本发明属于蛋白纯化
技术领域：
，具体涉及一种大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的制备方法及再生方法。
背景技术：
：力学功能蛋白，为一类具有一定力学强度的功能蛋白，如蛛丝弹性蛋白、节肢弹性蛋白、丝心蛋白、贻贝类蛋白等。力学功能蛋白在生物医学材料如蛋白纤维，生物胶水，药物载体等方面具有广泛应用。申请人构建此类蛋白过程中加入了6×his标签，可用亲和层析及离子交换层析柱对蛋白进行纯化。但力学功能蛋白结构复杂，大部分含有大量的β片层结构，且具有100kd以上的分子量，纯化较为困难，而且由于其氨基酸组成较为复杂，且较为容易与金属离子配位，导致其在层析柱上较难彻底去除。因此，力学功能蛋白的纯化不仅仅需要特殊装填的蛋白层析柱，同时还需要特殊的层析柱再生方式来延长层析柱的寿命。目前，层析柱主要分为预装柱及组装柱，预装柱是指一定体积的填充好相关层析柱料的层析柱，其优点在于蛋白吸附效果好且工艺较为稳定，但是，其价格较为高昂且体积较为固定，一般为5ml-50ml，不适用于大规模纯化。更重要的是，力学功能蛋白对层析柱柱料的损伤较大，最终导致成本增高，因此，预装柱不适合力学功能蛋白纯化。组装层析柱是指将指定亲和层析柱料填入到空的玻璃柱管中，其优点在于可以根据实验规模及所纯化蛋白特性灵活确定层析柱体积及层析介质，但是，由于其在纯化仪上在线填充，因此不同的填充流速及不同的层析柱管都会对后续的纯化效果造成一定的影响。因此建立了一种适合于力学功能蛋白纯化的层析柱装填方法，确定适合于力学功能蛋白的层析柱体积及装填流速，对大批量纯化克级力学功能蛋白具有重要意义。然而，组装层析柱在纯化力学功能蛋白后，填料会残留一些黄色及粘性物质，经鉴定为残留的dna和截断表达蛋白等物质，会对下次使用造成极大影响，大幅度缩短纯化柱的使用寿命，这对用大体积层析柱纯化的力学功能蛋白来说，会大幅度增加成本。更严重的是，残留物质会导致纯化产品质量大幅度下降。而现有的层析柱再生方式主要用碱进行浸泡冲洗，这种方法并不能彻底清洗纯化力学功能蛋白后残留的杂质，尤其是残留的高电荷密度蛋白及dna。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷，提供一种大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的制备方法及再生方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的制备方法，采用中、高流速将大体积镍亲和层析柱料或阳离子交换层析柱料填充至大容量柱管中。本发明经过不同的条件筛选，本发明首先确定了适合于力学功能蛋白的层析柱体积及装填流速，建立一种适合于力学功能蛋白纯化的层析柱装填方法。采用本发明所述制备方法可以得到能够纯化出90％纯度以上的克级力学功能蛋白的亲和层析柱，且对柱效损失较少。采用得到的亲和层析柱可以大批量对力学功能蛋白进行纯化，得到纯度较高的蛋白。在本发明中，所述的大容量柱管是指内径为50mm的双层钢化玻璃套管，最大承受压力为0.5mpa，容积为559ml。在本发明中，所述的镍亲和层析柱填料型号为nisepharose6ff，所述阳离子交换层析柱填料型号为spsepharosehp。在具体实施方案中，所述的大体积sepharoseni6xff柱料或sphp柱料其特定体积为500ml。在本发明中，对于镍亲和层析柱，所述的中、高流速为填充流速40ml/min，固定流速80ml/min。在本发明中，对于阳离子交换层析柱，所述的中、高流速为填充流速为25ml/min，固定流速为50ml/min。