本发明属于生物检测技术领域。更具体地，涉及一种金刚烷胺半抗原、抗原及其化学发光酶联免疫检测试剂盒与应用。
背景技术：
金刚烷胺(amantadine，ama)，分子式c10h17n，是一种人用抗病毒及抗帕金森病的药物，常用于甲型流感病毒引起的上呼吸道疾病的预防，及治疗，过量服用或过敏体质会因中枢神经系统受刺激或中毒而产生幻觉、精神混乱、情绪或其他精神改变的不良反应。人用金刚烷胺抗病毒药移植兽用，缺乏科学规范、安全有效的试验数据，用于治疗动物病毒性疫病不仅给动物疫病控制带来不良后果，而且影响国家动物疫病防控政策的实施。我国农业部于2005年发布第560号公告明确禁止在兽药领域生产和销售使用金刚烷胺。美国fda于2006年也禁止将金刚烷胺等人类抗病毒药物用于畜禽类。
目前检测金刚烷胺的主要方法有高效液相色谱法(hplc)、气相色谱法(gc)、薄层色谱法(tlc)和质谱法(ms)等色谱法。以上方法均使用仪器，具有灵敏度高、结果准确的优点，但检测成本高，耗时长，设备的维护费用高昂，而且对操作员的技术要求高，不适用于现场检测和监控。而免疫分析法具有成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低等特点。因此，研究高灵敏的免疫检测方法对金刚烷胺的有效监控和药代动力学研究具有非常积极的意义。
化学发光免疫分析法是将化学反光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种标记免疫测定技术。其检测原理是：固相载体表面的抗原和样品中相应抗原竞争性地与抗体结合，再加入酶标二抗形成抗原抗体酶标复合物，最后洗涤加入发光底物酶促发光，通过检测发光强度值，而抗原浓度与发光强度值呈负相关。此方法的优点为选择性好、灵敏度高、分析速度快、设备简单。相比仪器分析方法的优势表现在：能实现高通量检测，且更经济、省时。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种金刚烷胺半抗原。本发明首次公开了一种新型的金刚烷胺半抗原、抗原及其制备方法，用所述金刚烷胺抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的金刚烷胺化学发光免疫分析方法提供了新手段；且该金刚烷胺半抗原的制备，使用的原料组分比较简单，实验操作比较容易掌握，便于广泛使用该方法。
本发明的第二个目的是提供应用上述金刚烷胺半抗原制备得到的金刚烷胺抗原。
本发明的第三个目的是提供上述金刚烷胺抗原在制备金刚烷胺特异性抗体中的应用。
本发明的第四个目的是提供应用上述金刚烷胺抗原制备得到的金刚烷胺特异性抗体及其制备方法。
本发明的第五个目的是提供上述金刚烷胺特异性抗体在检测金刚烷胺中的应用。
本发明的第六个目的是提供应用上述金刚烷胺半抗原、抗原、金刚烷胺特异性抗体制备得到的化学发光酶联免疫试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种金刚烷胺半抗原，其特征在于，其结构式如式(i)所示：
本发明还公开了所述金刚烷胺半抗原的制备方法，包括如下步骤：
s1.分别将2-金刚烷酮与水合肼加入到有机溶剂中，于-12～-8℃反应20～40min后，蒸除有机溶剂，得到透明油状产物，不进行纯化而直接用于下一步反应；
s2.将上述产物溶解于氯仿中，加入三乙胺和丁二酸酐，回流搅拌反应后，经提纯得到最终产物为金刚烷胺半抗原。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述有机溶剂为甲醇。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述2-金刚烷酮与水合肼的质量比为15：4～8，优选15：6.3。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述水合肼的浓度为75％～85％，优选80％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述三乙胺和丁二酸酐的质量比为8～12：11～13，优选10.12：12.01。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述回流搅拌反应的时间为0.8～1.2h，优选1h。
本发明还公开了一种金刚烷胺抗原，是将式(i)所示的金刚烷胺半抗原与载体蛋白偶联制得。
本领域常用载体蛋白均可采用，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、鼠血清白蛋白(msa)、兔血清蛋白或甲状腺蛋白(tg)等中的一种或几种均可。其中，bsa的效果最佳。
本发明还公开了所述金刚烷胺抗原的制备方法，包括如下步骤：
s11.取金刚烷胺半抗原0.1～0.5mmol溶于n,n-二甲基甲酰胺中，边搅拌边加入二环己基碳二亚胺(dcc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)各0.2～1.0mmol，4～8℃下搅拌反应12～24h，离心取上清，得到金刚烷胺半抗原反应液；
