本发明涉及组织工程与再生医学领域，特别是涉及一种可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架及其制备方法。
背景技术：
创面损伤是临床上常见的高发疾病，它不但危害着患者的健康，同时也严重影响着患者的生活质量。随着生活水平的不断提高，人们不仅希望创面得到迅速覆盖以减少并发症的发生，更希望创面能恢复原有的外形和功能，达到组织的完美修复与再生。而要达到组织的完美修复，就必须实现损伤部位多种组织细胞的同步再生。现阶段，基础研究领域的相关学者们通过利用多种小分子化合物、转录因子等对体细胞进行重编程；诱导重编程多能干细胞(ips)以及利用组织工程3d打印构建组织修复生物材料已经在再生医学方面取得了长足的进展。但同时也应该看到，再生医学的发展离组织损伤的完美修复与再生的目标还有差距，离患者的要求还有距离。
生物玻璃是一种人造生物材料，它能于人体组织进行有机联合，具有较好的生物相容性。随着研究的不断深入，目前纳米生物玻璃已经在牙科、骨骼修复、药物载体以及创面修复领域广泛应用。但它同时具有机械强度较低、脆性大等缺点。明胶是胶原部分水解后得到的产物，因此具有其他合成材料无法比拟的生物相容性及生物活性；而且因为其独特的理化性质，明胶广泛应用于生物材料领域。现有的采用生物玻璃或明胶的单一材料的活性支架无法满足不同细胞生长的需求；并且现有组织修复支架大多单层多孔，组织容易长入，防黏连效果长，不同侧组织的侵入抑制修复过程，导致治疗效果下降。
技术实现要素：
本发明的目的在于提出一种可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架，为通过不同的材料配比和空间形态构建的具有促进创面组织同步修复的生物活性支架。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案：
一种可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架，包括至少两个立体空间形态堆叠或拼接形成的生物活性支架；每一所述立体空间形态所采用的支架材料均不相同，且至少包括生物医用高分子水凝胶；所述生物活性支架组装后均通过交联剂交联并洗涤。
在一些改进方案中，所述生物活性支架为采用上下堆叠方式形成的双层立体空间形态、多层立体空间形态。
一个改进方案中，所述生物活性支架为上下堆叠的双层圆柱体形态，其中上层圆柱体采用15-25％wt的明胶溶液制成，下层圆柱体采用15-25％wt的明胶溶液和3-10％wt的硅酸盐生物玻璃混合制成。
另一个改进方案中，所述生物活性支架为上下堆叠的三层柱体形态，其中上层柱体采用20-30％wt的壳聚糖溶液和15-25％wt海藻酸钠溶液混合制成，孔径率为60-90％；中层柱体采用20-30％wt的壳聚糖溶液制成，孔径率为0-20％；下层柱体采用20-30％wt的壳聚糖溶液、15-25％wt海藻酸钠溶液和3-10％wt的硅酸盐生物玻璃，孔径率为60-90％。
本发明还公开了一种可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架的制备方法，包括下述步骤：
1)根据创面组织类型的不同设计支架的空间形态及材料配比；
2)使用所选取的材料配比制备各个立体空间形态的溶液，在低温环境中制得凝胶状态的各个立体空间形态；
3)将凝胶状态的各个立体空间形态组装为一体结构，获得初始生物活性支架；
4)在获得的初始生物活性支架上倒入交联剂溶液，初始生物活性支架进行交联，并洗涤；
5)使用冷冻干燥机冻干洗涤后的生物活性支架，去除水分，即得所述生物活性支架。
本发明提供的一种可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架及其制备方法具有以下优点：
