本发明属于医药工程领域，具体涉及一种替米沙坦衍生物及其用途，具体涉及一种替米沙坦在制备治疗与钙离子相关疾病的药物中的用途，特别是kv2.1通道的作用和/或通过激活vgcc的作用使细胞内钙离子水平升高。
背景技术：
替米沙坦名称为4'-[(1,4'-二甲基-2'-丙基[2,6'-二-1h-苯并咪唑]-1'-基)甲基]-[1,1'-二联苯基]-2-羧酸，英文名称为telmisartan，分子式是c33h30n4o2，分子结构式如下式所示。
替米沙坦是一种特异性血管紧张素ⅱ受体(at1型)拮抗剂。替米沙坦选择性与at1受体结合，该结合作用持久，降压稳定不易引起咳嗽。除了替米沙坦，临床常用的血管紧张素ii受体拮抗剂还包括其他沙坦类物质，比如氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、伊贝沙坦、康得沙坦、依普沙坦等。
替米沙坦是目前临床常用的降压药物，降压效果会出现个体差异，但是替米沙坦属于较强的血管紧张素ⅱ受体拮抗剂类降压药物，对患者心脏、肾脏均有良好的保护作用，只要不是双肾动脉狭窄、引起呛咳、或者肌酐大于264的患者，均可以长期服用，药物服用依从性较好。替米沙坦现在多用于成年人原发性高血压的治疗，药物副作用较少，副作用主要为感染症状，如泌尿道感染，包括膀胱炎、上呼吸道感染，包括咽炎及鼻窦炎。
发明人预料不到地发现替米沙坦具有刺激细胞钙离子水平升高的功能，具体是通过kv2.1和vgcc的机理实现，尤其是替米沙坦具有抑制细胞kv2.1通道的功能，此类性质在其他作为血管紧张素ii受体拮抗剂的沙坦类药物中没有发现。替米沙坦能刺激细胞中钙离子水平的增高，而且发明人通过对比实验也证明了替米沙坦促进细胞内钙离子水平增高的作用机理与已知的at1受体不同。在此发现的基础上，本发明提供一种替米沙坦的新用途，所述新用途是替米沙坦在制备治疗与钙离子相关疾病的药物中的用途，特别是通过kv2.1通道抑制作用实现的新用途、
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种替米沙坦在制备治疗与钙离子相关疾病的药物中的用途；本发明的另一个目的是提供一种替米沙坦在制备kv2.1通道抑制剂中的用途；本发明还有一个目的是提供一种替米沙坦在制备激活vgcc药物中的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
本发明的第一个目的在于提供一种替米沙坦衍生物及其药学上可接受的盐，结构如式(i)所示：
其中，r1、r2、r3独立地选自：-h、-oh、-cn、c1-5烷基、-oc1-5烷基、-n(c0-5烷基)(c0-5烷基)。
其中c1-5烷基是指具有1-5个碳原子数的烷基，具体选自甲基，乙基，丙基，丁基和戊基。
所述c0-5烷基是指具有0-5个碳原子数的烷基，其中c0是指氢原子。
优选的，r1、r2、r3独立地选自：-h、-oh、-nh2、-ch3、-c2h5。
所述药学上可接受的盐选自该化合物的钠盐，钾盐。
具体地，所述替米沙坦衍生物结构如式(ⅱ)所示，即替米沙坦。
第二方面，本发明提供一种替米沙坦在制备治疗与钙离子相关疾病的药物中的用途。
所述与钙离子相关的疾病包括但不限于：糖尿病、心脏病、高血压、贫血、风湿痛、神经痛、痛风、便秘、骨质疏松、佝偻病、肌肉疼痛、癫痫、神经退行性疾病、肌无力综合征。
以下简述各疾病与钙离子的关系。
糖尿病：胰腺具有分泌胰岛素的功能，胰岛素使血液中葡萄糖保持正常水平，如果胰岛素分泌不足，血糖水平会升高形成糖尿病。钙离子对胰岛素的增减具有非常密切的关系，钙离子能刺激胰岛分泌胰岛素，若细胞中的钙离子不足会导致胰岛素分泌不足。
心脏病：钙离子可促进心脏收缩、钾离子会使心脏扩张，钙离子能帮助维持心脏跳动正常。此外，大部分心脏病是因为脂肪积滞在冠状动脉导致正常收缩而引起的，钙离子能分解排除这些脂肪，从而间接缓解心脏病进程。
低血压和贫血：低血压是心脏机能不完全、血压调整不良引起的症状，贫血是制造血液的红血球或血色素减少而形成的一种缺氧症状。钙离子可以帮助维持心脏正常，同时能促进铁质的吸收，对于低血压和贫血具有显著的缓解作用。
