本发明中医药技术领域，具体为从小花清风藤茎叶中提取分离酚酸类化合物及含有该化合物的中药提取物或混合物的制备方法和在制备抗炎药物中的用途。
背景技术：
小花清风藤为清风藤科清风藤属藤本植物小花清风藤sabiaparviflorawall.exroxb.的干燥茎和叶。贵州产小花清风藤为布依族、苗族的民间药，主要分布在贵州的兴义市、安龙县、册亨县、望谟县等地，其根茎、叶均可入药，有祛风除湿、消炎止痛的作用。
巨噬细胞是一种组织内的白血球，源自单核细胞，巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在机体内参与非特异性防卫和特异性防卫（细胞免疫），它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用（即吞噬以及消化），并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。巨噬细胞能够被多种炎症性因子所激活，如细胞因子、细菌脂多糖lps、细胞外基质蛋白以及其他化学介质等。lps是十分重要的致炎因子，它能够刺激体内的巨噬细胞合成和释放多种内源性活性因子，进而诱发炎症。利用lps处理巨噬细胞是常用的体外炎症模型造模手段。
目前临床上常用的抗炎药主要有两类：非甾体抗炎药和甾体类抗炎药。虽然这两类抗炎药都有很好的临床应用效果，但长期大量使用均会产生一系列不良反应或副作用，如胃粘膜损伤、肝脏损伤、肾脏损害等，应用时间长亦可产生耐受性。因此寻找新的高效低毒的抗炎药物仍将是抗炎药物研究的热点领域。
中药是我国巨大的资源宝库，具有五千余年的临床应用经验，从中药中寻找先导化合物已成为近年来新药研究的重要来源，本发明应用现代分离技术与波谱分析方法相结合，从小花清风藤中分离出一种具有抗lps致raw264.7细胞炎症作用的酚酸类化合物，非常有望开发成高效低毒的抗炎新药候选药物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新的酚酸类化合物及其在制备抗炎药物中的应用。用这种方法制备的该化合物具有抑制lps诱导的raw264.7细胞中no、tnf-α、il-1和il-6的释放，显示良好的抗炎活性，可用于开发抗炎的相关药物。
实施本发明的技术方案如下：
一种具有抗炎活性的酚酸类化合物，其特征为：名称为：4-(3-羧基-4-羟基苯基)-2-甲基-2-丁烯酸，其结构式如下：
本发明提供的一种具有抗炎活性的酚酸类化合物其制备方法为：
s1将小花清风藤的干燥茎和叶用醇溶剂提取，小花清风藤茎叶与醇溶剂质量比为1：（8-15），得取浸膏；
s2将步骤s1所得浸膏，依次采用大孔树脂、反相柱色谱、制备型高效液相色谱进行分离，得到该化合物。
优选的，所述的提取方法包括冷浸法、渗漉法、微波提取法、超声提取法、回流提取法和连续回流提取法。
优选的，所述大孔树脂主要包括以下型号：hp-20、hp-21、sp850、sp700、sp207、ab-8、d101、xda1、x-5、nka-2、ads-2。
优选的，所述大孔树脂色谱所用的洗脱液为丙酮、乙醇或甲醇中的一种溶剂或不同种溶剂的混合夜。
优选的，所述反相柱色谱主要包括低压制备色谱、中压制备色谱、高效液相色谱或动态轴向压缩色谱，其中，反相色谱所用的流动相为有机溶剂的水溶液，有机溶剂为甲醇或乙腈。
优选的，所述反相柱色谱的洗脱为梯度洗脱，以体积分数计，所述梯度洗脱程序为：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%有机溶剂的水溶液，分别洗脱2个柱体积。
优选的，所述的制备型高效液相色谱的流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液。
上述方法制备的一种酚酸类化合物或含有该化合物的中药提取物或混合物在制备抗炎类药物中的应用。
上述方法制备的酚酸类化合物或含有该化合物的提取物或混合物和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂等剂型。
用这种方法制备的该类新化合物具有抑制lps诱导的raw264.7细胞中no、tnf-α、il-1和il-6的释放，显示良好的抗炎活性，可用于开发抗炎的相关药物。
附图说明
附图1为本发明提供一种新的酚酸类化合物结构式。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
制备该酚酸化合物的方法，包括如下步骤：
（1）将小花清风藤茎叶用12倍量的70%乙醇溶液加热回流提取3次，每次2小时，过滤，将滤液减压浓缩得到粗浸膏；
（2）将步骤（1）所得粗浸膏，用20%乙醇溶解，过滤后得上清液；