采用的生物支架具有空间形态及材料配比的多样性，可根据创面的组织类型及形态不同选择不同的材料配比及空间形态，从而更好的促进创面组织同步修复再生。
本发明还设置具有夹层结构的生物活性支架，在夹层两侧的支架促进不同组织修复，层间连接紧密，通过夹层结构作为屏障可避免两侧组织的相互侵入，可以更好地模拟组织细胞生长所需的三维培养空间，更有利于不同组织的功能维持。
本发明提出利用不同的材料配比及不同的空间形态来构建生物活性支架，对应不同组织修复再生的需求，从而更好的促进创面组织同步修复与再生，给再生医学和组织工程学提供了新的视角。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简要介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实施例中双层立体结构的生物活性支架；
图2为实验例的双层生物活性支架接种小鼠成纤维细胞的荧光图；
图3为实验例的三层生物活性支架接种小鼠成纤维细胞的荧光图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
一种可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架，包括至少两个立体空间形态堆叠或拼接形成的生物活性支架；每一所述立体空间形态所采用的支架材料均不相同，且至少包括生物医用高分子水凝胶；所述生物活性支架组装后均通过交联剂交联并洗涤。
所述生物医用高分子水凝胶包括明胶、海藻酸钠、壳聚糖、琼脂糖、结冷胶、丝素蛋白、胶原蛋白或透明质酸中的一种或两种以上的组合。其中至少一个的所述生物活性支架的立体空间的支架材料还包括硼硅酸盐生物玻璃、硅酸盐生物玻璃、钙磷酸盐生物玻璃、生物活性玻璃、生物陶瓷、活性微量元素以及聚丙烯酰胺中的一种或两种以上的组合。
所述生物活性支架为采用上下堆叠方式形成的双层立体空间形态、多层立体空间形态。或者，通过不同部分环绕同一轴线拼接而成的，如散射状态的五角星立体结构或其他。需要说明的是，该生物活性支架根据不同的创面位置设置不同形态结构以更好的配合待修复部位。
对应上述生物活性支架的制备方法，包括下述步骤：
1)根据创面组织类型的不同设计支架的空间形态及材料配比；
2)使用所选取的材料配比制备各个立体空间形态的溶液，在低温环境中制得凝胶状态的各个立体空间形态；
3)将凝胶状态的各个立体空间形态组装为一体结构，获得初始生物活性支架；
4)在获得的初始生物活性支架上倒入交联剂溶液，初始生物活性支架进行交联，并洗涤；
5)使用冷冻干燥机冻干洗涤后的生物活性支架，去除水分，即得所述生物活性支架。
下面根据本发明技术方案做详细的实施例说明。
实施例1
所述生物活性支架为上下堆叠的双层圆柱体形态，如图1所示；
上层圆柱体采用15％wt的明胶溶液制成；
下层圆柱体采用15％wt的明胶溶液和3％wt的硅酸盐生物玻璃混合制成；
制备方法包括下述步骤：
10)制备上层圆柱体液体：取重量比为1:15-25的明胶与去离子水混合，在37℃情况下震荡两小时，使得明胶完全融合并且均匀分散，然后室温下放置两小时，使其气泡完全排出；随后经巴氏消毒法消毒，得到明胶溶液；
11)制备下层圆柱体液体：取重量比为1:15-25的明胶与去离子水混合，制得明胶溶液；取重量比为1:3-10的硅酸盐生物玻璃与去离子水混合，制得硅酸盐生物玻璃溶液；在37℃情况下，明胶溶液和硅酸盐生物玻璃溶液混合并震荡两小时，使得明胶溶液与硅酸盐生物玻璃溶液完全融合与均匀分散，然后室温下放置两小时，使其气泡完全排出；随后经巴氏消毒法消毒溶液，得到明胶和硅酸盐生物玻璃的混合溶液；
12)用医用注射器抽取步骤10)的明胶溶液，放置于4℃环境10分钟，得到凝胶状态的明胶柱体；
13)用医用注射器再次抽取步骤11)的混合溶液，放置4℃环境10分钟，使混合溶液的组份呈凝胶态，随后与凝胶状态的明胶柱体端面上下堆叠，两者完全粘合，获得一体化生物活性支架；