进一步的，在本发明中，所述的镍亲和层析柱料或阳离子交换层析柱料装填方法主要包括以下几个步骤：(1)柱料准备：将柱料用超纯水清洗两到三遍，确保其中的乙醇被彻底除去；(2)柱管准备：检查所用柱管密封性，润湿柱管底部，静置待用；(3)平衡：将处理好的柱料沿一侧倒入柱管中，保证柱管垂直于水平面；同时将柱子顶端连接头连接至纯化系统中；插入适配柱并密封；打开系统并调整流速至中流速直到柱料不再下降；(4)装柱：等柱料不再下降后，调整流速至高流速，运行30-45min，标记此时柱料位置，下移适配柱至标记位置后再下移1.5-3mm，密封；(5)平衡：用5cv的平衡缓冲液冲洗层析柱，确保系统中a280，254，电导值平衡；(6)保存：用20％乙醇水溶液冲洗层析柱，之后竖直保存。在本发明中，对于镍亲和层析柱，步骤(4)中所述平衡缓冲液为ph8.0的含有0.5mnacl、0.02m咪唑的0.05m磷酸钠缓冲液。在本发明中，对于阳离子交换层析柱，步骤(4)中所述平衡缓冲液为ph8.0的含有0.05mnacl的0.05m磷酸钠缓冲液。本发明还提供了所述大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的再生方法。本发明所述大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的再生方法具体包括如下步骤：(a)将层析柱进行预处理；(b)用氢氧化钠溶液或含有高浓度氯化钠的氢氧化钠溶液清洗所述预处理后的层析柱，然后用去离子水清洗层析柱，去掉所述层析柱残留清洗液；(c)用ph为4.0-5.0的含有tritonx-100的乙二胺四乙酸水溶液清洗所述层析柱；(d)用去离子水清洗层析柱，去掉所述层析柱残留清洗液。在本发明中，所述步骤(a)中所述预处理具体为所述镍亲和层析柱用脱镍缓冲液冲洗后用水冲洗；所述阳离子交换层析柱用水冲洗。进一步的，在本发明中，所述镍亲和层析柱用脱镍缓冲液为含有50mmedta、ph8.0的20mm磷酸钠缓冲液。在本发明中，所述步骤(a)中所述预处理时所述脱镍缓冲液冲洗的流速为40ml/min。在本发明中，所述步骤(b)中针对所述镍亲和层析柱用氢氧化钠溶液清洗所述预处理后的层析柱，所述氢氧化钠溶液其浓度为1m。在本发明中，所述步骤(b)中针对所述阳离子交换层析柱用含有高浓度氯化钠的氢氧化钠溶液其为含0.5-2m氯化钠的0.2-1m氢氧化钠溶液。在一些实施方案中，所述含有高浓度氯化钠的氢氧化钠溶液其为含2m氯化钠的0.5m氢氧化钠溶液。在本发明中，所述步骤(c)中所述含有tritonx-100的乙二胺四乙酸水溶液其浓度为0.5-2％体积浓度的tritongx-100和0.1-0.3m的乙二胺四乙酸。在一些实施方案中，所述含有tritonx-100的乙二胺四乙酸水溶液其浓度为1％体积浓度的tritongx-100和0.2m的乙二胺四乙酸水溶液，其ph为4.5。进一步的，所述步骤(d)后镍亲和层析柱还包括用0.1m的硫酸镍缓冲液冲洗上镍的步骤。由上述技术方案可知，本发明提供了一种大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的制备方法及再生方法。本发明所述大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的制备方法采用中、高流速将大体积镍亲和层析柱料或阳离子交换层析柱料填充至大容量柱管中。本发明所述制备方法得到的层析柱结合蛋白量大，一次可纯化出克级蛋白，纯度及回收率均达到了预装柱水准，同时可以有效减少柱效的损耗且有效减少洗脱峰拖尾现象。本发明所述纯化力学功能蛋白的层析柱的再生方法可快速去除纯化力学功能蛋白后层析柱上的残留杂质，延长填料寿命，降低使用成本并保证蛋白质量稳定，提高生产效率。且再生效果极佳，dna、蛋白、内毒素、有机碳的残留非常低。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示大容量层析柱示意图；图2示力学功能蛋白纯化电泳对比图(镍柱)，蛋白纯度>90％；图3示力学功能蛋白纯化电泳对比图(离子交换)，蛋白纯度>96％；图4示力学功能蛋白纯化效果uv280峰图(本发明镍亲和层析柱)；图5示力学功能蛋白纯化效果uv280峰图(本发明sp层析柱)；图6示力学功能蛋白纯化效果uv280峰图(商业镍亲和层析预装柱)；图7示力学功能蛋白纯化效果uv280峰图(商业离子交换层析预装柱)。