本发明属于微流控芯片领域，具体涉及一种高通量微流控电泳筛分芯片及其制作、使用方法。
背景技术：
微流控芯片电泳(microfludicchipelectrophoresis)利用玻璃、石英或各种聚合物材料加工微米级通道，以高压直流电场为驱动力，对样品进行进样、分离及检测。自1990年问世以来，以其体积小、成本低、集成度高、便携性高、分析速度快、自动化程度高等特点，受到了广泛关注，得到了广泛应用。
近年来，随着蛋白质组学研究的深入发展，如何实现多种蛋白质混合物快速、高效的分离成为亟待解决的关键问题之一。基于微流控芯片电泳发展的微流控毛细管凝胶电泳能够在微流控芯片上对分子量大小和形状不同的蛋白质实现分离。但这种方法存在分离效率低、样品回收困难等缺陷，不能很好地分离用于下游分析的复杂混合物。
因此，近年来，利用有序的分子筛结构替代无序的多孔凝胶介质的研究工作引起了研究者的广泛关注，有序筛分结构与电泳方法的结合不仅可以提升对多组分样品的分析速度与分辨率，还克服了凝胶电泳方法固有的批处理模式，实现待测物的实时加样与分离，极大地提高了分离系统的通量。
但目前基于纳米微结构的分子筛芯片的制作与集成电路的制造封装工艺类似，具有很高的技术门槛与制造成本。另外，受到制作工艺的限制，常规的微流控芯片的微通道宽度通常不小于10μm，难以达到蛋白质尺寸筛分的级别。而利用聚二甲基硅氧烷(pdms)与玻璃表面不可逆键合中出现的可控弹性塌陷现象(键合形成的微通道或腔室的pdms顶板，在外加压力的作用下，从中心开始凹陷，直到与下层玻璃基片接触并永久密封)，则可以制作出亚微米(100nm-1μm)级别的微通道，对大小和形状不同的蛋白质分子具有不同的空间位阻。
利用pdms材料的上述特性构建的二维电泳筛分芯片可以实现不同分子量和形状的蛋白质分子高通量、高选择性分离。
技术实现要素：
为了克服现有技术上的问题，本发明提供了一种基于pdms弹性塌陷现象的高通量微流控电泳筛分芯片及其制备方法以及相应的使用方法，根据蛋白质分子量大小和形状的不同，实现实时、高通量的分离。
本发明提供以下技术方案：
一种高通量微流控电泳筛分芯片，包括玻璃层、聚二甲基硅氧烷pdms盖片，在所述玻璃层两端设有储液池，储液池中分别设有电极，在玻璃层的中间设有分离浓缩区，所述聚二甲基硅氧烷pdms盖片与玻璃层的分离浓缩区压力键合，所述分离浓缩区的玻璃层刻蚀有掩膜图案，键合后聚二甲基硅氧烷pdms盖片在对应掩膜图案的位置塌陷，塌陷处的外周与相邻的玻璃之间形成微通道，用于电泳筛分，在分离浓缩区两端分别凹陷形成进样口、出样口。
进一步地，所述分离浓缩区包括分离区，所述分离区的玻璃刻蚀后形成若干个矩阵排列的凸起图案，每个图案分别由互不相连的两个长微柱、两个短微柱组成，键合后聚二甲基硅氧烷pdms盖片塌陷后与相连的短微柱之间形成粗通道，与相连的长微柱之间形成细通道。
进一步地，所述长微柱的长边与x轴正向夹角为-20°--35°，短微柱的长边与x轴正向夹角为85°-70°相邻的长微柱和短微柱之间为90°-60°。
进一步地，所述长、短微柱高度为0.5-1μm，短微柱的尺寸的200-50μm﹡50-20μm，长微柱的尺寸为500-200μm﹡50-20μm，细通道的宽度为60-100nm、粗通道宽度为250-300nm。
进一步地，在分离浓缩区的分离区的下游设有后浓缩区，所述后浓缩区设有若干行八字排列的微柱。
一种高通量微流控电泳筛分芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一玻璃层的制备，使用做图软件设计掩膜图案，在pet底片打印得到光刻掩膜，使用沉积有氮化铬-氮氧化铬薄膜并涂敷有光致抗蚀剂的玻璃基片，采用光刻-湿法刻蚀玻璃，将掩膜图案转移到玻璃基片上，并刻蚀出0.5-1μm的深度；
步骤二聚二甲基硅氧烷pdms盖片的制备，将单晶硅片进行硅烷化处理，将聚二甲基硅氧烷pdms与固化剂经混合并脱气后浇铸在硅片上加热固化，与硅片分离并切割成与所述玻璃层的分离浓缩区相同的大小；