s12.将载体蛋白溶0.1～0.3mol/lpbs中，得到载体蛋白溶液；
s13.搅拌条件下，将金刚烷胺半抗原反应液逐滴加入载体蛋白溶液中，4～8℃搅拌反应过夜；
s14.离心取上清液，用pbs于4℃条件透析2～3d，期间每天换液2～3次，得到金刚烷胺抗原。
本发明中的过夜是指8～16h。
本发明还公开了一种金刚烷胺特异性抗体，采用上述的金刚烷胺抗原制得。
所述金刚烷胺抗原可以作为免疫原制备金刚烷胺特异性抗体，也可以作为包被原制备化学发光酶标板。
应用金刚烷胺抗原制备得到的特异性抗体具体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
所述金刚烷胺抗原、所述特异性抗体均可应用于检测金刚烷胺。
本发明还公开应用所述金刚烷胺抗原、所述特异性抗体制备得到的化学发光酶联免疫检测试剂盒。
所述化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括：包被有金刚烷胺抗原的化学发光酶标板、金刚烷胺抗体工作液、酶标二抗、金刚烷胺标准品工作液、化学发光液和洗涤液、提取剂和复溶液。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述金刚烷胺抗原为所述金刚烷胺半抗原与牛血清白蛋白(bsa)的偶联物，所述金刚烷胺抗原的包被浓度为10～65.5μg/l。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，金刚烷胺抗原的包被液由1.69～2gna2co3和2.95～4gnahco3溶于1～1.5l去离子水中得到。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述化学发光酶标板为可拆不透明白色发光板。
所述化学发光酶标板是96孔可拆不透明酶标板，材质为聚苯乙烯，包被有能与抗金刚烷胺抗体特异性结合的金刚烷胺抗原，并封闭微孔表面未吸附金刚烷胺抗原的位点。
所述包被有金刚烷胺抗原的化学发光酶标板的制备方法为：用包被液将抗原按需要稀释，向发光板微孔中加入包被液，放入4℃环境进行孵育过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤，然后在每孔中加入封闭液，25℃孵育4h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
另外，可以作为固定金刚烷胺抗原固相载体的物质较多，例如聚苯乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、硅橡胶、琼脂糖凝胶等均可作为固定金刚烷胺抗原固相载体。该载体的形式可以为凹孔、纸片、小珠等。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述化学发光液由a液和b液组成使用时，按体积比1：1的比例混合。其中，a液为将8mg鲁米诺、20mg对碘苯酚、1.21gtris溶于100ml去离子水，最后使用hcl调ph至8.0。b液为1.21gtris和体积分数0.40％h2o2溶于100ml去离子水，最后使用hcl调ph至7.0。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述洗涤液为20倍浓缩洗涤液，是含有体积浓度0.5％tween20的磷酸盐缓冲液(0.4mol/l，ph7.40)；使用时用去离子水稀释成1倍洗涤液。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所采用提取剂优选为冰醋酸与水，比例为1：11。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述复溶液优选为ph为6.5、0.04mol/l的磷酸缓冲液。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所采用的酶标二抗为1.00mg/ml羊抗鼠igg二抗，工作浓度为0.67g/ml。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所采用的封闭液为将0.10g牛血清白蛋白(bsa)、5.00g甘氨酸、5.00g蔗糖溶于100mlpbs(0.01mol/l，ph7.40)溶液得到。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述金刚烷胺标准溶液在使用时用0.05mol/l、ph6.50的磷酸缓冲液(pb)将标准品溶液稀释成浓度为的一系列0.00μg/l、0.20μg/l、0.60μg/l、1.80μg/l、5.40μg/l、16.20μg/l金刚烷胺标准溶液。
更进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述磷酸缓冲液(pb)的配方为：分别称取1.16gnah2po4·12h2o和0.12gnah2po4，并加入去离子水定容至1l。