14)取1％的戊二醛溶液至步骤13)所得到的一体化生物活性支架进行交联，交联结束后用1％的谷氨酸溶液反复浸泡清洗生物活性支架，去除残留的戊二醛，即得所述生物活性支架。
实施例2
所述生物活性支架为上下堆叠的双层圆柱体形态；
上层圆柱体采用30％wt的明胶溶液制成；
下层圆柱体采用30％wt的明胶溶液和10％wt的硅酸盐生物玻璃混合制成；
制备方法如实施例1所述。
实施例3
所述生物活性支架为上下堆叠的双层圆柱体形态；
上层圆柱体采用20％wt的明胶溶液制成；
下层圆柱体采用20％wt的明胶溶液和5％wt的硅酸盐生物玻璃混合制成；
制备方法包括下述步骤：
10)制备上层圆柱体液体：取重量比为1:15-25的明胶与去离子水混合，在37℃情况下震荡两小时，使得明胶完全融合并且均匀分散，然后室温下放置两小时，使其气泡完全排出；随后经巴氏消毒法消毒，得到明胶溶液；
11)制备下层圆柱体液体：取重量比为1:15-25的明胶与去离子水混合，制得明胶溶液；取重量比为1:3-10的硅酸盐生物玻璃与去离子水混合，制得硅酸盐生物玻璃溶液；在37℃情况下，明胶溶液和硅酸盐生物玻璃溶液混合并震荡两小时，使得明胶溶液与硅酸盐生物玻璃溶液完全融合与均匀分散，然后室温下放置两小时，使其气泡完全排出；随后经巴氏消毒法消毒溶液，得到明胶和硅酸盐生物玻璃的混合溶液；
12)用医用注射器抽取步骤10)的明胶溶液，放置于4℃环境10分钟，得到凝胶状态的明胶柱体；
13)用医用注射器再次抽取步骤11)的混合溶液，放置4℃环境10分钟，使混合溶液的组份呈凝胶态，随后与凝胶状态的明胶柱体端面上下堆叠，两者完全粘合，获得一体化生物活性支架；
14)取1％的戊二醛溶液至步骤13)所得到的一体化生物活性支架进行交联，交联结束后用1％的谷氨酸溶液反复浸泡清洗生物活性支架，去除残留的戊二醛，即得所述生物活性支架；
15)将所述生物活性支架于低温冷冻干燥机中冻干3天，去除支架中多余的水分，完成生物活性支架多孔性的构建。
实施例4
所述生物活性支架为上下堆叠的三层柱体形态；
上层柱体采用20％wt的壳聚糖溶液和15％wt海藻酸钠溶液混合制成；
中层柱体采用20％wt的壳聚糖溶液制成；
下层柱体采用20％wt的壳聚糖溶液、15％wt海藻酸钠溶液和3％wt的硅酸盐生物玻璃。
制备方法：
20)制备下层柱体液体：取壳聚糖与1％(v/v)的乙酸溶液混合，在37℃情况下缓慢搅拌两小时，使得壳聚糖完全融合并且均匀分散，制成20-30％wt的壳聚糖溶液；取海藻酸钠与25mg/ml的nacl溶液混合，在37℃情况下缓慢搅拌两小时，使得海藻酸钠完全融合并且均匀分散，制成15-25％wt的海藻酸钠溶液；取重量比为1:3-10的硅酸盐生物玻璃与去离子水混合，制得硅酸盐生物玻璃溶液；在37℃情况下，壳聚糖溶液、海藻酸钠溶液和硅酸盐生物玻璃溶液混合并震荡两小时，使得溶液完全融合与均匀分散，缓慢搅拌6小时，随后经巴氏消毒法消毒，再加入十二烷基磺酸钠，搅拌5-10min，得到上层柱体溶液；其中，每10ml混合液中加入十二烷基磺酸钠的量为10mg；
21)制备中层柱体液体：取壳聚糖与1％(v/v)的乙酸溶液混合，在37℃情况下缓慢搅拌两小时，使得壳聚糖完全融合并且均匀分散，然后室温下放置两小时，使其气泡完全排出，随后经巴氏消毒法消毒，制成中层柱体溶液；
22)制备上层柱体液体：取壳聚糖与1％(v/v)的乙酸溶液混合，在37℃情况下缓慢搅拌两小时，使得壳聚糖完全融合并且均匀分散，制成20-30％wt的壳聚糖溶液；取海藻酸钠与25mg/ml的nacl溶液混合，在37℃情况下缓慢搅拌两小时，使得海藻酸钠完全融合并且均匀分散，制成15-25％wt的海藻酸钠溶液；取1:1量的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合，缓慢搅拌6小时，随后经巴氏消毒法消毒，再加入十二烷基磺酸钠，搅拌5-10min，得到上层柱体溶液；其中，每10ml混合液中加入十二烷基磺酸钠的量为10mg；