风湿痛、神经痛、痛风：神经痛的起因主要为营养障碍所引起的体质酸性化，风湿则是由于钙质不足导致关节内部润滑变质造成的，至于痛风是因为血液中尿酸滞留刺激关节发炎的缘故，以上三种病痛的起因都是钙不足导致体质偏向酸性所引起的，增加细胞中钙离子浓度能起到有效缓解作用。
便秘：钙离子可中和肠道中各种酸性毒素，增加氧气，加强宿便排泄，同时，钙离子可促进肠道运动，小分子水团能快速湿润软化干结的大便，促使滞留的粪便进入直肠内，产生便意，从而消除便秘。
骨质疏松、佝偻病：钙是促进人体骨骼健康的重要物质，钙缺乏会导致骨质疏松，佝偻病俗称软骨病，也是因为钙缺乏导致骨骼钙化发生障碍，骨质变软而变形，因此增加体内钙离子水平均能缓解骨质疏松及佝偻病的症状。
肌肉疼痛：肌肉疼痛或僵硬是由于产生乳酸使肌肉处于紧缩状态，体内的钙离子可以和乳酸形成化合物乳酸钙，能有效缓解肌肉的紧缩状态，减轻疼痛或僵硬。
发明人预料不到地发现替米沙坦通过抑制kv2.1通道的作用使细胞内钙离子水平升高，替米沙坦抑制了kv2.1通道后使细胞动作电位时间延长，使细胞外ca2 流入细胞内的持续时间延长，从而使细胞内钙离子水平增加。而其他沙坦类物质没有kv2.1相关的抑制活性。
第三方面，本发明提供一种替米沙坦在制备kv2.1通道抑制剂中的用途。
电压门控性k 通道(voltagegatedpotassiumchannels,kv)是一类由跨膜蛋白构成的亲水性通道，广泛分布于中枢与外周神经系统，参与神经信号的加工、传递以及对突触可塑性的调控。目前研究表明，kv通道结构与功能异常与多种疾病相关，并且是毒素和许多药物的重要作用靶点。分子克隆研究证实kv通道是四聚体的蛋白结构，四个α亚基对称的整合在一起，中间形成一个通道，供k 出入，该孔道的最狭窄处被称为p环，p环的氨基酸序列txxtxgyg是高度保守的，此序列决定了钾通道只允许k 通过，构成所谓的选择性漏斗。到目前为止已经确认了200多个编码钾通道的基因，其中编码kv通道α亚基的基因有12个亚家族(kv1-kv12)，每个亚族根据不同功能又分为若干个亚型如kv2.1、kv2.2、kv4.5等。人体不同组织部位的kv通道可以是同一种α亚基组成的同聚体，也可以是两种以上的α亚基组成的异聚体，这是kv通道功能多样性的基础。kv通道广泛存在于许多可兴奋性细胞膜表面，能够参与细胞电生理活动和内分泌的调节。例如，在兴奋性细胞中，kv通道能够调节动作电位的复极化，在非兴奋性细胞中，它能调控细胞膜的静息电位，因此kv通道能参与很多电生理活动，是免疫、代谢、心血管和神经精神疾病甚至是癌症的重要治疗靶点。kv通道参与细胞动作电位的复极，抑制kv通道后则会延迟复极，从而延长了apd(动作电位时间)，即细胞外ca2 流入细胞内的持续时间，从而使细胞内ca2 水平增加。
其中，kv2.1是电压门控钾离子通道的一个亚型，分布于哺乳动物的多种组织中，包括大脑神经元、中枢神经系统神经元、心肌细胞、骨骼肌、心血管平滑肌、β胰岛细胞和某些癌细胞，对于调节神经元兴奋性，神经元细胞凋亡和胰岛素分泌等具有重要作用。对于该靶点的调控有助于老年痴呆、癫痫、糖尿病、脑卒中、抑郁症和肿瘤等多种常见疑难病的研究和治疗，所以kv2.1的作用机制及其调控的研究具有非常重要的意义。
第四方面，本发明提供一种替米沙坦在制备治疗与kv2.1通道相关疾病的药物中的用途。
优选的，所述与kv2.1通道相关的疾病包括但不限于：癫痫、脑缺血性疾病、神经退行性疾病、糖尿病。
关于kv2.1通道抑制剂所介导的疾病，可以参考文献：
(1)ttzhou，etal..sp6616asanewkv2.1channelinhibitorefficientlypromotesβ-cellsurvivalinvolvingbothpkc/erk1/2andcam/pi3k/aktsignalingpathways.[j].celldeathanddisease.2016.7(e2216)
(2)liuf,zhangy,liangz,etal.cleavageofpotassiumchannelkv2.1bybace2reducesneuronalapoptosis[j].molecularpsychiatry,2018,23(pt10).
