本发明属于l-trp的分离纯化领域，具体涉及超高交联吸附树脂对发酵液中l-trp的分离方法。
背景技术：
l-trp是人和动物的必需氨基酸之一。它在医药、食品和饲料等行业具有广泛的应用。在医药行业，l-trp在治疗抑郁症、失眠、高血压、癞皮病等方面已经得到了广泛应用；在食品行业，l-trp已经广泛地用作食品添加剂，如作为抗氧化剂、调味剂、防腐剂等，还能提高机体对植物蛋白的利用效率；在饲料行业，l-trp已被我国农业部确认为除赖氨酸和蛋氨酸之后的第三大氨基酸饲料添加剂，它能够调控动物体内脂肪的代谢，减少脂肪堆积，增加畜禽肝脏及身体整体组分中蛋白质的含量，降低肥肉比例。而且l-trp对畜禽的免疫功能也有一定的改善作用。在农业领域，l-trp可以用做杀虫剂，作用于一些毛虫，使其拒食而亡，还能使农药中的两种主要物质环磷酸和水杨酸的稳定性增强，从而增强其杀虫效果。
利用廉价碳源(葡萄糖、玉米粉、麦麸等)为生产原料的微生物直接发酵法是目前采用最广泛的l-trp生产方法。经脱除色素和蛋白质等预处理后，l-trp发酵液中除了含有高浓度溶解性盐(主要是氯化钠和硫酸铵)，还存在多种副产物氨基酸，如l-谷氨酸(l-glu)、甘氨酸、天冬氨酸等，其中主要是l-glu。l-trp的分离纯化过程所需成本约占整个生产过程成本的60％，该过程是制约l-trp产业发展的关键步骤之一。目前，发酵液中l-trp的分离纯化所采用的方法主要有离子交换法和反胶团萃取等。杨旭锦采用反胶团萃取技术从微滤膜和超滤膜预处理后的发酵液中分离了l-trp，再经纳滤、结晶、干燥等工序制备了含量高于98％的l-trp产品(中国专利公开号：cn102382030a)。但是反胶团萃取很难应用于l-trp的大规模工业生产。福建师范大学贺希娜采用阳离子交换树脂d061分离了发酵液中的l-trp，以2mol/l的氨水作为洗脱剂，收集得到的l-trp产品经过阴离子交换树脂脱色、浓缩结晶等工序，得到了纯度达98.4％的l-trp，但是该工序所用的阳离子交换树脂的再生需要消耗大量的强酸和强碱，而且发酵液中的高浓度盐的存在会大大降低树脂的交换容量和分离效率(贺希娜.发酵液中l-色氨酸的分离纯化研究.福州：福建师范大学.2013)。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种超高交联吸附树脂对l-trp的分离方法。
本发明采用的技术方案如下：
超高交联吸附树脂对l-trp的分离方法，所用的分离方法是吸附法，所用吸附剂为弱极性超高交联吸附树脂；该弱极性超高交联吸附树脂的骨架为聚苯乙烯-二乙烯基苯，功能基团是羰基或酯基中至少一种的弱极性基团；所述弱极性超高交联吸附树脂平均粒径为0.2～1mm，含水量为30％～60％，最可能几率孔径为1～10nm，比表面积为800～1800m2/g，孔容为0.5～1.4cm3/g。
进一步的，在吸附法中，所用的原料液是脱除固形物后的l-trp发酵液，主要成分为l-trp、l-glu和无机盐。
进一步的，分离过程采用固定床操作方式，固定床高径比为10:1～15:1，上样量可达25mg/g树脂，原料液ph可为3～8.5，用ph为10～12.5之间的氢氧化钠为洗脱剂，洗脱流速为0.5～2bv/h。
吸附法具体工艺如下：
a.超高交联吸附树脂对l-trp的分离
将一定体积的l-trp原料液通入到层析柱中后，在一定的洗脱流速条件下对l-trp进行洗脱。
b.l-trp和l-glu浓度的检测
本发明中使用柱前衍生高效液相色谱法对l-glu的浓度进行定量检测，柱前衍生步骤为：
将样品稀释一定倍数后，准确量取10μl，转移到2ml离心管中，加入200μl衍生缓冲溶液和300μl衍生试剂溶液后充分混合均匀，将离心管至于65℃水浴锅暗处恒温加热1h后取出，静置待溶液冷却至室温，加入定容缓冲液定容至1.2ml并摇匀，使用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤后使用高效液相色谱仪进行分离测定。所用衍生缓冲溶液为42g/lnahco3的水溶液，衍生试剂为10g/l2,4-二硝基氟苯的乙腈溶液，定容缓冲液为0.1mol/lnaoh作为溶剂的6.8g/lk2hpo4·h2o。
检测条件为：
(1)色谱柱：c18色谱柱(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；
