背景技术：
核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。
核酸探针技术是目前分子生物学中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异rna或dna序列的有力工具。核酸探针可用以检测任何特定病原微生物，并能鉴别密切相关的毒(菌)株和寄生虫。核酸探针按性质可划分为基因组dna探针、cdna探针、rna探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。目前，各种常见病毒病的诊断和研究都已应用到核酸探针技术。但该项技术的操作毕竟比常规方法复杂，费用较高，在动物检疫中尚未推广。多在实验室内对病原作深入研究时使用。
dna微阵列(dnamicroarray)也叫寡核苷酸阵列(oligonucleitidearray)，是人类基因组计划(humangeneomeproject，hgp)的逐步实施和分子生物学的迅猛发展及运用的产物，它是生物学家受到计算机芯片制造和广为应用的启迪，融微电子学、生命科学、计算机科学和光电化学为一体，在原来核酸杂交(northern、southern)的基础上发展起来的一项新技术，是生物芯片中的一种。该技术的原理是在固体表面上集成已知序列的基因探针，被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交，通过检测相应位置杂交探针，实现基因信息的快速检测。
dna微阵列技术最突出的特点就是可一次性检测多种样品，获得多种基因的差别表达图谱。因此，dna微阵列是对不同材料中的多个基因表达模式进行平行对比分析的一种高产出的、新的基因分析方法。与传统研究基因差异表达的方法相比，它具有微型化、快速、准确、灵敏度高，以及在同一芯片上同时大信息量平行检测的优势。
但是，目前的探针分子生物检测方法仍存在制造成本高，生物分子通量小的缺陷，进而导致生物分子检测成本高的缺陷。
技术实现要素：
本发明公开的生物分子检测方法，利用探针分子印刷芯片通过微米结构的流道、即微流道把不同种类的探针分子固定在衬底基板上，用于高灵敏地捕获目标生物分子，捕获目标生物分子后通过荧光或其它光学信号的形式将其表达出来以实现生物分子的检测。该探针分子印刷芯片上具有微米尺寸的探针分子阵列，因此可以实现在很小的面积上印刷高密度的探针分子阵列；采用该探针分子印刷芯片进行生物分子检测，可以实现高通量的生物分子检测；而且该探针分子印刷芯片中使用试剂体积在纳升级，所以可以大幅减小试剂成本，降低使用成本,极大地提高生物分子检测便利性。
本发明公开的生物分子检测方法包括如下步骤：
一，制备微流控芯片；微流控芯片包括柔性衬底和设置在柔性衬底上沿柔性衬底表面延伸的多个微沟槽结构；
二，制备功能化衬底基板；功能化衬底基板包括衬底基板以及涂覆在其上表面上的功能化材料；
三，制备探针分子印刷芯片；探针分子印刷芯片包括微流控芯片和功能化衬底基板，其中功能化衬底基板的上表面面向微流控芯片的微沟槽结构，覆盖在微流控芯片上，在微流控芯片和功能化衬底基板之间形成微流道；
四，探针分子微印刷。
其中，制备微流控芯片包括如下步骤：
步骤(一)硅片清洗；先把硅片放入第一清洗溶液中清洗，取出硅片用第二清洗溶液清洗；然后去除硅片表面的氧化硅；
步骤(二)硅片刻蚀；在清洗干净的硅片上旋涂光刻胶；然后用曝光机和包括微沟槽图案的光刻版对硅片上的光刻胶进行曝光，把光刻版上的图形转移到硅片上；曝光后的硅片在显影液中显影，曝光部分的光刻胶被显影液溶解；将显影后的硅片进行烘烤；然后把硅片放入刻蚀机中对硅片进行刻蚀，没有光刻胶保护的部分被刻蚀掉；刻蚀之后把硅片上的光刻胶溶解，然后冲洗硅片，最后把硅片吹干；得到其上形成有微沟槽结构的硅片；
步骤(三)微流控芯片制作；将柔性材料覆盖在硅片上，烘烤，柔性材料固化形成柔性衬底，同时将硅片上的微沟槽结构转移到柔性衬底上，将柔性衬底和硅片分离；其中微沟槽结构是沿着柔性衬底表面延伸的微米级沟槽；