本发明制得的金刚烷胺化学发光酶联免疫检测试剂盒检测范围为0.20～16.2μg/l，灵敏度0.45μg/l，检出限为0.20μg/l，回收率为90.00％～104.22％。
本发明还提供了所述金刚烷胺化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包含如下步骤：
s21.取出试剂盒，置于20～25℃平衡30min以上；
s22.取出化学发光酶标板，往标准孔中加入不同浓度的金刚烷胺标准溶液，样品孔中加入待测样品，然后每孔加入酶标二抗，再加入金刚烷胺抗体工作液，盖上盖板膜振摇混匀，37℃孵育15min；
s23.吸除板孔中的反应液，用洗涤液进行洗涤5次，将酶标板拍干；所述洗涤液为20倍浓缩洗涤液稀释20倍得到；
s24.每孔加入化学发光液，轻拍混匀，盖上盖板膜，3min后测定各孔的发光强度值(rlu)；
s25.检测结果的计算与分析：确定样品中金刚烷胺的含量。
其中，抑制率(％)＝b/b0×100(％)，式中：b为不同浓度金刚烷胺的标准品溶液孔或待测样品孔的rlu；b0为0浓度金刚烷胺标准品溶液的rlu；
以抑制率为纵坐标，金刚烷胺浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而确定样品中金刚烷胺的含量。
s22所述的待测样品可以为鸡肉/肝、猪肉/肝等组织样品。
优选地，待测样品检测前需要进行前处理，方法如下：
取(2±0.05g)去除脂肪并匀浆化的待测样品于50ml离心管中，加入6ml乙腈，100μl盐酸水溶液，剧烈震荡2min；室温4000r/min以上离心5min；取4ml上清液于离心管中，于60℃氮气或空气吹干；加入0.5ml复溶液，充分涡动30s；取50μl进行分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明所述金刚烷胺化学发光酶联免疫检测试剂盒的检测范围为0.20～16.2μg/l，灵敏度0.45μg/l，检出限为0.20μg/l，回收率为90.00％～104.22％。该试剂盒检测快速、大大缩短了检测时间，不考虑检测人员技术水平的影响，整个检测过程仅仅需要30min左右即可完成，且检出限更低、灵敏度更高。同时，采用包被抗原的包被板大大提升了试剂盒的稳定性和精密度，检测更稳定、更准确。
2.本发明所述金刚烷胺化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、高特异性：与现有的金刚烷胺elisa试剂盒相比，克服了试剂盒检测过程中易受到内源性酶干扰、吸光度的检测也易受到多种外在因素的影响的弊端，本发明采用高特异性、高亲合力的抗体，检测金刚烷胺的化学发光酶免疫试剂盒灵敏度更高，可达到0.45μg/l。
3.另外，本发明所述试剂盒采用化学发光方法，不使用elisa试剂盒中的浓硫酸等有强腐蚀性的试剂、以及有强致癌性的底物，更加环保安全；且操作简单、成本低，适合大量样品或现场筛查的痕量分析与批量检测，具有重要的实际应用推广意义。
附图说明
图1为本发明金刚烷胺化学发光酶联免疫试剂盒的标准曲线。
图2为本发明金刚烷胺半抗原的合成路线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1金刚烷胺半抗原的制备
1、金刚烷胺半抗原的制备
(1)分别将15.0g2-金刚烷酮与6.3g80％的水合肼加到30ml甲醇溶液，于-10℃反应30min后，蒸除甲醇溶剂，得到透明油状产物，不进行纯化而直接用于下一步反应。
(2)将上述产物溶于30ml氯仿中，10.12g三乙胺和12.01g丁二酸酐，回流搅拌反应1h后，蒸除溶剂，残余物通过柱层析纯化得到白色固体产物，为金刚烷胺半抗原。并经质谱与核磁共振波谱方法鉴定合成成功，其波谱数据如下：esi-ms( ):265.155[m h] 。
其结构式如式(i)所示：
该金刚烷胺半抗原的合成路线如图2所示。
实施例2金刚烷胺抗原、包被原及特异性抗体的制备
1、金刚烷胺抗原的合成
(1)称取6.12mg实施例1制备的金刚烷胺半抗原，溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，加入4.3mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5.2mg的n-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应2h，得到溶液c；
(2)将50mg的bsa溶于5ml的0.1mol/l的碳酸氢钠缓冲液中，得到蛋白溶液；
(3)将上述溶液c逐滴加入到蛋白溶液中，室温搅拌过夜，4℃下用pbs溶液透析3d，期间换透析液6次；将透析液在无菌条件下用0.22μm孔径的滤膜过滤，分装于安培瓶中，-20℃保存。
将该金刚烷胺抗原作为金刚烷胺免疫原。
2、金刚烷胺包被原的合成
方法同上述金刚烷胺抗原的制备方法。
3、金刚烷胺单克隆抗体的制备