具体实施方式本发明公开了一种大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的制备方法及再生方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的制备方法，采用中、高流速将大体积镍亲和层析柱料或阳离子交换层析柱料填充至大容量柱管中。本发明通过对装柱子过程中条件的探索，用一定中高流速对装有大体积sepharoseni6xff柱料或sphp的大容量柱管进行填充，最终得到能够纯化出90％纯度以上的克级力学功能蛋白的亲和层析柱，且对柱效损失较少。进一步的，在本发明中，所述的镍亲和层析柱料装填方法主要包括以下几个步骤：(1)柱料准备：将500mlsepharoseni6xff柱料用超纯水清洗两到三遍，确保其中的乙醇被彻底除去，之后用250ml超纯水重悬；(2)柱管准备：检查所用柱管密封性，润湿柱管底部，静置待用；(3)平衡：将处理好的柱料沿一侧倒入柱管中，保证柱管垂直于水平面；同时将柱子顶端连接头连接至aktaavant纯化系统中；插入适配柱并密封；打开系统并调整流速至中流速40ml/min(122.25cm/h)直到柱料不再下降；(4)装柱：等柱料不再下降后，调整流速至高流速80ml/min(244.5cm/h)，运行45min，标记此时柱料位置，下移适配柱至标记位置后再下移3mm，密封；(5)平衡：用5cv(2500ml)的平衡缓冲液冲洗层析柱，确保系统中a280，254，电导值平衡；所述平衡缓冲液为ph8.0的含有0.5mnacl、0.02m咪唑的0.05m磷酸钠缓冲液；(6)保存；用1000ml20％乙醇水溶液冲洗层析柱，之后竖直保存。在本发明中，所述的阳离子交换层析柱料装填方法主要包括以下几个步骤：(1)柱料准备：将500mlsphp柱料用超纯水清洗两到三遍，确保其中的乙醇被彻底除去，之后用250ml超纯水重悬；(2)柱管准备：检查所用柱管密封性，润湿柱管底部，静置待用；(3)平衡：将处理好的柱料沿一侧倒入柱管中，保证柱管垂直于水平面；同时将柱子顶端连接头连接至纯化系统中；静置20min，插入适配柱并密封；打开系统并调整流速至中流速25ml/min(76.4cm/h)直到柱料不再下降；(4)装柱：等柱料不再下降后，调整流速至高流速50ml/min(152.8cm/h)，运行45min，标记此时柱料位置，下移适配柱至标记位置后再下移1.5mm，密封；(5)平衡：用5cv(2500ml)的平衡缓冲液冲洗层析柱，确保系统中a280，254，电导值平衡；所述平衡缓冲液为ph8.0的含有0.05mnacl的0.05m磷酸钠缓冲液；(6)保存；用1000ml20％乙醇水溶液冲洗层析柱，之后竖直保存。在一些具体实施方案中，本发明中还提供了所述大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的再生方法。本发明对层析柱的再生方法进行条件筛选，选出适合的再生方法，极大的延长了柱料寿命在一些实施方案中，所述大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的再生方法具体包括如下步骤：(a)将层析柱进行预处理；(b)用氢氧化钠溶液或含有高浓度氯化钠的氢氧化钠溶液清洗所述预处理后的层析柱，然后用去离子水清洗层析柱，去掉所述层析柱残留清洗液；(c)用ph为4.0-5.0的含有tritonx-100的乙二胺四乙酸水溶液清洗所述层析柱；(d)用去离子水清洗层析柱，去掉所述层析柱残留清洗液。在本发明中，所述步骤(a)中所述预处理具体为所述镍亲和层析柱用脱镍缓冲液冲洗进行脱镍处理，之后用水清洗掉脱镍缓冲液。所述阳离子交换层析柱仅用水冲洗。在一些实施方案中，所述脱镍缓冲液为含有50mmedta、ph8.0的20mm磷酸钠缓冲液。在一些实施方案中，所述镍亲和层析柱用脱镍缓冲液冲洗时所述脱镍缓冲液冲洗的流速为40ml/min。