步骤三芯片键合，将玻璃层和聚二甲基硅氧烷pdms盖片经等离子体处理后，盖片对齐分离浓缩区，按压键合，压强大小为50kpa，在外加压力的作用下，对应玻璃层凹陷处的聚二甲基硅氧烷发生塌陷，直到与下层玻璃基片接触并永久密封，根据相对位置不同形成宽度不同的通道。
一种高通量微流控电泳筛分芯片分离蛋白样品的方法，包括以下步骤：
步骤a分别将蛋白样品和电泳缓冲液注入芯片两端的储液池，在电泳开始前用石蜡膜完全覆盖两端储液池；
步骤b对两端储液池中的铂电极施加x轴正向电场，蛋白质样品从进样口进入分离浓缩区，大小或形状不同的蛋白质分子在分离浓缩区的偏转角度不同，根据偏转角度产生的行进路线差异进入不同的微通道，从而实现蛋白样品的分离。
进一步地，在步骤a前还包括步骤a0，对待分离的蛋白样品进行荧光标记，在步骤b后还包括步骤c，利用ccd相机的荧光显微镜成像，分析样品分离液的荧光强度。
进一步地，在步骤a0后还包括步骤a1，用表面修饰液对芯片微通道表面进行处理，随后用电泳缓冲液充满微通道和两端储液池，并通过预电泳去除多余气泡。
采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1.本发明的高通量微流控电泳筛分芯片，克服了微流控芯片凝胶电泳固有的批处理模式，可连续进样并长时间稳定运行，具有体积小、分辨率高、通量高的特点。
2.本发明的高通量微流控电泳筛分芯片，通过有序的二维网状筛分结构替代无序的凝胶网孔结构，便于进行微通道表面改性，有助于减少非特异性吸附。
3.本发明的高通量微流控电泳筛分芯片，利用pdms弹性塌陷现象制作亚微米级别的筛分结构，属于非硅微加工技术，避免了高精度半导体集成电路工艺带来的高昂成本。
4.本发明的高通量微流控电泳筛分芯片，不仅可以对分离结果进行实时成像，还可以回收纯化后的蛋白质用于下游分析。
附图说明
图1是本发明高通量微流控电泳筛分芯片的结构示意图；
图2是本发明实施例中高通量微流控电泳筛分芯片主视图；
图3是本发明实施例中分离浓缩区的结构示意图。
其中：1-玻璃层、2-储液池、3-电极、4-分离区、5-后浓缩区、6-pdms盖片、7-长微柱、8-短微柱、9-pdms弹性塌陷区域、10-细通道、11-粗通道、12-八字形微柱
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如图1-3所示，一种高通量微流控电泳筛分芯片，包括玻璃层1、聚二甲基硅氧烷pdms盖片6，在玻璃层两端设有储液池2，储液池中分别设有电极3，在玻璃层的中间设有分离浓缩区，聚二甲基硅氧烷pdms盖片与玻璃层的分离浓缩区压力键合，分离浓缩区的玻璃层刻蚀有掩膜图案，键合后聚二甲基硅氧烷pdms盖片在对应掩膜图案的位置塌陷9，塌陷处的外周与相邻的玻璃之间形成微通道，用于电泳筛分，在分离浓缩区两端分别凹陷形成进样口、出样口。进样口和出样口也是在玻璃上的凹陷形成的凹槽，裸露在外的，未被pdms盖片覆盖。
其中，分离浓缩区包括分离区4，分离区的玻璃刻蚀后形成若干个矩阵排列的凸起图案，每个图案分别由互不相连的两个长微柱7、两个短微柱8组成，键合后聚二甲基硅氧烷pdms盖片塌陷后与相连的短微柱之间形成粗通道11，与相连的长微柱之间形成细通道10。
长微柱的长边与x轴正向夹角为(-20°)-(-35°)，短微柱的长边与x轴正向夹角为85°-70°相邻的长微柱和短微柱之间为90°-60°。图3中粗细通道之间形成角度为直角，作为较优选择。根据筛分需求可以调整微柱的偏转角度。
长、短微柱高度为0.5-1μm，短微柱的尺寸的200-50μm﹡50-20μm，长微柱的尺寸为500-200μm﹡50-20μm，细通道的宽度为60-100nm、粗通道宽度为250-300nm。
在分离浓缩区的分离区的下游设有后浓缩区5，后浓缩区设有若干行八字排列的微柱12。
两种通道垂直排列组成二维网状筛分结构，不同大小或形状的蛋白质分子在二维网状筛分结构中遵循不同的轨迹，因此可根据蛋白质分子量和形状差异实现分离；后浓缩区设置有5-16行八字形支撑微柱,液体顺着多道微柱的这种富集结构越来越集中，起到富集的作用，用于分离后样品流的收缩，能够使后续分析时峰型更加尖锐。本方法具有分离效率高、样品回收率高、高通量连续流筛分等优点；微通道便于表面改性，有助于减少非特异性吸附。这些优势结合样品回收的简易性，使得本方法可用于多组分复杂生物样品的分离与纯化，这对蛋白质组研究和生物标志物的发现具有重要的意义。