(1)动物免疫：用上述制备出的免疫原按150μg/只以生理盐水溶解后，与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6、8周龄的balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物150μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次；
(2)细胞融合：取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂(peg4000)进行融合，用hat培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，在37℃，5％co2培养箱中培养，5天后用ht培养基半换液，9天时进行全换液；
(3)阳性杂交瘤的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞；初选采用间接elisa方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠igg-hrp和igm-hrp，opd进行显色反应；筛选出的阳性孔再用间接竞争elisa方法筛选，先将细胞上清与100μg/ml的金刚烷胺等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中；同时用pbs取代金刚烷胺作对照，其余步骤同上；若经金刚烷胺阻断后的od450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2、3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化；
(4)杂交瘤细胞的扩大培养：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接elisa测定效价，冻存；并取8～10周龄的balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，7～10天后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×106/只，7～10天后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。
4、包被原浓度与抗体浓度的优选
(1)将2.62mg/ml的金刚烷胺抗原按照不同倍数稀释(如1:10000、1:20000、1:40000、1:80000)，并纵向按150μl/孔包被至不透明白色发光板，4℃孵育过夜，用洗涤液洗涤两次，吸水纸上拍干。
(2)加入封闭液170μl/孔，25℃封闭4h，甩干放入烘箱。
(3)加入50μl/孔pbs稀释的不同梯度的金刚烷胺标准品溶液。
(4)加入50μl/孔酶标二抗，再加入50μl/孔用pbs稀释的不同梯度的金刚烷胺单克隆抗体(1:10000、1:50000、1:100000、1:150000)，37℃孵育15min，洗板5次，吸水纸上拍干。
(5)每孔分别加入化学发光液a液和b液各50μl，轻拍混匀，盖上盖板膜，3min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值rlu。以发光值随包被原浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释浓度为最佳浓度进行特异性测定。得到包被原最佳浓度为65.5μg/l，抗体稀释倍数为100000倍。
5、抗体灵敏度的测定
以包被浓度为包被原最佳浓度为65.5μg/l，金刚烷胺单克隆抗体稀释100000倍后，进行抗体灵敏度的测定。
(1)取96孔不透明白色发光板，将包被原用稀释液稀释至65.5μg/l，每孔加入150μl，37℃孵育过夜，用洗涤液洗涤两次，吸水纸上拍干
(2)加入170μl/孔封闭液，37℃封闭2h，甩干放入烘箱。
(3)加入50μl/孔pb稀释的不同梯度的金刚烷胺标准品溶液。
(4)依次加入50μl/孔酶标二抗和50μl/孔100000倍稀释的金刚烷胺抗体，37℃孵育15min，洗板5次，吸水纸上拍干。
(5)每孔分别加入化学发光液a液和b液各50μl，轻拍混匀，盖上盖板膜，3min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值rlu。
(6)结果以抑制率(ic50)计算，抑制率(％)＝b/b0×100(％)，b为不同标准浓度溶液竞争的发光值，b0为不加标准品的发光值，计算ic50为0.45μg/l，即金刚烷胺单克隆抗体的灵敏度为0.45μg/l。
实施例3金刚烷胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒的制备
1、准备试剂：
(1)包被有金刚烷胺抗原的酶标板：96孔可拆酶标板，包被金刚烷胺抗原及封闭液，包被浓度为65.5μg/l。所述金刚烷胺抗原为金刚烷胺半抗原与bsa的偶联物。