在本发明中，所述步骤(b)中针对所述镍亲和层析柱用氢氧化钠溶液清洗所述预处理后的层析柱，所述氢氧化钠溶液其浓度为1m。在本发明中，所述步骤(b)中针对所述阳离子交换层析柱用含有高浓度氯化钠的氢氧化钠溶液其为含0.5-2m氯化钠的0.2-1m氢氧化钠溶液。在一些实施方案中，所述含有高浓度氯化钠的氢氧化钠溶液其为含2m氯化钠的0.5m氢氧化钠溶液。在本发明中，所述步骤(c)中所述含有tritonx-100的乙二胺四乙酸水溶液其浓度为0.5-2％体积浓度的tritongx-100和0.1-0.3m的乙二胺四乙酸。在一些实施方案中，所述含有tritonx-100的乙二胺四乙酸水溶液其浓度为1％体积浓度的tritongx-100和0.2m的乙二胺四乙酸水溶液。在一些实施方案中，所述含有tritonx-100的乙二胺四乙酸水溶液其浓度其ph为4.5。在本发明中，对于镍亲和层析柱，在步骤(d)用去离子水清洗层析柱，去掉所述层析柱残留清洗液后还上镍步骤。在一些实施方案中，所述上镍步骤所用溶液为0.1m的硫酸镍缓冲液。在本发明中，所述待纯化样品为elp融合力学功能蛋白构建pet25b原核表达载体，转化e.coliblr(de3)大肠杆菌，经过诱导表达筛选获得的稳定表达菌株发酵获得的菌液收集菌体破碎获得的蛋白。所述与elp融合的力学功能蛋白包括但不限于丝心蛋白、蛛丝蛋白、节肢弹性蛋白、鱿鱼环齿蛋白。在本发明中，所述柱效的测定方法如下；a)柱平衡：用200ml超纯水清洗柱子，直至a280，254，电导值平衡；b)上样：将200μl柱效测定液加载至柱子中，流速控制在60cm/h；c)洗脱：用超纯水进行洗脱，流速60cm/h，直至a280，254，电导值平衡；d)柱效计算：对洗脱峰进行积分，计算出其对称性及每米塔板数；e)保存：用200ml20％乙醇冲洗层析柱，至基线平衡，之后竖直保存。其中所述柱效测定液为2％质量分数的丙酮水溶液。本发明的有益效果至少包括下述之一：1)本发明提供了一种节约、快捷可大批量纯化高电荷密度的类弹性蛋白的层析柱的填充方法，经过此方法得到的层析柱结合蛋白量大，损耗小，且再生后杂质残留量大幅度降低，极大的节约了成本并保证蛋白质量，其一次可纯化出克级蛋白，回收率可以达到80％以上且纯度在90％以上；2)由于高电荷密度的类弹性蛋白对柱子的损伤较大且纯化过程中容易拖尾，本发明采用内径较大的柱管，同时填充时使用较高的流速。与通过其他方法装填的层析柱及预装柱相比，每次可以有效减少柱效的损耗至10％以内且有效减少了洗脱峰拖尾现象；3)通常来说，大体积组装柱均起到初步纯化作用，但回收率及纯度不是十分理想。本发明所述方法得到的层析柱相比于其他大体积层析柱，纯度及回收率均达到了预装柱水准，纯化后得到的蛋白可以用于下一步精细纯化或用于其他领域。4)本发明还建立了适用于纯化力学功能蛋白的层析柱的再生方法，所述再生方法针对力学功能蛋白的层析柱再生效果极佳，dna、蛋白、内毒素、有机碳的残留非常低。5)本发明所述层析柱的再生方法便捷，所需试剂成本低，可快速去除纯化力学功能蛋白后层析柱上的残留杂质，延长填料寿命，降低使用成本并保证蛋白质量稳定，在短时间内进行下次纯化，提高生产效率。为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例1亲和层析柱所用填料为nisepharosetm6fastflow高流速镍亲和层析填料，填料总镍离子结合量不低于15μmol/ml，线性流速不得高于400cm/h，颗粒尺寸为45-165μm，层析柱结构见图1，其具体填充方式及检测步骤如下：1.亲和层析柱料预处理(1)取750ml的填料混悬液静置在1000ml量筒中1h，待填料不再下降后倒掉上层液体；(2)填料中加入500ml超纯水，静置45min，待填料不在下降后倒掉上层液体；(3)重复步骤(2)三次，直至填料被完全洗净，没有乙醇残留；(4)用250ml超纯水重悬填料，准备装柱。2.