在分离区在pdms弹性塌陷后形成亚微米二维网状筛分结构，包括与x轴正向成(-20°)-(-35°)的小角度偏转较细通道和与x轴正向成85°-70°的大角度偏转较粗通道，在x轴正向向电场作用下，小分子量或长线性蛋白质分子由于受到的空间位阻较小，易沿小角度偏转较细通道快速通过分离区；大分子量或球状蛋白质由于受到较大空间位阻，很难或无法通过较细通道，而只能通过大角度偏转较粗通道，经过连续筛分，不同的蛋白质分子在通过芯片分离区时产生的偏转角度不同，根据其大小形成不同的分子流和行进路线，从而实现分离。
实施例2
本发明提供了一种高通量微流控电泳筛分芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一玻璃层的制备，使用做图软件设计掩膜图案，在pet底片打印得到光刻掩膜，使用沉积有氮化铬-氮氧化铬薄膜并涂敷有光致抗蚀剂的玻璃基片，采用光刻-湿法刻蚀玻璃，将掩膜图案转移到玻璃基片上，并刻蚀出0.5-1μm的深度；
步骤二聚二甲基硅氧烷pdms盖片的制备，将单晶硅片进行硅烷化处理，将聚二甲基硅氧烷pdms与固化剂经混合并脱气后浇铸在硅片上加热固化，与硅片分离并切割成与玻璃层的分离浓缩区相同的大小；
步骤三芯片键合，将玻璃层和聚二甲基硅氧烷pdms盖片经等离子体处理后，盖片对齐分离浓缩区，按压键合，压强大小为50kpa，在外加压力的作用下，二甲基硅氧烷凹陷，直到与下层玻璃基片接触并密封，根据相对位置不同形成宽度不同的通道。
由于pdms材料相对较低的弹性模量，键合形成的微腔室的pdms顶板，在外加压力的作用下，对应玻璃层凹陷处的聚二甲基硅氧烷发生塌陷，直到与下层玻璃基片接触并密封，根据相对位置不同形成两种宽度的精细微通道。
此外，玻璃层的制备，使用autocad软件设计掩膜图案，并使用高分辨率激光照排机在pet底片打印得到所需光刻掩膜，然后采用标准光刻-湿法刻蚀石英玻璃的制作工艺将掩膜图案转移到石英玻璃基片上，并刻蚀出一定深度。
电极的制作，以铂片作为电极，两端储液池中植入条形铂电极提供稳定电场。
本发明采用标准光刻-湿法刻蚀工艺制作，使用沉积有氮化铬-氮氧化铬薄膜并涂敷有光致抗蚀剂的石英玻璃基片，将掩膜图案转移到玻璃基片上，并刻蚀出0.5-1μm的深度。
实施例3
本发明提供了一种高通量微流控电泳筛分芯片分离蛋白样品的方法，包括以下步骤：
步骤a分别将蛋白样品和电泳缓冲液注入芯片两端的储液池，在电泳开始前用石蜡膜完全覆盖两端储液池；
步骤b对两端储液池中的铂电极施加x轴正向电场，蛋白质样品从进样口进入分离浓缩区，大小或形状不同的蛋白质分子在分离浓缩区的偏转角度不同，根据偏转角度产生的行进路线差异进入不同的微通道，从而实现蛋白样品的分离。
其中，在步骤a前还包括步骤a0，对待分离的蛋白样品进行荧光标记，在步骤b后还包括步骤c，利用ccd相机的荧光显微镜成像，分析样品分离液的荧光强度。
在步骤a0后还包括步骤a1，用表面修饰液对芯片微通道表面进行处理，随后用电泳缓冲液充满微通道和两端储液池，并通过预电泳去除多余气泡。
其中，对待分离蛋白进行标记的荧光染料可选下列中的一种：fitc、alexafluor488、cy2等，标记后的溶液转移到超滤管中，并离心去除多余的荧光染料。
电泳缓冲液为10×tris-硼酸(tbe)缓冲液，对芯片微通道表面进行处理的表面修饰液成分为0.2％聚乙烯吡咯烷酮或0.1％pop-6polymer分离胶溶于电泳缓冲液。施加电场后通过电渗流将上述表面处理液导入芯片微通道中并处理2h，随后使用电泳缓冲液冲洗微通道1h。
上样过程可通过连接有计算机控制的注射泵的毛细管连续进行，从而实现蛋白质的高通量电泳筛分。
待分离蛋白可选下列中的两种或以上：牛血清白蛋白(66kda，pl＝4.7)、卵清蛋白(44.5kda，pl＝4.5)、人生长激素(22.1kda，pl＝4.9)、α-乳白蛋白(14.3kda，pl＝4.8)。
