、维持时间长、并发症少的产品并不多。结合求美者的诉求，市场亟需一种安全性高、相容性好、持效时间长的注射美容填充产品。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了一种富血小板血浆（prp）的软组织填充剂，克服了传统单纯透明质酸及prp填充持续时间短或促进组织再生能力差的缺点。同时还提供了该填充剂的制备方法。
本发明的一个技术方案是，该软组织填充剂包括自体prp、自体svf和支架材料；所述支架材料为机体可接受的生物可降解材料或自体成分。
本发明所述svf为脂肪组织中血管基质成份（stromalvascularfraction），是一个细胞混合体，包括基质细胞，高浓度的脂肪干细胞，血管内皮细胞、白细胞和红细胞等血细胞，能够促进周围环境的生长因子如：pdgf、egf、fgf、vegf、igf等分泌，从而促进血管新生作用，提高了各种细胞的存活率；另一方面，svf具有免疫调节的作用，能够降低炎症反应。
本发明所述支架材料可以选择已商品化的产品或自行制备，其材质为机体可接受的生物可降解材料或自体成分，包括胶原、透明质酸、透明质酸钠、聚乳酸、羟基磷灰石、自体脂肪的任一种或是几种的组合。
所述支架材料均为临床常用注射填充材料，安全可靠。支架材料的使用，能为新生细胞提供支撑和空间，便于细胞生长及新生血管的长入；移植初期，支架材料能起到很好的辅助付型作用，随着支架材料的代谢吸收，新生组织将填充其原有的空间，提高整体的填充效果和组织成活率。
优选的，每10ml软组织填充剂中，自体svf的活细胞数量为106-107；血小板的数量为105-107；自体prp和自体svf的体积比为1:1，支架材料的体积是自体prp和自体svf总体积的1-4倍。
本发明另一个技术方案是，上述软组织填充剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，自体prp的制备
取自体血液，加入抗凝剂，然后在200-450×g（离心力）离心6~10min；吸取上层血浆于新离心管中，650-1200×g二次离心5－9min，将沉淀重悬于剩余血浆中即得prp。
步骤2，自体svf的制备
将抽取的脂肪组织于室温条件下静置，去除液体部分，加等体积生理盐水进行清洗，1000-1500r/min、21℃离心3-10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再加入等体积生理盐水配置的胶原酶溶液，恒温震荡消化30-60min，收集消化液，500-1200r/min、21℃离心5-10min，去除上清，取细胞沉淀，再加入生理盐水，500-1500r/min，21℃离心5-10min，再次取细胞沉淀，用生理盐水重悬，获得自体svf。
步骤3，加入支架材料
将自体prp、自体svf和支架材料混合即得。
优选地，步骤1所述抗凝剂优选肝素钠、枸椽酸钠中一种或两种混合。
优选地，步骤1所述prp中血小板的数量优选为105-108。
优选地，步骤2所述svf的活细胞总数为106-108。
优选地，步骤2所述胶原酶的酶活力为50-300u/ml，消化时间为25-40min。
优选地，步骤3混合前，先向自体prp中添加cacl2溶液；所述cacl2溶液的浓度为0.05m-2m，添加比例为每1mlprp加入50µlcacl2溶液。
本发明软组织填充剂的支架材料为svf提供可靠的三维生长环境，提高脂肪干细胞成活率，促进脂肪细胞再生，另一方面，支架材料物理占位作用，实现软组织缺损修复；svf通过免疫调节降低炎症反应，分泌各种因子促进血管新生，为修复部位建立血供；prp中的生长因子可以控制炎症，减轻治疗过程中的疼痛，促进皮下胶原蛋白、弹性纤维、胶质的产生，促进组织再生，加速组织的修复。混合物实现组织缺损修复的同时，促进组织再生。