(3)tingtingzhou,mengfandu,tongzhao,等.etaasanovelkv2.1inhibitoramelioratesβ-celldysfunctionandhyperglycaemia[j].clinical&experimentalpharmacology&physiology,2018,45(12).
另外，发明人还发现替米沙坦还通过激活vgcc的作用使细胞内钙离子水平升高，替米沙坦激活vgcc后增强细胞外钙离子内流，从而使细胞内钙离子水平升高。
第五方面，本发明提供一种替米沙坦在制备激活vgcc药物中的用途。
电压门控ca2 通道(voltage-gatedca2 channel，vgcc)是身体许多关键功能所必需的。vgcc通过不同亚基即α1(cavα1)、β(cavβ)、α2δ(cavα2δ)和γ(cavγ)的相互作用而组装。α1亚基是通道复合物的关键多孔形成单元，负责ca2 传导和产生ca2 内流。α2δ、β和γ亚基是辅助性的，但是它们对于通道的调节非常重要，因为它们增加质膜中α1亚基的表达并调节这些亚基的功能，从而导致不同细胞类型中的功能多样性。根据它们的生理和药理特性，vgcc可以细分为低电压激活的t型(cav3.1、cav3.2和cav3.3)以及高电压激活的l型(cav1.1至cav1.4)、n型(cav2.2)、p/q型(cav2.1)和r型(cav2.3)，具体取决于形成通道的cavα亚基。所有这五个亚类都存在于中枢和外周神经系统中。通过激活vgcc可以调节细胞内钙水平，具有以下必要作用：(1)神经递质释放；(2)膜去极化和超极化；(3)酶激活和失活；(4)基因调节。大量数据已清楚地表明vgcc涉及介导各种疾病状态，包括疼痛处理。
第六方面，本发明提供一种替米沙坦在制备治疗与vgcc相关疾病的药物中的用途。
优选的，所述与vgcc相关的疾病包括但不限于：癫痫、顽固性疼痛、慢性神经性疼痛、糖尿病、肌萎缩疾病、肌无力综合征。
附图说明
图1在葡萄糖浓度为2.8g(2.8mm葡萄糖，下同)环境中，分别用1μm，10μm和50μm替米沙坦(t)处理的β细胞钙成像图，甲苯磺丁酰胺(tol)用作阳性对照。
图2在葡萄糖浓度为2.8g环境中，分别用1μm，10μm和50μm替米沙坦(t)处理的β细胞在30sf340/f380尖峰期间的平均值。
图3在葡萄糖浓度为11.1g(11.1mm葡萄糖，下同)环境中，分别用1μm，10μm和50μm替米沙坦(t)处理的β细胞钙成像图，甲苯磺丁酰胺(tol)用作阳性对照。
图4在葡萄糖浓度为11.1g环境中，分别用1μm，10μm和50μm替米沙坦(t)处理的β细胞在30sf340/f380尖峰期间的平均值。
图5在葡萄糖浓度为16.7g(16.7mm葡萄糖，下同)环境中，分别用1μm，10μm和50μm替米沙坦(t)处理的β细胞钙成像图，甲苯磺丁酰胺(tol)用作阳性对照。
图6在葡萄糖浓度为16.7g环境中，分别用1μm，10μm和50μm替米沙坦(t)处理的β细胞在30sf340/f380尖峰期间的平均值。
图7kv通道的电流-电压关系曲线(对照、替米沙坦)。
图8在80mv去极化下的kv通道的平均电流密度。
图9kv通道的电流-电压关系曲线(替米沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦)。
图10在80mv去极化下的kv通道的平均电流密度。
图11kv通道的电流-电压关系曲线(替米沙坦 gw9662)。
图12在80mv去极化下的kv通道的平均电流密度。
图13cho-kv2.1细胞荧光照片。
图14cho-kv2.1细胞的kv2.1通道的电流-电压关系曲线(对照、替米沙坦)。
图15cho-kv2.1细胞在80mv去极化下的kv2.1通道的平均电流密度。
图16在葡萄糖浓度为16.7g环境中，用tea、替米沙坦(t)处理的β细胞钙成像图。