（3）取步骤（2）得到的上清液上样于hp-20型大孔树脂柱（样品：树脂按照1：3的体积比填充），依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积。取30%乙醇洗脱部位经ods中低压反相液相色谱柱（50*500mm），meoh-h2o（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）洗脱得到7个馏份a～g。e经制备型高效液相色谱，色谱条件为：c18-ods色谱柱（30mm×250mm，10μm），甲醇-水30:70为流动相，流速15ml/min，保留时间为55min，最后分离得到所述酚酸类化合物(140.6mg)。
实施例2
制备如式1结构的化合物的方法，包括如下步骤：
（1）将小花清风藤茎叶用15倍量的95%乙醇溶液加热回流提取3次，每次2小时，过滤，将滤液减压浓缩得到粗浸膏；
（2）将步骤（1）所得粗浸膏，用20%乙醇溶解，过滤后得上清液；
（3）取步骤（2）得到的上清液上样于hp-20型大孔树脂柱（样品：树脂按照1：3的体积比填充），依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积。取30%乙醇洗脱部位经ods中低压反相液相色谱柱（50*500mm），meoh-h2o（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）洗脱得到7个馏份a～g。e经制备型高效液相色谱，色谱条件为：c18-ods色谱柱（30mm×250mm，10μm），甲醇-水30:70为流动相，流速15ml/min，保留时间为55min，最后分离得到所述酚酸类化合物(140.6mg)。
实施例3
制备如式1结构的化合物的方法，包括如下步骤：
（1）将小花清风藤茎叶用30倍量的70%乙醇溶液冷浸法提取2次，每次24小时，过滤，将滤液减压浓缩得到粗浸膏；
（2）将步骤（1）所得粗浸膏，用20%乙醇溶解，过滤后得上清液；
（3）取步骤（2）得到的上清液上样于hp-20型大孔树脂柱（样品：树脂按照1：3的体积比填充），依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积。取30%乙醇洗脱部位经ods中低压反相液相色谱柱（50*500mm），meoh-h2o（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）洗脱得到7个馏份a～g。e经制备型高效液相色谱，色谱条件为：c18-ods色谱柱（30mm×250mm，10μm），甲醇-水30:70为流动相，流速15ml/min，保留时间为55min，最后分离得到所述酚酸类化合物(140.6mg)。
实施例4结构鉴定
取实施例1制备得到的该化合物利用光谱技术，包括紫外、红外、质谱、核磁共振（uv、ir、ms、1h-nmr、13c-nmr、2d-nmr）鉴定其结构，再经tof高分辨质谱精确确定其分子量及分子式。
其解析过程与波谱数据如下：
黄色油状物，易溶于甲醇。q-tof-ms显示分子离子质荷比为m/z236.0685([m-h]-,calcd.235.0765)，确定其分子式为c12h12o5。其1h-nmr上观察到三个苯环质子abx偶合信号[δh7.70(1h,dd,j=9.5,2.2hz,h-2),7.70(1h,d,j=8.3hz,h-6),6.91(1h,d,j=8.3hz,h-5)]。一个烯烃质子(δh6.01,t,j=15.0,2.2hz,1h)，一个亚甲基(δh3.70,d,j=7.5hz,2h)，一个甲基(δh1.85,s,3h)。其13c-nmr(见表1)显示结构包含12个碳，显示结构中包含一个苯环，两个羧基(δc167.8,169.8)，一个烯烃(δc138.3,129.0)，一个亚甲基(δc30.0)，一个甲基(δc21.1)。在hmbc谱中，交叉峰(δh3.70/δc126.7)表明亚甲基直接与苯环相连，(δh6.01/δc30.0)表示烯烃与亚甲基链接，(δh6.01/δc169.9)和(δh1.85/δc129.0)分别表示羧基和甲基同烯烃相连接，由此确定了支链的结构和连接位置。(δh3.70/δc131.8,129.9)证明c-2和c-6无取代基取代，结合(δh7.70/δc121.7)证明羧基处于支链的间位。再由abx偶合信号确定羟基处于支链对位。并在1h-1hroesy谱中(δh6.01/δh1.85)的交叉峰，证明烯烃的氢处于同侧，为顺式烯烃。根据以上证据，将化合物24鉴定为4-(3-羧基-4-羟基苯基)-2-甲基-2-丁烯酸。
波谱数据如表1所示：
实施例5药效学实验
采用lps致小鼠单核巨噬细胞raw264.7炎症实验模型，考察该化合物对炎症的效果。