层析柱装填2.1溶液配制平衡缓冲液：2.2层析柱装填(1)柱管准备：检查所用内径50mm柱管，确保其密封性良好，润湿柱管底部，静置待用；(2)平衡：将处理好的柱料沿一侧倒入柱管中，保证柱管垂直于水平面；同时将柱子顶端连接头连接至纯化系统中；插入适配柱并密封；将系统a泵接入到抽滤过的超纯水中，打开系统并调整流速至40ml/min(122.25cm/h)；(3)装柱：等柱料不再下降后，打开系统并调整流速至80ml/min(244.5cm/h)，运行45min，标记此时柱料位置，柱长25.5cm，下移适配柱至标记位置后再下移3mm，密封；(4)平衡：用2500ml的平衡缓冲液冲洗层析柱，最终系统中a280，254，电导值平衡；(5)清洗及保存；用1000ml20％乙醇冲洗层析柱，之后竖直保存。3.柱效损耗测定3.1溶液配制柱效测定液2％质量分数的丙酮水溶液50ml丙酮1g超纯水49g3.2柱效测定：柱效测定需要在每轮纯化之前及之后进行，柱效损耗＝纯化前塔板数(n/m)/纯化后塔板数(n/m)×100％，测定方法如下：(1)柱平衡：用2000ml超纯水清洗柱子，直至a280、254，电导值平衡；(2)上样：将200μl柱效测定液加载至柱子中，流速控制在60cm/h；(3)洗脱：用超纯水进行洗脱，流速60cm/h，直至a280、254，电导值平衡；(4)柱效计算：对洗脱峰进行积分，计算出其对称性及每米塔板数，纯化前塔板数为18902.8、纯化后为17390损耗为8％；(5)清洁及保存：用2000ml20％乙醇冲洗层析柱，至基线平衡，之后竖直保存。4.力学功能蛋白的亲和层析将高压破碎处理后的力学功能蛋白通过此层析柱进行纯化，具体纯化步骤为：4.1缓冲液配制(1)平衡缓冲液：加hcl调整ph8.0(2)洗脱缓冲液：用平衡缓冲液配制成咪唑终浓度为0.35m的缓冲液作为洗脱缓冲液，ph调整为8.0；(3)洗柱缓冲液：用平衡缓冲液配置成含1mnacl的缓冲液作为洗柱缓冲液，ph8.0；(4)清洗液：20％乙醇水溶液用于镍柱的清洁及保存，但在必要情况下，需要对镍柱进行脱镍再生处理。4.2力学功能蛋白镍柱纯化步骤：(1)柱平衡：用20％乙醇水溶液洗涤ni柱，之后用平衡缓冲液进行平衡，应冲洗到a280，a254基线平衡，电导及ph稳定时，即所有的未被结合的分子都被冲出镍柱。(2)上样：将处理好的含有力学功能蛋白的样品加载到平衡后的ni柱中，流速控制在15ml/min。(3)平衡：用2500ml的平衡缓冲液继续冲洗ni柱，流速为40ml/min，使未结合的组分从柱子上分离，冲洗至a280，a254基线平衡，电导及ph稳定。(4)洗脱：用总计5000ml的含有0-100％洗脱缓冲液的平衡缓冲液进行洗脱，流速为40ml/min，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，当系统显示a280，a254基线开始上升时收集洗脱液并保存，纯化过程中uv280变化峰见图4及图6。(5)镍柱的清洁及保存：用洗柱缓冲液对镍柱进行彻底的清洁，保证系统中所显示的电导值为零且a280及a254平衡为止，将清洗并用乙醇填充好的柱子进行柱效测定。(6)纯化后蛋白保存：其纯度测定依据《中国药典2015版》通则0541第五法所提供的检测方式。将待测样品进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色后用凝胶扫描仪进行扫描，对目的蛋白条带对应峰面积进行归一化处理并与其他杂蛋白条带进行比较，得到相应纯度，为95％。实验结果见图2。放入到-80℃冰箱中保存以便进行下一步实验。5.力学功能蛋白亲和层析柱的再生对使用完毕的亲和层析柱进行再生，其步骤如下：(1)将纯化后的镍亲和层析柱(填料型号为nisepharoseff，柱管为gexk50/30，高30cm，直径5cm，柱体积为500ml)用2000ml50mmedta、ph8.0的20mm磷酸钠缓冲液冲洗，流速为40ml/min，之后用2000ml水清洗层析柱，去除掉脱镍缓冲液；(2)用2000ml含有1m氢氧化钠溶液清洗所述层析柱，然后用2000ml去离子水清洗层析柱，去掉层析柱残留清洗液；(3)用1000ml含有1％tritonx-100的ph4.5的0.2m乙二胺四乙酸水溶液清洗所述层析柱；(4)用2000ml去离子水清洗层析柱，去掉层析柱残留清洗液，之后用200ml0.1mniso4进行上镍步骤，完成清洗。