其中，探针分子微印刷包括如下步骤：
配置探针分子溶液；
用输入管吸取探针分子溶液连接到微流道的入口，并记录每种探针分子加载入口的位置或编号；
把输入管接到具有压力调节功能的加压装置上，使探针分子从入口缓慢地流通到出口，以印刷探针分子；探针分子从入口流到出口的过程中被衬底基板表面的功能化材料固定；
探针分子固定在衬底基板上，dna探针分子通过互补序列的螺旋合成捕获具有互补序列的基因片段，固定的抗体蛋白探针分子捕获特异性的蛋白分子，加入荧光信号，将基因信息或蛋白信息显现出来。
其中，探针分子微印刷是将探针分子固定在探针分子印刷芯片的微流道中；
其中，探针分子包括dna探针分子和抗体蛋白探针分子；dna探针分子用于dna基因片段、mrna或mirna生物分子的捕获；抗体蛋白探针分子通过跟细胞分泌的抗原或细胞膜蛋白结合用于细胞分泌蛋白的分泌或特定细胞的捕获与分离。
其中，对于dna探针分子和抗体蛋白探针分子溶液，dna探针分子的浓度为1um-100um,抗体蛋白探针分子可以使用原液或稀释2-100倍；
本发明的生物分子检测方法，通过将探针分子印刷芯片进行微印刷，由于探针分子固定在衬底基板上，dna探针分子可以通过互补序列的螺旋合成机理捕获具有互补序列的基因片段，固定的抗体可以捕获特异性的蛋白分子，通过荧光信号的加入，把基因信息或蛋白信息显现出来。
本发明的生物分子检测方法，采用微印刷技术首先制成功能化的微流道，在微流道中固定探针分子，可以制成具有微米尺寸探针分子阵列的探针分子印刷芯片，由此可以在很小的面积上印刷高密度的探针分子阵列，从而实现高通量的生物分子检测。另外，由于探针分子印刷芯片中的微流道的截面积非常小，在其中用的试剂体积在纳升级，所以可以大幅度缩小试剂成本，降低生物分子检测的成本。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更清楚的理解本发明的探针分子印刷芯片，下面详细描述其具体实施方式。
本发明公开的探针分子印刷芯片的制造方法包括如下步骤：
一、制备微流控芯片，微流控芯片上具有微沟槽结构阵列，微流控芯片是从具有同样微槽结构阵列的硅片上用柔性材料注模得到。
制备微流控芯片的方法包括如下步骤：
步骤(一)硅片清洗；先把硅片放入第一清洗溶液中清洗，取出硅片用第二清洗溶液清洗；然后去除硅片表面的氧化硅；
步骤(二)硅片刻蚀；在清洗干净的硅片上旋涂光刻胶；然后用曝光机和包括微沟槽图案的光刻版对硅片上的光刻胶进行曝光，把光刻版上的图形转移到硅片上；曝光后的硅片在显影液中显影，曝光部分的光刻胶被显影液溶解；将显影后的硅片进行烘烤；然后把硅片放入刻蚀机中对硅片进行刻蚀，没有光刻胶保护的部分被刻蚀掉；刻蚀之后把硅片上的光刻胶溶解，然后冲洗硅片，最后把硅片吹干；得到其上形成有微沟槽结构的硅片；
步骤(三)微流控芯片制作；将柔性材料覆盖在硅片上，烘烤，柔性材料固化形成柔性衬底，同时将硅片上的微沟槽结构转移到柔性衬底上，将柔性衬底和硅片分离；其中微沟槽结构是沿着柔性衬底表面延伸的微米级沟槽；
在一个具体实施方式中，制备微流控芯片的方法包括如下步骤：
硅片清洗：先把硅片放入浓硫酸和双氧水(4:1)溶液在玻璃器皿中并加热到100℃清洗20分钟，取出硅片用去离子水清洗5分钟；配置1:100的boe(氧化物刻蚀缓冲液)氧化硅刻蚀溶液，把硅片放入boe溶液中刻蚀1分钟以去除表面的氧化硅；去除硅片在去离子水中清洗5分钟；用氮气枪把硅片吹干。
硅片刻蚀：在清洗干净的硅片上旋涂光刻胶s1803,旋涂转速3000转，在95℃前烘1分钟，然后用紫外曝光机和已经设计好的光刻版对硅片上的光刻胶进行曝光，把光刻版上的图形转移到硅片上；曝光后的硅片在显影液中显影，曝光部分的光刻胶被显影液溶解；显影后的硅片在120℃烘烤2分钟；然后把硅片放入干法刻蚀机中对硅片进行刻蚀，没有光刻胶保护的部分被刻蚀掉；刻蚀之后把硅片放入丙酮溶液中溶解光刻胶，然后一次用isopropanol溶液和去离子水冲洗硅片，最后用氮气枪把硅片吹干。