23)用医用注射器抽取步骤20)的下层柱体溶液，放置于4℃环境10分钟，得到凝胶状态的下层柱体；
24)用医用注射器再次抽取步骤21)的中层柱体溶液，放置4℃环境10分钟，使混合溶液的组份呈凝胶态，随后堆叠至凝胶状态的下层柱体上端面，两者完全粘合，获得双层生物活性支架；
25)用医用注射器再次抽取步骤22)的上层柱体溶液，放置4℃环境10分钟，使混合溶液的组份呈凝胶态，随后堆叠至凝胶状态的中层柱体上端面，两者完全粘合，获得三层生物活性支架；
26)取1％的戊二醛溶液至步骤25)所得到的一体化生物活性支架进行交联，交联结束后用1％的谷氨酸溶液反复浸泡清洗生物活性支架，去除残留的戊二醛，即得所述生物活性支架。
制备所得生物活性支架的上层柱体孔径率为70.6％，孔径大小为890-2600μm；中层柱体孔径率为2.51％，孔径大小为20-300μm；下层柱体孔径率为67.4％，孔径大小为1200-2700μm。
实施例5
所述生物活性支架为上下堆叠的三层柱体形态；
上层柱体采用30％wt的壳聚糖溶液和25％wt海藻酸钠溶液混合制成；
中层柱体采用30％wt的壳聚糖溶液制成；
下层柱体采用30％wt的壳聚糖溶液、25％wt海藻酸钠溶液和10％wt的硅酸盐生物玻璃。
制备方法：如实施例4所示，不同之处在于：20)制备下层柱体溶液时，每10ml混合液中加入十二烷基磺酸钠的量为15mg；22)制备下层柱体溶液时，每10ml混合液中加入十二烷基磺酸钠的量为15mg。
制备所得生物活性支架的上层柱体孔径率为78.1％，孔径大小为850-3200μm；中层柱体孔径率为1.62％，孔径大小为10-280μm；下层柱体孔径率为76.6％，孔径大小为860-3000μm。
实施例6
所述生物活性支架为上下堆叠的三层柱体形态；
上层柱体采用25％wt的壳聚糖溶液和20％wt海藻酸钠溶液混合制成；
中层柱体采用25％wt的壳聚糖溶液制成；
下层柱体采用25％wt的壳聚糖溶液、20％wt海藻酸钠溶液和5％wt的硅酸盐生物玻璃。
制备方法：如实施例4所示，不同之处在于：20)制备下层柱体溶液时，每10ml混合液中加入十二烷基磺酸钠的量为13.2mg；22)制备下层柱体溶液时，每10ml混合液中加入十二烷基磺酸钠的量为13.0mg。
制备所得生物活性支架的上层柱体孔径率为81.2％，孔径大小为900-2900μm；中层柱体孔径率为1.02％，孔径大小为32-240μm；下层柱体孔径率为88.6％，孔径大小为1000-3000μm。
试验例本发明生物活性支架接种小鼠成纤维细胞
1、采用实施例2所述的双层立柱形态的生物活性支架
实验过程：
1)、构建实施例2所述的一体化生物活性支架。
2)、采用差异贴壁法提取24小时c57小鼠成纤维细胞，取p2指数期细胞，用dmem高糖完全培养基配置1*105/ml浓度成纤维细胞溶液。
3)、滴种成纤维细胞溶液于生物活性支架表面
4)、放置接种过细胞的生物活性支架于dmem高糖完全培养基培养，每3天换液。
5)、取3天、7天时间点于荧光显微镜下观察成纤维细胞状态及形状。
实验结果：图2所示，为7天时间点的荧光结果，显示小鼠成纤维细胞在该生物活性支架内伸展良好。
2、采用实施例5所述的三层立柱形态的生物活性支架
实验过程：
1)、构建实施例5所述的一体化生物活性支架。
2)、采用差异贴壁法提取24小时c57小鼠成纤维细胞，取p2指数期细胞，用dmem高糖完全培养基配置1*105/ml浓度成纤维细胞溶液。
3)、滴种成纤维细胞溶液于三层生物活性支架的上下表面
4)、放置接种过细胞的生物活性支架于dmem高糖完全培养基培养，每3天换液。
5)、取3天、7天时间点于荧光显微镜下观察成纤维细胞状态及形状。