将包被抗原用包被液稀释至65.5μg/l，每孔内加入150μl包被液，37℃孵育过夜，倾去孔内液体，洗涤液洗涤2次，拍干。然后每孔中加入170μl封闭液，37℃孵育2h，倾去孔内液体，置于37℃烘箱中烘干后，用铝箔袋真空密封4℃保存。
(2)金刚烷胺标准品溶液的配制：准确称取金刚烷胺标准品溶液，用色谱级甲醇稀释成1.00mg/ml，再用0.04mol/lpb缓冲液(配方为1.16gnah2po4·12h2o、0.12gnah2po4，定容至1l)分别配制0.00μg/l、0.20μg/l、0.60μg/l、1.80μg/l、5.40μg/l、16.20μg/l金刚烷胺溶液，4℃保存。
(3)金刚烷胺单克隆抗体浓度为6.00mg/ml；其工作浓度为1:100000，用pbs进行稀释。
(4)化学发光液：由a液和b液组成；使用时将a液和b液按体积比1:1的比例混合。a液的配制方法为：将20.00mg对碘苯酚、8.00mg鲁米诺、1.21gtris溶于100ml去离子水，用盐酸调ph至8.50；b液的配制方法为：将体积分数0.40％h2o2、1.21gtris溶于100ml去离子水，用盐酸调ph至7.00。
(5)20倍浓缩洗涤液：使用时用去离子水稀释成1倍洗涤液。
(6)酶标二抗的配置：1.00mg/ml羊抗鼠igg二抗稀释至0.67g/ml。
2、试剂分装
将各试剂测定合格后无菌分装，已稀释的金刚烷胺标准品系列溶液lml/瓶，金刚烷胺抗体7ml/瓶，酶标二抗7ml/瓶，化学发光液a液7ml/瓶，化学发光液b液7ml/瓶，20倍浓缩洗涤液50ml/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃保存。
3、试剂盒的组装
分别将上述包被有金刚烷胺抗原的化学发光酶标板1块，金刚烷胺抗体、酶标二抗、化学发光液a液、化学发光b液、20倍浓缩洗涤液各1瓶，金刚烷胺标准品溶液6瓶和使用说明书1份置于试剂盒内指定位置，试剂盒检验合格后封装，4℃保存。
实施例4金刚烷胺化学发光酶联免疫检测试剂盒的应用
1、样品前处理：适用于检测鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝等样品。
(1)取(2±0.05)g去除脂肪并匀浆化的样品于50ml离心管中，加入6ml乙腈，100μl提取液，剧烈震荡2min；
(2)室温4000r/min以上离心5min；
(3)取4ml上清液于离心管中，于60℃氮气或空气吹干；
(4)加入0.5ml复溶液，充分涡动30s；
(5)取50μl进行分析。
2、利用本发明实施例3的试剂盒进行检测
(1)取出实施例3的试剂盒，置于室温(20～24℃)平衡30min以上，
(2)取出化学发光酶标板，在标准孔加入50μl不同浓度的标准品溶液，样品孔加入50μl待测样品，然后每孔加入50μl酶标二抗，再加入50μl金刚烷胺抗体，盖上盖板膜在微量振荡器上振摇10min后，置于37℃孵育15min。
(3)吸除板孔中的反应液，各孔加入洗涤液约300μl，静置20s左右，除去其中液体，如此共洗5次，最后一次将板拍干；也可用自动洗板机洗板5次，洗完后将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每轮洗板拍打3次)，以保证完全除去孔中的液体。
(4)每孔分别加入化学发光液a液和b液各50μl，轻拍混匀，盖上盖板膜，3min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值rlu，保存数据。
3、检测结果计算与分析
抑制率(％)＝b/b0×100(％)，式中：b为不同浓度金刚烷胺的标准品溶液孔或待测样品孔的发光值；b0为0浓度金刚烷胺标准品溶液发光值；以抑制率为纵坐标，金刚烷胺浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，以样品孔的吸光值代入上述标准曲线中求出待测样品中金刚烷胺的含量。不考虑检测人员操作熟练程度的影响，整个检测过程仅仅需要30min内即可完成。检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析。
4、标准曲线
通过对标准品溶液的检测结果分析得到金刚烷胺标准曲线图(如附图1所示)，表明了本发明试剂盒对金刚烷胺的线性检测范围为0.20～16.20μg/l，灵敏度为0.45μg/l，检出限为0.20μg/l。
实施例5金刚烷胺化学发光酶联免疫检测试剂盒的应用评价
1、试剂盒灵敏度和检测限
按照常规方法测定实施例3制得的试剂盒灵敏度，标准曲线的范围为0.00～16.20μg/l，ic50的浮动范围为0.46～0.89μg/l；对20份样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限。
试验结果显示，本发明检测方法对动物组织的检测限均为0.20μg/kg。
2、准确度和精密度试验