(5)取步骤(4)去离子水清洗后得到的清洗液，采用dig-dna及bca法检测其残留的dna及蛋白量，分别为20pg/ml和100ng/ml，并用总有机碳分析仪分析其有机碳含量为120ppb，低于500ppb，用内毒素分析仪分析后内毒素含量低于0.04eu/ml，说明清洗合格，结果见表1。实施例2-5和对比例1-2与实施例1的方法相同，不同之处为氯化钠，氢氧化钠及tritonx-100的浓度不同，详情见表1。表1实施例1-5及对比例1-2清洗结果对比通过表1可知，采用实施例1-5的清洗方法，清洗后清洗液的各项残留指标均达到了预期标准。而对比例1及2中，清洗液采用较低浓度时，层析柱残留杂质不合格。实施例6-7、对比例3与实施例1的方法相同，不同之处为乙二胺四乙酸和tritonx-100混合液中乙二胺四乙酸的浓度不同，详情见表2。表2实施例6-7及对比例3清洗结果对比实施例1实施例6实施例7对比例3乙二胺四乙酸0.2m0.25m0.3m0.1mdna(pg/ml)20181540蛋白(ng/ml)1009580208内毒素(eu/ml)<0.04<0.04<0.040.25总有机碳(ppb)120108100541通过表2可知，本发明中采用0.2m-0.3m的清洗液清洗后层析柱的残留dna及蛋白含量较低，并且内毒素及总有机碳均达到了相应指标，对比例3中采用了较低浓度乙二胺四乙酸，内毒素及有机碳均超标，且残留dna和蛋白浓度极高，清洗不合格，因此，本发明采用的乙二胺四乙酸浓度为0.2m。实施例8阳离子交换层析柱所用填料为spsepharosehighperformance高分辨率阳离子交换层析填料，填料氢离子结合量不低于0.15到0.20mmol/ml，线性流速不得高于150cm/h，颗粒尺寸为34μm，层析柱具体填充方法及检测步骤如下：1.阳离子交换层析柱料预处理(1)取750ml的填料混悬液静置在1000ml量筒中1h，待填料不再下降后倒掉上层液体；(2)填料中加入500ml超纯水，静置45min，待填料不在下降后倒掉上层液体；(3)重复步骤(2)三次，直至填料被完全洗净，没有乙醇残留；(4)用250ml超纯水重悬填料，准备装柱。2.层析柱装填2.1溶液配制平衡缓冲液：ph＝8.0的磷酸钠缓冲液，添加氯化钠5l磷酸钠(m＝163.94)81.97g氯化钠(m＝58.44)14.61g2.2层析柱装填(1)柱管准备：检查所用内径50mm柱管，确保其密封性良好，润湿柱管底部，静置待用；(2)平衡：将处理好的柱料沿一侧倒入柱管中，保证柱管垂直于水平面；同时将柱子顶端连接头连接至纯化系统中；插入适配柱并密封；静置20min，之后将系统a泵接入到抽滤过的超纯水中，打开系统并调整流速至25ml/min(76.40cm/h)；(3)装柱：等柱料不再下降后，打开系统并调整流速至50ml/min(152.8cm/h)，运行45min，标记此时柱料位置，柱长25.3cm，下移适配柱至标记位置后再下移1.5mm，密封；(4)平衡：用2500ml的平衡缓冲液冲洗层析柱，最终系统中a280，254，电导值平衡；(5)清洗及保存；用1000ml20％乙醇冲洗层析柱，之后竖直保存。3.柱效损耗测定3.1溶液配制柱效测定液2％质量分数的丙酮水溶液50ml丙酮1g超纯水49g3.2柱效测定：柱效测定需要在每轮纯化之前及之后进行，柱效损耗＝纯化前塔板数(n/m)/纯化后塔板数(n/m)×100％，测定方法如下(1)柱平衡：用2000ml超纯水清洗柱子，直至a280，254，电导值平衡；(2)上样：将200μl柱效测定液加载至柱子中，流速控制在60cm/h；(3)洗脱：用超纯水进行洗脱，流速60cm/h，直至a280，254，电导值平衡；(4)柱效计算：对洗脱峰进行积分，计算出其对称性及每米塔板数，纯化前塔板数为30521、纯化后为28995损耗为5％；(5)清洁及保存：用2000ml20％乙醇冲洗层析柱，至基线平衡，之后竖直保存。