实验结果：图3所示为上层和中层连接部位的局部图，为7天时间点的荧光结果，显示小鼠成纤维细胞在该生物活性支架内伸展良好，同时中夹层结构孔隙率低，细胞侵入少。
以上所述的实施方式，并不构成对该技术方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在该技术方案的保护范围之内。
1.一种可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架，其特征在于，包括至少两个立体空间形态堆叠或拼接形成的生物活性支架；每一所述立体空间形态所采用的支架材料均不相同，且至少包括生物医用高分子水凝胶；所述生物活性支架组装后均通过交联剂交联并洗涤。
2.如权利要求1所述的可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架，其特征在于，所述生物医用高分子水凝胶包括明胶、海藻酸钠、壳聚糖、琼脂糖、结冷胶、丝素蛋白、胶原蛋白或透明质酸中的一种或两种以上的组合；
至少一个的所述生物活性支架的立体空间的支架材料还包括硼硅酸盐生物玻璃、硅酸盐生物玻璃、钙磷酸盐生物玻璃、生物活性玻璃、生物陶瓷、活性微量元素以及聚丙烯酰胺中的一种或两种以上的组合。
3.如权利要求1所述的可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架，其特征在于，所述生物活性支架为采用上下堆叠方式形成的双层立体空间形态、多层立体空间形态。
4.如权利要求1所述的可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架，其特征在于，所述生物活性支架为上下堆叠的双层圆柱体形态，其中上层圆柱体采用15-25％wt的明胶溶液制成，下层圆柱体采用15-25％wt的明胶溶液和3-10％wt的硅酸盐生物玻璃混合制成。
5.如权利要求4所述的可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架，其特征在于，所述上层圆柱体采用20％wt的明胶溶液制成，下层圆柱体采用20％wt的明胶溶液和5％wt的硅酸盐生物玻璃混合制成。
6.如权利要求1所述的可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架，其特征在于，所述生物活性支架为上下堆叠的三层柱体形态，其中上层柱体采用20-30％wt的壳聚糖溶液和15-25％wt海藻酸钠溶液混合制成，孔径率为60-90％；中层柱体采用20-30％wt的壳聚糖溶液制成，孔径率为0-20％；下层柱体采用20-30％wt的壳聚糖溶液、15-25％wt海藻酸钠溶液和3-10％wt的硅酸盐生物玻璃，孔径率为60-90％。
7.一种可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)根据创面组织类型的不同设计支架的空间形态及材料配比；
2)使用所选取的材料配比制备各个立体空间形态的溶液，在低温环境中制得凝胶状态的各个立体空间形态；
3)将凝胶状态的各个立体空间形态组装为一体结构，获得初始生物活性支架；
4)在获得的初始生物活性支架上倒入交联剂溶液，初始生物活性支架进行交联，并洗涤；
5)使用冷冻干燥机冻干洗涤后的生物活性支架，去除水分，即得所述生物活性支架。
8.一种可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架的制备方法，其特征在于，用于制备权利要求4所述双层圆柱体形态的生物活性支架，包括下述步骤：
10)制备上层圆柱体液体：取重量比为1:15-25的明胶与去离子水混合，在37℃情况下震荡两小时，使得明胶完全融合并且均匀分散，然后室温下放置两小时，使其气泡完全排出；随后经巴氏消毒法消毒，得到明胶溶液；