微流控芯片制作：把硅片上的微槽结构转移到比较柔软的材料比如pmma或pdms硅胶上。以pdms硅胶为例，pdms的主剂和硬化剂为液态，把他们以一定比例混合均匀，然后除去气泡，倒在硅片上，硅片放入夹具中可以盛放一定体积的pdms；然后把浇注pdms的硅片放入80℃的烘箱中烘烤1小时，在空气中冷却，此时硅片上的微槽图案已经转移到硅胶上；硅片冷却后，把pdms微流控芯片从硅片上分离下来。
二，制备探针分子印刷芯片；
制备探针分子印刷芯片包括两个步骤：
步骤(一)，提供衬底基板，将衬底基板的上表面功能化；其中，将衬底的上表面功能化的方法为在衬底基板的上表面涂覆一层赖氨酸分子层或石墨烯；
步骤(二)，将上表面功能化的衬底基板的上表面面向微流控芯片的微沟槽结构，覆盖在微流控芯片上，形成功能化的微流道；其中微流道是具有微沟槽结构的微流控芯片与衬底基板键合形成完整封闭的微米级流道。
其中，每个微流道的两个端头通过打孔与外界相连以便样本的加入和流出，分别为微流道的入口和出口。
其中，每个微流道的宽度为5-200um，优选10-100um；相邻微流道之间的间距为10-40um，优选20-30um；微流道的入口和出口的直径为0.1-5mm，优选0.5-3mm；入口跟加载样本的工具接口匹配；出口跟检测试剂的工具接口匹配；微流道包括直线形微流道和s形微流道。
在一个具体实施方式中，以玻璃基板作为衬底基板为例，探针分子的固定需要对玻璃基板表面进行功能化，比如在玻璃基板表面涂覆一层赖氨酸分子层或石墨烯，赖氨酸和石墨烯可以跟dna探针分子或抗体蛋白结合以起到固定它们的作用。
在玻璃基板上涂覆赖氨酸的步骤：
第一，把玻璃基板放入去离子水中，用超声清洗1小时，然后换新的去离子水超声1小时，至少3次循环。
第二，把超声过的玻璃基板取出并用氮气枪吹干。
第三，把吹干的玻璃基片浸泡在5％的赖氨酸溶液中晃动一个小时。
第四，取出玻璃基片快速用氮气枪吹干并密封干燥保存。
在印刷芯片中，包括功能化的微流道。其中微流道是具有微槽结构的柔性芯片与光滑的玻璃基板或硅片衬底键合形成完整封闭的流道。
每个微流道的两个端头通过打孔与外界相连以便样本的加入和流出，分别命名为入口和出口。每个微流道的宽度10-100um，流道之间的间距20-30um。流道的形状、长度和并行数可以根据生物检测的需要进行设置。微流道的入口和出口直径0.5-3mm，入口和出口跟加载样本和试剂的工具接口匹配。
三，探针分子微印刷；
探针分子微印刷；其中探针分子微印刷是将探针分子固定在探针分子印刷芯片的微流道中；
其中，探针分子包括dna探针分子和抗体蛋白探针分子；dna探针分子用于dna基因片段、mrna或mirna生物分子的捕获；抗体蛋白探针分子通过跟细胞分泌的抗原或细胞膜蛋白结合用于细胞分泌蛋白的分泌或特定细胞的捕获与分离。
其中，探针分子微印刷包括如下步骤：
配置探针分子溶液，其中对于dna探针分子和抗体蛋白探针分子溶液，dna探针分子的浓度为1um-10um,抗体蛋白探针分子可以使用原液或稀释2-100倍；
用输入管吸取探针分子溶液连接到微流道的入口，并记录每种探针分子加载入口的位置或编号；
把输入管接到具有压力调节功能的压力瓶上，使探针分子从入口缓慢地流通到出口，以印刷探针分子；探针分子从入口流到出口的过程中被衬底基板表面的功能化材料固定；
通过上述步骤，即可制得本发明的探针分子印刷芯片。
在一个具体实施方式中，探针分子微印刷的过程包括如下步骤：
配置dna探针分子和抗体溶液浓度，探针分子浓度1um-10um,把抗体浓度稀释100倍。
用带有针头的塑料管吸取2ul的dna探针分子或抗体溶液分别连接到微流道的入口，并记录每种探针分子加载入口的位置或编号。
把塑料管接到具有压力调节功能的氮气瓶上，把压力控制在1-10psi用于把探针分子从入口缓慢地流通到出口，以达到印刷探针分子的目的。探针分子从入口流到出口的过程中被玻璃基板表面的赖氨酸或其他功能材料固定。