本发明的有益效果是，本发明所获得的软组织填充剂具有注射后易于再血管化、炎症反应轻微，安全可靠的优点，适用于软组织填充、修复软组织缺损造成的凹陷畸形、面部及身体美容塑形。
附图说明
图1是以瑞蓝®2玻尿酸为支架材料，不同制剂大鼠皮下植入26周he切片图（放大倍数100倍），（a）支架 svf prp，（b）支架 prp，（c）支架 svf；
图2是以脂肪为支架材料，不同制剂大鼠皮下植入26周he切片图（放大倍数100倍），（a）支架 svf prp，（b）支架 prp，（c）支架 svf；
图3是以瑞蓝®2玻尿酸为支架材料，混合prp和svf制剂后，大鼠皮下植入26周he切片图；
图4是以脂肪为支架材料，混合prp和svf制剂后，大鼠皮下植入26周he切片图；
图5是混合prp和svf制剂后，大鼠皮下植入26周he切片图；
图6是瑞蓝®2玻尿酸大鼠皮下植入26周he切片图；
图7是脂肪大鼠皮下植入26周he切片图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不限于这些实施方式。
实施例1
步骤一，prp的制备
抽取自体血液20ml，加入抗凝剂枸椽酸钠（3.8%的枸椽酸钠水溶液2.2ml）。首先将全血在250×g离心8min；吸取上层血浆于新离心管中，700×g，二次离心6min；去除部分血浆，将沉淀重悬于剩余血浆中即得prp，体积约1.0ml。prp中血小板数量为8.2×108个。
步骤二，svf的制备
抽取脂肪组织20ml，室温条件下静置20min，除去麻醉过程中的肿胀液，以进一步纯化脂肪，然后去除液体部分，得到15ml的脂肪颗粒；加15ml生理盐水进行清洗，1200r/min，21℃离心6min，去除液体部分，得到10ml固态的脂肪颗粒。加入10ml生理盐水配置的胶原酶溶液（200u/ml），37℃恒温震荡消化40min，收集消化液，1000r/min，21℃离心8min，去除上清，取细胞沉淀，再加入6ml生理盐水，800r/min，21℃离心6min，再次取细胞沉淀，用1ml生理盐水重悬，获得脂肪svf。细胞计数仪进行计数，细胞总数为4.2×107个，细胞成活率为89%，总成活细胞数为3.7×107个。
步骤三，混合制剂
本实施例的支架材料选择已上市的瑞蓝®2注射用修饰透明质酸钠凝胶。
首先向prp中加入0.1mcacl2溶液（每1毫升prp加入50µlcacl2溶液，cacl2用于激活prp形成凝胶），从中取0.5ml，再与0.5ml的svf进行混合，最后与1ml瑞蓝®2透明质酸支架混合，混合过程都采用用鲁尔注射器进行混合。获得的制剂中血小板的数量为4.1×108个，svf的活细胞数量为2.1×107个。
如图1所示，添加支架材料后，植入物周围血运良好，新生血管明显可见。由图3、5、6可以看出，玻尿酸很好的为svf细胞提供了三维空间，局部血运较好，细胞的成活率高；而且随着玻尿酸降解，prp和svf细胞促进周围组织再生效果明显，整体维持时间更久。
实施例2
步骤一，prp的制备
抽取自体血液20ml，加入抗凝剂肝素钠（1%肝素钠溶液0.4ml）。首先将全血在200×g离心10min；吸取上层血浆于新离心管中，800×g，二次离心5min；去除部分血浆，将沉淀重悬于剩余血浆中即得prp，体积约1.0ml。prp中血小板数量为11.4×108个。
步骤二、svf的制备
抽取脂肪组织40ml，室温条件下静置20min，去除液体部分，得到30ml的脂肪颗粒；加30ml生理盐水进行清洗，1200r/min，21℃离心6min，去除液体部分，得到20ml固态的脂肪颗粒。