11)制备下层圆柱体液体：取重量比为1:15-25的明胶与去离子水混合，制得明胶溶液；取重量比为1:3-10的硅酸盐生物玻璃与去离子水混合，制得硅酸盐生物玻璃溶液；在37℃情况下，明胶溶液和硅酸盐生物玻璃溶液混合并震荡两小时，使得明胶溶液与硅酸盐生物玻璃溶液完全融合与均匀分散，然后室温下放置两小时，使其气泡完全排出；随后经巴氏消毒法消毒溶液，得到明胶和硅酸盐生物玻璃的混合溶液；
12)用医用注射器抽取步骤10)的明胶溶液，放置于4℃环境10分钟，得到凝胶状态的明胶柱体；
13)用医用注射器再次抽取步骤11)的混合溶液，放置4℃环境10分钟，使混合溶液的组份呈凝胶态，随后与凝胶状态的明胶柱体端面上下堆叠，两者完全粘合，获得一体化生物活性支架；
14)取1％的戊二醛溶液至步骤13)所得到的一体化生物活性支架进行交联，交联结束后用1％的谷氨酸溶液反复浸泡清洗生物活性支架，去除残留的戊二醛，即得所述生物活性支架。
9.如权利要求8所述的可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架的制备方法，其特征在于，步骤14)之后还包括下述步骤：
15)将所述生物活性支架于低温冷冻干燥机中冻干3天，去除支架中多余的水分，完成生物活性支架多孔性的构建。
10.一种可用于促进创面组织同步修复再生的生物活性支架的制备方法，其特征在于，用于制备权利要求6所述三层柱体形态的生物活性支架，包括下述步骤：
20)制备下层柱体液体：取壳聚糖与1％(v/v)的乙酸溶液混合，在37℃情况下缓慢搅拌两小时，使得壳聚糖完全融合并且均匀分散，制成20-30％wt的壳聚糖溶液；取海藻酸钠与25mg/ml的nacl溶液混合，在37℃情况下缓慢搅拌两小时，使得海藻酸钠完全融合并且均匀分散，制成15-25％wt的海藻酸钠溶液；取重量比为1:3-10的硅酸盐生物玻璃与去离子水混合，制得硅酸盐生物玻璃溶液；在37℃情况下，壳聚糖溶液、海藻酸钠溶液和硅酸盐生物玻璃溶液混合并震荡两小时，使得溶液完全融合与均匀分散，缓慢搅拌6小时，随后经巴氏消毒法消毒，再加入十二烷基磺酸钠，搅拌5-10min，得到上层柱体溶液；其中，每10ml混合液中加入十二烷基磺酸钠的量为10-15mg；
21)制备中层柱体液体：取壳聚糖与1％(v/v)的乙酸溶液混合，在37℃情况下缓慢搅拌两小时，使得壳聚糖完全融合并且均匀分散，然后室温下放置两小时，使其气泡完全排出，随后经巴氏消毒法消毒，制成中层柱体溶液；
22)制备上层柱体液体：取壳聚糖与1％(v/v)的乙酸溶液混合，在37℃情况下缓慢搅拌两小时，使得壳聚糖完全融合并且均匀分散，制成20-30％wt的壳聚糖溶液；取海藻酸钠与25mg/ml的nacl溶液混合，在37℃情况下缓慢搅拌两小时，使得海藻酸钠完全融合并且均匀分散，制成15-25％wt的海藻酸钠溶液；取1:1量的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合，缓慢搅拌6小时，随后经巴氏消毒法消毒，再加入十二烷基磺酸钠，搅拌5-10min，得到上层柱体溶液；其中，每10ml混合液中加入十二烷基磺酸钠的量为10-15mg；
23)用医用注射器抽取步骤20)的下层柱体溶液，放置于4℃环境10分钟，得到凝胶状态的下层柱体；
24)用医用注射器再次抽取步骤21)的中层柱体溶液，放置4℃环境10分钟，使混合溶液的组份呈凝胶态，随后堆叠至凝胶状态的下层柱体上端面，两者完全粘合，获得双层生物活性支架；
25)用医用注射器再次抽取步骤22)的上层柱体溶液，放置4℃环境10分钟，使混合溶液的组份呈凝胶态，随后堆叠至凝胶状态的中层柱体上端面，两者完全粘合，获得三层生物活性支架；
26)取1％的戊二醛溶液至步骤25)所得到的一体化生物活性支架进行交联，交联结束后用1％的谷氨酸溶液反复浸泡清洗生物活性支架，去除残留的戊二醛，即得所述生物活性支架。
技术总结