(2)流动相：a：浓度为50％的甲醇-水溶液；b：4.1g/l的乙酸钠水溶液，用乙酸将ph调节至6.4。
流动相梯度洗脱程序如下表所示：
表1流动相洗脱梯度
(3)流动相流速：1.0ml/min；
(4)检测波长：360nm；
(5)柱温：33℃；
(6)进样体积：10μl。
检测步骤：
(1)柱子的平衡：配制好的缓冲液以及去离子水用孔径0.22μm的水系微孔滤膜过滤，甲醇用孔径0.45μm的尼龙微孔滤膜过滤，过滤后进行超声处理30min。打开高效液相色谱仪，采用16％的流动相a和84％的流动相b，以1ml/min的流速冲洗色谱柱60min左右；待泵压力稳定而且基线趋于水平线时，平衡结束。
(2)样品的检测：按照检测条件编写分析程序以及进样序列，将预处理后的标准品以及样品按照进样序列放置在自动进样器的相应位置上，开始进样并收集图谱信息，根据峰面积计算样品的浓度。
本发明中使用紫外-可见分光光度计对l-trp的浓度进行定量检测，检测波长为218nm。
本发明中所述的bv/h为每小时流过树脂柱的床层体积(bedvolume)的倍数，bv为床层体积。
本发明的有益效果：
(1)将超高交联吸附树脂应用于l-trp的分离，对l-trp的分离效果好，不需要大量的强酸和强碱对树脂进行再生，可大大降低酸碱的消耗量，同时可以提高分离所得产品纯度，提高分离效率。
(2)本发明中所使用的超高交联吸附树脂不仅可以用于l-trp的分离过程，还可以应用于其他带有疏水基团的小分子两性化合物如l-苯丙氨酸、对氨基酸苯甲酸等的分离。
附图说明
图1为l-trp和l-glu在超高交联吸附树脂nhp-200固定床中的分离过程洗脱曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：l-trp和l-glu的固定床分离。
(1)装柱
将预处理好的超高交联吸附树脂nhp-200采用湿法装柱法装入到层析柱中，树脂装填量为10.5g，层析柱内径为1cm。
(2)上样和洗脱
将树脂上端的液体流出至高于树脂面约1.5cm，然后将20mll-trp和l-glu混合溶液上样到层析柱中，进样速度为0.4ml/min。然后开始用ph为12的氢氧化钠溶液进行洗脱，流速为0.4ml/min，并在层析柱出口处每隔10min收集一个样品，直至树脂中l-trp和l-glu被完全洗脱。用高效液相色谱仪分析样品中l-glu的浓度，用紫外-可见分光光度计分析样品中l-trp的浓度。l-trp和l-glu的洗脱曲线如图1所示。l-trp和l-glu产品的纯度均高于98％，收率均高于98％。
实施例2：l-trp和l-glu的固定床分离。
(1)装柱
将预处理好的超高交联吸附树脂nhp-200采用湿法装柱法装入到层析柱中，树脂装填量为10.5g，层析柱内径为1cm。
(2)上样和洗脱
将树脂上端的液体流出至高于树脂面约1.5cm，然后将1.5mll-trp和l-glu混合溶液上样到层析柱中，进样速度为0.2ml/min。然后开始用ph为12的氢氧化钠溶液进行洗脱，流速为0.2ml/min，并在层析柱出口处每隔15min收集一个样品，直至树脂中l-trp和l-glu被完全洗脱。用高效液相色谱仪分析样品中l-glu的浓度，用紫外-可见分光光度计分析样品中l-trp的浓度。l-trp和l-glu产品的纯度均高于99％，收率均高于98％。
1.超高交联吸附树脂对l-trp的分离方法，其特征在于，所用的分离方法是吸附法，所用吸附剂为弱极性超高交联吸附树脂；该弱极性超高交联吸附树脂的骨架为聚苯乙烯-二乙烯基苯，功能基团是羰基或酯基中至少一种的弱极性基团；所述弱极性超高交联吸附树脂平均粒径为0.2～1mm，含水量为30％～60％，最可能几率孔径为1～10nm，比表面积为800～1800m2/g，孔容为0.5～1.4cm3/g。
2.根据权利要求1所述的超高交联吸附树脂对l-trp的分离方法，其特征在于，在吸附法中，所用的原料液是脱除固形物后的l-trp发酵液，主要成分为l-trp、l-glu和无机盐。
3.根据权利要求1所述的超高交联吸附树脂对l-trp的分离方法，其特征在于，采用吸附法分离过程中采用固定床操作方式，固定床高径比为10:1～15:1，上样量可达25mg/g树脂，原料液ph可为3～8.5，用ph为10～12.5之间的氢氧化钠为洗脱剂，洗脱流速为0.5～2bv/h。
技术总结