取10ml固态的脂肪颗粒，再加入10ml生理盐水配置的胶原酶溶液（300u/ml），37℃恒温震荡消化25min，收集消化液，800r/min，21℃离心10min，去除上清，取细胞沉淀，再加入8ml生理盐水，1200r/min，21℃离心5min，再次取细胞沉淀，用2.0ml生理盐水重悬，获得脂肪svf。细胞计数仪进行计数，细胞总数为10.1×107个，细胞成活率为85%，总成活细胞数为8.8×107个。
步骤三，混合制剂
本实施例选择的支架材料为自体脂肪，即为步骤二制备的固体脂肪颗粒。
首先向prp中加入0.1mcacl2溶液（每1毫升prp加入50µlcacl2溶液），从中取0.5ml，与0.5ml的svf进行混合，最后与4ml自体脂肪颗粒进行混合，混合过程都采用用鲁尔注射器进行混合。获得的制剂中血小板的数量为5.7×108个，svf的活细胞数量为2.5×107个。
如图2所示，支架材料为svf提供了细胞生长的三维空间。由图4、图5和图7可以看出，以纯化脂肪作为支架的材料，脂肪细胞的成活率更高，炎症反应程度较轻，体内维持时间更持久，提升了脂肪填充效果。
1.一种富血小板血浆的软组织填充剂，其特征在于，包括自体prp、自体svf和支架材料；所述支架材料为胶原、透明质酸、透明质酸钠、聚乳酸、羟基磷灰石、自体脂肪的任一种或是几种的组合物。
2.根据权利要求1所述的富血小板血浆的软组织填充剂，其特征在于，所述支架材料为透明质酸钠或自体脂肪。
3.根据权利要求2所述的富血小板血浆的软组织填充剂，其特征在于，每10ml所述软组织填充剂中，自体svf的活细胞数量为106-107；血小板的数量为105-107；自体prp和自体svf的体积比为1:1，支架材料的体积是自体prp和自体svf总体积的1-4倍。
4.一种如权利要求1所述的富血小板血浆的软组织填充剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，自体prp的制备
取自体血液，加入抗凝剂，然后在200-450×g离心6-10min；吸取上层血浆于新离心管中，650-1200×g二次离心5-9min，将沉淀重悬于剩余血浆中即得自体prp；
步骤2，自体svf的制备
将抽取的脂肪组织于室温条件下静置，去除液体部分，加等体积生理盐水进行清洗，1000-1500r/min、21℃离心3-10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒；再加入等体积生理盐水配置的胶原酶溶液，恒温震荡消化30-60min，收集消化液，500-1200r/min、21℃离心5-10min，去除上清，取细胞沉淀，再加入生理盐水，500-1500r/min，21℃离心5-10min，再次取细胞沉淀，用生理盐水重悬，获得自体svf；
步骤3，加入支架材料
将自体prp、自体svf和支架材料混合即得。
5.根据权利要求4所述的富血小板血浆的软组织填充剂的制备方法，其特征在于，步骤1所述抗凝剂优选肝素钠、枸椽酸钠中一种或两种混合。
6.根据权利要求4所述的富血小板血浆的软组织填充剂的制备方法，其特征在于，步骤1制备得到的所述自体prp中血小板的数量为105-108。
7.根据权利要求4所述的富血小板血浆的软组织填充剂的制备方法，其特征在于，步骤2制备得到的所述自体svf的活细胞总数为106-108。
8.根据权利要求4所述的富血小板血浆的软组织填充剂的制备方法，其特征在于，步骤2所述胶原酶的酶活力为50-300u/ml，消化时间为25-40min。
9.根据权利要求4所述的富血小板血浆的软组织填充剂的制备方法，其特征在于，步骤3所述支架材料为透明质酸钠或自体脂肪。
10.根据权利要求4所述的富血小板血浆的软组织填充剂的制备方法，其特征在于，步骤3混合前，先向所述自体prp中添加cacl2溶液；所述cacl2溶液的浓度为0.05m-2m，，添加比例为每1mlprp加入50µlcacl2溶液。
技术总结