向不含金刚烷胺的组织样品中添加金刚烷胺标准品，使金刚烷胺标准品在样品中的终浓度分别为0.50μg/l、1.00μg/l、2.00μg/l，将添加后的样品分别按照上述方法进行前处理，得到检测样本溶液。从三个不同批次的实施例3制得的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，检测方法如上所述，每个实验重复4次，分别计算变异系数。其中：
(1)以回收率作为准确度评价指标，其计算公式为：样品的添加浓度回收率的计算方法:平均回收率(rg)＝测定值与真实值的比值×100％。
(2)变异系数的计算方法：变异系数(cv)＝(各平行样本的标准差与各平行样本平均值的比值)×100％；其中批内变异系数的计算方法:批内cv＝同一次测定中各平行样本的变异系数，取其平均值；批间变异系数的计算方法:批间cv＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。
(3)结果见表1。
实验结果表明：本发明的试剂盒的平均回收率在之间；批内、批间相对标准偏差均小于20％。
表1准确度和精密度试验结果
3、试剂盒保存期的试验
(1)将实施例3的试剂盒放置于2～8℃，分别取放置0、2、4、6、8、9、10、11和12个月的试剂盒，对金刚烷胺标准样品的发光值、ic50、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。
(2)将试剂盒在37℃保存的条件下放置12天，每天对金刚烷胺标准样品的发光值、ic50、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。
(3)将试剂盒在-20℃冰箱保存12天，每天对金刚烷胺标准样品的发光值、ic50、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。
结果表明，经过三种条件保存试验，该试剂盒各项指标完全符合要求，因此，从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃保存12个月。
从以上结果可得出，本发明的试剂盒可以在2～8℃至少可以保存一年。
4、交叉反应率试验
选择与金刚烷胺结构或功能相似的其他药物进行交叉反应试验，通过各种药物的标准曲线分别得到ic50和交叉反应率。与其他药物的交叉反应率越小，说明金刚烷胺化学发光检测试剂盒对金刚烷胺的检测特异性越好。结果见表2。
表2金刚烷胺试剂盒交叉反应率
实验结果表明：除金刚乙胺以外，与结构类似物和功能类似物的交叉反应率均小于0.01％，受其他化合物的影响小，该抗体特异性好，不易出现假阳性、错检等现象，可以应用于实际样品中金刚烷胺残留的筛查检测；使用本发明得到的抗体建立免疫检测试剂盒不仅能特异、快速检测金刚烷胺，还能检测金刚烷胺结构类似物(金刚乙胺)，这对动物组织中金刚烷胺残留的快速检测具有很重要的现实意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种金刚烷胺半抗原，其特征在于，其结构式如式(i)所示：
2.权利要求1所述金刚烷胺半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
s1.分别将2-金刚烷酮与水合肼加入到有机溶剂中，于-12～-8℃反应20～40min后，蒸除有机溶剂，得到透明油状产物；
s2.将上述产物溶解于氯仿中，加入三乙胺和丁二酸酐，回流搅拌反应后，经提纯得到最终产物为金刚烷胺半抗原。
3.根据权利要求2所述金刚烷胺半抗原的制备方法，其特征在于，所述2-金刚烷酮与水合肼的质量比为15：4～8；所述水合肼的浓度为75％～85％。
4.根据权利要求2所述金刚烷胺半抗原的制备方法，其特征在于，所述三乙胺和丁二酸酐的质量比为8～12：11～13；所述回流搅拌反应的时间为0.8～1.2h。
5.一种金刚烷胺抗原，其特征在于，是将权利要求1所述的金刚烷胺半抗原与载体蛋白偶联制得。
6.根据权利要求5所述的金刚烷胺抗原，其特征在于，所述载体蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、兔血清蛋白或甲状腺蛋白中的一种或几种。
7.一种金刚烷胺特异性抗体，其特征在于，采用权利要求5或6所述的金刚烷胺抗原制得。
8.权利要求5或6所述金刚烷胺抗原、权利要求7所述特异性抗体在检测金刚烷胺中的应用。
9.应用权利要求5或6所述金刚烷胺抗原、权利要求7所述特异性抗体制备得到的化学发光酶联免疫检测试剂盒。
10.权利要求9所述化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有权利要求5或6所述金刚烷胺抗原的化学发光酶标板、权利要求7所述金刚烷胺特异性抗体、酶标二抗、金刚烷胺标准溶液、化学发光液和洗涤液；
所述金刚烷胺抗原为金刚烷胺半抗原与牛血清白蛋白的偶联物，所述金刚烷胺抗原的包被浓度为10～65.5μg/l；
金刚烷胺抗原的包被液由1.69～2gna2co3和2.95～4gnahco3溶于1～1.5l去离子水中得到。
技术总结