4.力学功能蛋白的离子交换层析将高压破碎处理后的力学功能蛋白通过此层析柱进行纯化，具体纯化步骤为：4.1缓冲液配制(1)平衡缓冲液：ph＝8.0的磷酸钠缓冲液，添加氯化钠5l磷酸钠(m＝163.94)81.97g氯化钠(m＝58.44)14.91g加hcl调整ph＝8.0(2)洗脱缓冲液：用平衡缓冲液a配制成氯化钠终浓度为2m的缓冲液作为洗脱缓冲液，ph调整为8.0(3)洗柱缓冲液：含有2m氯化钠的氢氧化钠溶液5l氢氧化钠(m＝40)100g氯化钠(m＝58.44)584.4g(4)清洗液：20％乙醇用于离子交换柱的清洁及保存。4.2力学功能蛋白sp柱纯化步骤：(1)柱平衡：用20％乙醇水溶液洗涤离子交换柱，之后用平衡缓冲液进行平衡，应冲洗到a280，a254基线平衡，电导及ph稳定时，即所有的未被结合的分子都被冲出离子交换柱。(2)上样：将处理好的含有力学功能蛋白的样品加载到平衡后的离子交换柱中，流速控制在10ml/min。(3)平衡：用2500ml的平衡缓冲液继续冲洗离子交换柱，流速为30ml/min，使未结合的组分从柱子上分离，冲洗至a280，a254基线平衡，电导及ph稳定。(4)洗脱：用总计5000ml的含有0-100％洗脱缓冲液的平衡缓冲液进行洗脱，流速为30ml/min，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，当系统显示a280，a254基线开始上升时收集洗脱液并保存。纯化过程中uv280变化峰见图5及图7。(5)离子交换柱的再生及保存：用2000ml洗柱缓冲液对离子交换柱进行彻底的清洁，流速为30ml/min，保证系统中所显示的电导值为零且a280及a254平衡为止，将清洗并用乙醇填充好的柱子进行柱效测定。(6)纯化后蛋白保存，将纯化后的蛋白进行纯度测定，其纯度测定依据《中国药典2015版》通则0541第五法所提供的检测方式。将待测样品进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色后用凝胶扫描仪进行扫描，对目的蛋白条带对应峰面积进行归一化处理并与其他杂蛋白条带进行比较，得到相应纯度，为96％。实验结果见图3。放入到-80℃冰箱中保存以便进行下一步实验。5.力学功能蛋白离子交换层析柱的再生对使用完毕的离子交换层析柱进行再生，其步骤如下：(1)将纯化使用后的离子交换层析柱(填料型号为spsepharosehp，柱管为gexk50/30，高30cm，直径5cm，柱体积为500ml)用2000ml水清洗层析柱，去除掉20％乙醇；(2)用2000ml含有2m氯化钠的0.5m氢氧化钠溶液清洗所述层析柱，然后用2000ml去离子水清洗层析柱，去掉层析柱残留清洗液；(3)取步骤(2)去离子水清洗后得到的清洗液，采用dig-dna及bca法检测其残留的dna及蛋白量，分别为20pg/ml和100ng/ml，并用总有机碳分析仪分析其有机碳含量为120ppb，低于500ppb，用内毒素分析仪分析后内毒素含量低于0.04eu/ml，说明清洗合格。当前第1页1 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技术特征：1.一种大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的制备方法，其特征在于，采用中、高流速将大体积镍亲和层析柱料或阳离子交换层析柱料填充至大容量柱管中。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的大容量柱管是指内径为50mm的双层钢化玻璃套管，最大承受压力为0.5mpa，容积为559ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对于镍亲和层析柱，所述的中、高流速为填充流速40ml/min，固定流速80ml/min；