图17在葡萄糖浓度为16.7g环境中，用tea、替米沙坦(t)处理的β细胞在30sf340/f380尖峰期间的平均值。
图18vgcc的电流-电压关系曲线(对照、替米沙坦)。
图190mv去极化时平均ca2 电流密度。
图20vgcc的电流-电压关系曲线(替米沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦)。
图210mv去极化时平均ca2 电流密度。
图22vgcc的电流-电压关系曲线(替米沙坦 gw9662)。
图230mv去极化时平均ca2 电流密度。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用药物和试剂来源说明：
本发明所用到仪器设备如下：
替米沙坦制剂的制备
实施例1替米沙坦片剂的制备
s1：将替米沙坦40g按递增法添加乳糖200g的方法混合研磨70min以上，然后混入微晶纤维素30g和山梨醇10g再次研磨30min以上，研磨温度低于30℃，得到替米沙坦乳糖混合物；
s2：将混合物投入到湿法制粒机混合3min以上，按制剂重量每千克2-4ml的比例取吐温-80(溶于95％乙醇中)，然后与0.5％聚维酮k30水溶液按1:20的混合作为黏合剂加到湿法颗粒机混合物中进行制粒；
s4：向s2制得的颗粒中混合加入硬脂酸镁，压片机硬度控制在4-5kgf法以内，压片得到替米沙坦片剂1000片。
实施例2替米沙坦硬胶囊剂的制备
s1：将3.0g的氢氧化钠用少量质量浓度为50％的乙醇水溶液溶解，加入替米沙坦40g，混合并研磨，得到混合物；
s2：向混合物中加入200g乳糖，混合后进行在55℃条件下干燥80min，粉碎、过40目筛网，得到混合细粉；
s3：将25ml质量浓度为5％的聚维酮k30的乙醇溶液加入步骤s2所得混合细粉中制软材，过20目筛网制湿颗粒；
s4：将步骤s3制得湿颗粒在50℃条件下干燥6h后，过18目筛网进行整粒；
s5：测定颗粒中替米沙坦含量，计算装量，装囊，检查合格后包装，即得替米沙坦硬胶囊1000粒。
本发明使用的胰岛β细胞均按照以下步骤操作得到：
(1)大鼠胰岛的分离与培养
s1：提前准备好实验所需的器械，包括：托盘、断头台、玻璃漏斗、过滤网、手术器械等，将在-20℃冰箱冻存的10ml的1mg/ml的胶原酶p恒温解冻后抽吸至20ml的注射器内，注射器去掉针头，连接好pe导管，放置在4℃冰箱备用，打开恒温振荡器，调整振荡频率为85-90次/分，水浴温度设为37℃。
s2：将雄性wistar大鼠于断头台处死后，迅速转移至托盘，75％的酒精消毒大鼠胸腹部，剪刀剪开腹部皮肤及肌肉，暴露腹腔，小心推开小肠，显示十二指肠，用血管钳夹闭胆胰管汇入十二指肠的地方，防止之后由胆管注入的胶原酶溢入肠腔。
s3：将大鼠转移至体式显微镜下，显露肝门处，用镊子游离出胆总管，眼科剪沿胆总管走形剪一小口，将连着含胶原酶p注射器的pe导管由小口置入胆管远端，插入一定长度后镊子固定，缓慢将酶注入胰腺中，可见胰腺逐渐膨胀。
s4：去除导管，血管钳夹闭胆管，小心将膨胀完全的胰腺完整剥离，置于培养皿中。用镊子及小剪刀去除多余脂肪及杂质，把充满酶液的胰腺倒入50ml离心管中，快速转移至恒温振荡器中，按原先设定的参数消化11分钟。
s5：取出离心管，在超净台内操作，加入4℃保存的胰岛培养液和hanks缓冲液各10ml，用力摇晃离心管，终止酶消化，使混合液成为泥沙样。将混合液通过350nm的过滤网和玻璃漏斗，转移到另一个新的50ml离心管中。用hanks缓冲液多次冲洗滤网及漏斗，使滤液定容至50ml左右。设定离心机转速为1200转，将离心管置入离心机内离心3分钟。
s6：取出离心管，在超净台内倒掉上清液，向剩余的沉淀中加入10ml的histopaque-1077分离液。用1ml移液枪轻柔吹匀离心管中的沉淀，再用注射器抽取10ml4℃保存的1064培养基，沿离心管管壁缓慢注入，可看到培养基和histopaque-1077分离液之间分层。设定离心机转速为3200转，将离心管置入离心机内离心23分钟。