预电泳和电泳过程中，进样口端电极接地，出样口端电极上施加的电压为100-150v，经过30-60min，芯片后浓缩区内的样品流达到稳定状态，可进行荧光成像。
经过连续筛分，不同的蛋白质分子在通过芯片分离区时产生的偏转角度不同，根据其大小形成不同的分子流和行进路线，最终富集在芯片的不同位置，用注射泵在不同的位置吸取分离液可达到分离效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
1.一种高通量微流控电泳筛分芯片，包括玻璃层、聚二甲基硅氧烷pdms盖片，其特征在于，在所述玻璃层两端设有储液池，储液池中分别设有电极，在玻璃层的中间设有分离浓缩区，所述聚二甲基硅氧烷pdms盖片与玻璃层的分离浓缩区压力键合，所述分离浓缩区的玻璃层刻蚀有掩膜图案，键合后聚二甲基硅氧烷pdms盖片在对应掩膜图案的位置塌陷，塌陷处的外周与相邻的玻璃之间形成微通道，用于电泳筛分，在分离浓缩区两端分别凹陷形成进样口、出样口。
2.根据权利要求1所述的高通量微流控电泳筛分芯片，其特征在于，所述分离浓缩区包括分离区，所述分离区的玻璃刻蚀后形成若干个矩阵排列的凸起图案，每个图案分别由互不相连的两个长微柱、两个短微柱组成，键合后聚二甲基硅氧烷pdms盖片塌陷后与相连的短微柱之间形成粗通道，与相连的长微柱之间形成细通道。
3.根据权利要求2所述的高通量微流控电泳筛分芯片，其特征在于，所述长微柱的长边与x轴正向夹角为-20°--35°，短微柱的长边与x轴正向夹角为85°-70°相邻的长微柱和短微柱之间为90°-60°。
4.根据权利要求3所述的高通量微流控电泳筛分芯片，其特征在于，所述长、短微柱高度为0.5-1μm，短微柱的尺寸的200-50μm﹡50-20μm，长微柱的尺寸为500-200μm﹡50-20μm，细通道的宽度为60-100nm、粗通道宽度为250-300nm。
5.根据权利要求3所述的高通量微流控电泳筛分芯片，其特征在于，在分离浓缩区的分离区的下游设有后浓缩区，所述后浓缩区设有若干行八字排列的微柱。
6.一种根据权利要求1所述的高通量微流控电泳筛分芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一玻璃层的制备，使用做图软件设计掩膜图案，在pet底片打印得到光刻掩膜，使用沉积有氮化铬-氮氧化铬薄膜并涂敷有光致抗蚀剂的玻璃基片，采用光刻-湿法刻蚀玻璃，将掩膜图案转移到玻璃基片上，并刻蚀出0.5-1μm的深度；
步骤二聚二甲基硅氧烷pdms盖片的制备，将单晶硅片进行硅烷化处理，将聚二甲基硅氧烷pdms与固化剂经混合并脱气后浇铸在硅片上加热固化，与硅片分离并切割成与所述玻璃层的分离浓缩区相同的大小；
步骤三芯片键合，将玻璃层和聚二甲基硅氧烷pdms盖片经等离子体处理后，盖片对齐分离浓缩区，按压键合，压强大小为50kpa，在外加压力的作用下，对应玻璃层凹陷处的聚二甲基硅氧烷发生塌陷，直到与下层玻璃基片接触并永久密封，根据相对位置不同形成宽度不同的通道。
7.一种根据权利要求1所述的高通量微流控电泳筛分芯片分离蛋白样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a分别将蛋白样品和电泳缓冲液注入芯片两端的储液池，在电泳开始前用石蜡膜完全覆盖两端储液池；
步骤b对两端储液池中的铂电极施加x轴正向电场，蛋白质样品从进样口进入分离浓缩区，大小或形状不同的蛋白质分子在分离浓缩区的偏转角度不同，根据偏转角度产生的行进路线差异进入不同的微通道，从而实现蛋白样品的分离。
8.根据权利要求7所述的分离蛋白样品的方法，其特征在于，
在步骤a前还包括步骤a0，对待分离的蛋白样品进行荧光标记，在步骤b后还包括步骤c，利用ccd相机的荧光显微镜成像，分析样品分离液的荧光强度。
9.根据权利要求8所述的分离蛋白样品的方法，其特征在于，在步骤a0后还包括步骤a1，用表面修饰液对芯片微通道表面进行处理，随后用电泳缓冲液充满微通道和两端储液池，并通过预电泳去除多余气泡。
技术总结