对于阳离子交换层析柱，所述的中、高流速为填充流速为25ml/min，固定流速为50ml/min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的镍亲和层析柱料或阳离子交换层析柱料装填方法主要包括以下几个步骤：
(1)柱料准备：将柱料用超纯水清洗两到三遍，确保其中的乙醇被彻底除去；
(2)柱管准备：检查所用柱管密封性，润湿柱管底部，静置待用；
(3)平衡：将处理好的柱料沿一侧倒入柱管中，保证柱管垂直于水平面；同时将柱子顶端连接头连接至纯化系统中；插入适配柱并密封；打开系统并调整流速至中流速直到柱料不再下降；
(4)装柱：等柱料不再下降后，调整流速至高流速，运行30-45min，标记此时柱料位置，下移适配柱至标记位置后再下移1.5-3mm，密封；
(5)平衡：用5cv的平衡缓冲液冲洗层析柱，确保系统中a280，254，电导值平衡；
(6)保存；用20％乙醇水溶液冲洗层析柱，之后竖直保存。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，对于镍亲和层析柱，步骤(4)中所述平衡缓冲液为ph8.0的含有0.5mnacl、0.02m咪唑的0.05m磷酸钠缓冲液；
对于阳离子交换层析柱，所述平衡缓冲液为ph8.0的含有0.05mnacl的0.05m磷酸钠缓冲液。
6.一种大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的再生方法，具体包括如下步骤：
(a)将层析柱进行预处理；
(b)用氢氧化钠溶液或含有高浓度氯化钠的氢氧化钠溶液清洗所述预处理后的层析柱，然后用去离子水清洗层析柱，去掉所述层析柱残留清洗液；
(c)用ph为4.0-5.0的含有tritonx-100的乙二胺四乙酸水溶液清洗所述层析柱；
(d)用去离子水清洗层析柱，去掉所述层析柱残留清洗液。
7.根据权利要求6所述的再生方法，其特征在于，所述步骤(a)中所述预处理具体为镍亲和层析柱用脱镍缓冲液冲洗后用水冲洗；阳离子交换层析柱用水冲洗。
8.根据权利要求7所述的再生方法，其特征在于，所述脱镍缓冲液为含有50mmedta、ph8.0的20mm磷酸钠缓冲液；所述脱镍缓冲液冲洗的流速为40ml/min。
9.根据权利要求6所述的再生方法，其特征在于，所述步骤(b)中所述含有高浓度氯化钠的氢氧化钠溶液其为含0.5-2m氯化钠的0.2-1m氢氧化钠溶液。
10.根据权利要求6所述的再生方法，其特征在于，所述步骤(c)中所述含有tritonx-100的乙二胺四乙酸水溶液其浓度为0.5-2％体积浓度的tritongx-100和0.1-0.3m的乙二胺四乙酸。
11.根据权利要求6所述的再生方法，其特征在于，所述步骤(d)后镍亲和层析柱还包括用0.1m的硫酸镍缓冲液冲洗上镍的步骤。
技术总结本申请属于蛋白纯化技术领域，公开了一种大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的制备方法及再生方法。本发明所述大批量纯化克级力学功能蛋白的层析柱的制备方法采用中、高流速将大体积镍亲和层析柱料或阳离子交换层析柱料填充至大容量柱管中。本发明所述制备方法得到的层析柱结合蛋白量大，一次可纯化出克级蛋白，纯度及回收率均达到了预装柱水准，同时可以有效减少柱效的损耗且有效减少洗脱峰拖尾现象。本发明所述纯化力学功能蛋白的层析柱的再生方法可快速去除纯化力学功能蛋白后层析柱上的残留杂质，延长填料寿命，降低使用成本并保证蛋白质量稳定，提高生产效率。且再生效果极佳，DNA、蛋白、内毒素、有机碳的残留非常低。
技术研发人员：刘凯;李博;李敬敬;张洪杰
受保护的技术使用者：中国科学院长春应用化学研究所
技术研发日：2020.02.24
技术公布日：2020.06.09