1实验方法
1.1细胞培养小鼠单核巨噬细胞raw264.7用含10%胎牛血清，100mg/l青霉素，100mg/l链霉素的dmem培养液于37℃、5%co2恒温培养箱中传代培养。
1.2mtt法检测raw264.7细胞活力取对数期的raw264.7细胞，调整细胞密度2×105个/ml，接种于96孔板，每孔100μl。细胞贴壁后，将培养基更换为不含或含有25，50，100μmol/l该化合物的dmem，每个浓度设5个复孔，分别于培养24，36，48h时进行mtt实验。实验前4h，每孔各加入mtt10μl继续培养4h，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(dmso)150μl，置振荡器上振荡10min，待结晶充分溶解，在490nm处测定吸光度a。实验重复3次。按细胞存活率=(a检测孔/a空白孔)×100%计算细胞存活率。
1.3化合物对lps诱导raw264.7细胞释放no，il-1，il-6，tnf-α的抑制作用影响取对数生长期的raw264.7细胞悬液，调整细胞密度为2×105个/ml，接种于96孔板，每孔100μl，贴壁4h后，分别加入浓度为25，50，100μmol/l化合物100μl和1mg/llps25μl孵育，设空白组，lps组，lps 给药组，每组3个复孔，培养24h后，用griess法检测上清no的含量，elisa试剂盒检测上清il-1，il-6，tnf-α的分泌情况。
1.4统计学分析采用spss18.0软件，实验结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。
2实验结果
2.1化合物对raw264.7细胞存活率的影响不同浓度化合物与细胞共孵育0～48h，细胞存活率并未降低，药物与细胞共同孵育48h时，细胞存活率仍可达到95%以上，与空白组比较，差异无统计学意义。镜下观察细胞形态良好，无显著差异，未观察到细胞毒性作用。结果表明实验中采用的化合物给药浓度在安全浓度范围之内。见表2。
2.2化合物对lps诱导raw264.7细胞释放no，il-1，il-6，tnf-α的抑制作用影响与空白组比较，lps刺激后，细胞上清液中no，il-1，il-6，tnf-α释放量显著升高(p＜0.01)。与lps组比较，化合物各浓度组均可以抑制细胞上清液中no，il-1，il-6，tnf-α释放量，并呈现浓度依赖性(p＜0.05，p＜0.01)。见表3。
1.一种具有抗炎活性的酚酸类化合物，其特征为：名称为：4-(3-羧基-4-羟基苯基)-2-甲基-2-丁烯酸，其结构式如下：
2.如权利要求1所述的一种具有抗炎活性的酚酸类化合物，其特征在于：制备方法的具体步骤为：
s1将小花清风藤的干燥茎和叶用醇溶剂提取，小花清风藤茎叶与醇溶剂质量比为1：（8-15），得取浸膏；
s2将步骤s1所得浸膏，依次采用大孔树脂、反相柱色谱、制备型高效液相色谱进行分离，得到该化合物。
3.如权利要求2所述的一种具有抗炎活性的酚酸类化合物，其特征在于：其中，s1步骤所述的提取方法包括冷浸法、渗漉法、微波提取法、超声提取法、回流提取法和连续回流提取法。
4.根据权利要求2所述的一种具有抗炎活性的酚酸类化合物，其特征在于：所述大孔树脂主要包括以下型号：hp-20、hp-21、sp850、sp700、sp207、ab-8、d101、xda1、x-5、nka-2、ads-2。
5.根据权利要求2所述的一种具有抗炎活性的酚酸类化合物，其特征在于：所述大孔树脂色谱所用的洗脱液为丙酮、乙醇或甲醇中的一种溶剂或不同种溶剂的混合液。
6.根据权利要求2所述的一种具有抗炎活性的酚酸类化合物，其特征在于：所述反相柱色谱包括低压制备色谱、中压制备色谱、高效液相色谱或动态轴向压缩色谱，其中，反相柱色谱所用的流动相为有机溶剂的水溶液，有机溶剂为甲醇或乙腈。
7.根据权利要求2所述的一种具有抗炎活性的酚酸类化合物，其特征在于：所述反相柱色谱的洗脱为梯度洗脱，以体积分数计，所述梯度洗脱程序为：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%有机溶剂的水溶液，分别洗脱2个柱体积。
8.根据权利要求2所述的一种具有抗炎活性的酚酸类化合物，其特征在于：制备型高效液相色谱的流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液。
9.权利要求1所述的一种酚酸类化合物或含有该化合物的中药提取物或混合物在制备抗炎类药物中的应用。
10.如权利要求1所述的一种酚酸类化合物，其特征在于：将化合物或含有该化合物的提取物或混合物和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂。
技术总结