通过上述步骤，即可制得本发明的探针分子印刷芯片。
本发明的探针分子印刷芯片中，由于探针分子固定在玻璃基板上，dna探针分子可以通过互补序列的螺旋合成机理捕获具有互补序列的基因片段，固定的抗体可以捕获特异性的蛋白分子，通过荧光信号的加入，把基因信息或蛋白信息显现出来。
比如抗体捕获特异性的蛋白之后，通过加入带有荧光标记的第二抗体与特异性蛋白结合表达出荧光信号，最后通过检测荧光信号的强度对特异性蛋白进行定量检测。
本发明的探针分子印刷芯片，采用微印刷技术首先制成功能化的微流道，在微流道中固定探针分子，可以实现微米尺寸的探针分子阵列，由此可以在很小的面积上印刷高密度的探针分子阵列，从而实现高通量的生物分子检测。另外，由于微流道的截面积非常小，在其中用的试剂体积在纳升级，所以可以大幅度缩小试剂成本，降低生物分子检测的成本。
以上通过具体实施方式描述了本发明的细胞分布分析装置，但应当理解，其不用于限定本发明，本领域技术人员可对其进行常见的变型，本发明的保护范围以权利要求书为准。
1.一种生物分子检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
一，制备微流控芯片；微流控芯片包括柔性衬底和设置在柔性衬底上沿柔性衬底表面延伸的多个微沟槽结构；
二，制备功能化衬底基板；功能化衬底基板包括衬底基板以及涂覆在其上表面上的功能化材料；
三，制备探针分子印刷芯片；探针分子印刷芯片包括微流控芯片和功能化衬底基板，其中功能化衬底基板的上表面面向微流控芯片的微沟槽结构，覆盖在微流控芯片上，在微流控芯片和功能化衬底基板之间形成微流道；
四，探针分子微印刷。
2.如权利要求1所述的生物分子检测方法，其特征在于，制备微流控芯片包括如下步骤：
步骤(一)硅片清洗；先把硅片放入第一清洗溶液中清洗，取出硅片用第二清洗溶液清洗；然后去除硅片表面的氧化硅；
步骤(二)硅片刻蚀；在清洗干净的硅片上旋涂光刻胶；然后用曝光机和包括微沟槽图案的光刻版对硅片上的光刻胶进行曝光，把光刻版上的图形转移到硅片上；曝光后的硅片在显影液中显影，曝光部分的光刻胶被显影液溶解；将显影后的硅片进行烘烤；然后把硅片放入刻蚀机中对硅片进行刻蚀，没有光刻胶保护的部分被刻蚀掉；刻蚀之后把硅片上的光刻胶溶解，然后冲洗硅片，最后把硅片吹干；得到其上形成有微沟槽结构的硅片；
步骤(三)微流控芯片制作；将柔性材料覆盖在硅片上，烘烤，柔性材料固化形成柔性衬底，同时将硅片上的微沟槽结构转移到柔性衬底上，将柔性衬底和硅片分离；其中微沟槽结构是沿着柔性衬底表面延伸的微米级沟槽。
3.如权利要求1所述的生物分子检测方法，其特征在于，探针分子微印刷包括如下步骤：
配置探针分子溶液；
用输入管吸取探针分子溶液连接到微流道的入口，并记录每种探针分子加载入口的位置或编号；
把输入管接到具有压力调节功能的加压装置上，使探针分子从入口缓慢地流通到出口，以印刷探针分子；探针分子从入口流到出口的过程中被衬底基板表面的功能化材料固定；
探针分子固定在衬底基板上，dna探针分子通过互补序列的螺旋合成捕获具有互补序列的基因片段，固定的抗体蛋白探针分子捕获特异性的蛋白分子，加入荧光信号，将基因信息或蛋白信息显现出来。
4.如权利要求1所述的生物分子检测方法，其特征在于，探针分子微印刷是将探针分子固定在探针分子印刷芯片的微流道中。
5.如权利要求1所述的生物分子检测方法，其特征在于，探针分子包括dna探针分子和抗体蛋白探针分子。
6.如权利要求5所述的生物分子检测方法，其特征在于，dna探针分子用于dna基因片段、mrna或mirna生物分子的捕获；抗体蛋白探针分子通过跟细胞分泌的抗原或细胞膜蛋白结合用于细胞分泌蛋白的分泌或特定细胞的捕获与分离。
7.如权利要求1所述的生物分子检测方法，其特征在于dna探针分子的浓度为1um-100um。
8.如权利要求1所述的生物分子检测方法，其特征在于，抗体蛋白探针分子使用原液或稀释2-100倍。
技术总结