s7：慢慢取出离心管，可见管内分层明显，分层处的小颗粒即为胰岛，小心将离心管置于提前制备的盛满冰的容器中。取两个无菌培养皿，一置于体式显微镜下，另一盛有适量新鲜培养液放于冰盒上。每次用1ml移液枪吸取离心管上清液3-4ml置于显微镜下的培养皿中，镜下用10μl的移液枪挑选乳白色、实心圆形的胰岛，转移到另一培养皿中，直至胰岛完全被挑选出。
s8：重复两次，将挑选好的胰岛放置在温度37℃，co2为5％的细胞培养箱中备用，1-2天更换胰岛培养液一次。
(2)大鼠原代胰岛β细胞的分离和培养
s1：提前准备好实验所需的器械：用玻璃刀将盖玻片切割成大小约5mm×5mm的小玻片，置于大培养皿中，喷洒酒精消毒备用。从-20℃冰箱中取出1ml的edta和200μl的dispaseⅱ溶液室温下解冻；从4℃冰箱中取出1ml的细胞黏附剂；在超净台内取出15ml的离心管和1.5ml的eppendorf(ep)管备用。
s2：在超净台内，向35mm的培养皿放入消毒好的玻片，每个玻片的中心滴10μl的细胞黏附剂，自然晾干约10分钟左右，必要时可吸取多余的黏附剂。
s3：从细胞培养箱中取出盛有胰岛的培养皿，在体视显微镜下挑取所需数量的形状完整致密的胰岛，置入无菌的的ep管底部。通常膜片钳实验所需的细胞密度要小于钙离子成像的，故膜片钳实验所需的细胞密度为5-10个胰岛/片，钙离子成像所需的细胞密度为10-15个胰岛/片，具体依据胰岛大小作调整。
s4：在超净台内，吸取ep管中的上清液，移液枪加入1ml的edta，充分混匀以络合溶液中的钙、镁离子。轻轻磕打ep管使得胰岛沉降至底部，用移液枪尽可能的去除上层的edta溶液。
s5：用移液枪吸取200ul的dispaseⅱ溶液加入到ep管中，混匀后置入细胞培养箱中静置消化5分钟，期间需打开培养箱用移液枪吹匀溶液一次，防止胰岛沉降至ep管底部影响消化。
s6：取出ep管至超净台内，移液枪吸取1ml胰岛培养液加入到ep管中终止消化。15ml离心管内加入6ml胰岛培养液，用移液枪将ep管中的混合液转移到离心管中，混匀后放入离心机中，以1000转/分的转速离心2分钟。
s7：取出离心管在超净台内，弃去上清液，以10μl/片计算所需要的胰岛培养液容积，移液枪吸取后加入离心管内混匀。将含有胰岛细胞的混悬液转移至ep管中，用移液枪将10ul的细胞混悬液滴在每个玻片上含有细胞黏附剂的区域。将置有玻片的培养皿放入细胞培养箱中，静置培养30分钟，待细胞沉降完全。从细胞培养箱中取出培养皿，用移液枪抽取2ml的胰岛培养液，缓慢转移至培养皿中，防止引起玻片位置移动。将培养皿放置细胞培养箱备用。
实施例3替米沙坦刺激胰岛β细胞内钙离子水平升高
实验目的：利用钙成像技术检测替米沙坦对胰岛β细胞内钙离子水平的影响。
实验步骤：(1)在烧杯内配置好钙离子成像实验所需量的krbh(krebsringerbicarbonate-hepes)溶液，放入37℃的细胞培养箱孵育30分钟后取出，用氢氧化钠和盐酸调节溶液ph值为7.4左右。配置fura-2am染料，操作过程中避光，在超净台内分别将2μlfura-2am储存液稀释于含2.8、11.1和16.7mmol/l(g)葡萄糖的krbh溶液1ml中，分别配成终浓度为2μmol/l的染液备用。
(2)按上述步骤分离和培养适量数量的含胰岛β细胞，将胰岛β细胞分别置于步骤(1)制备的3中染液培养皿中，使染料和细胞结合一段时间后染料进入细胞内，洗净细胞外的染液。
(3)将皿放在钙成像仪器下，在不同时间分别加入1μm、10μm、50μm替米沙坦溶液，检测荧光强度的变化，若药物使得细胞内钙升高，钙离子就会和染液结合，荧光显微镜下会表现出荧光密度值增高(即f340/380)。本实验以甲苯磺丁脲(tolbutamide，tolb)作为阳性对照。
实验结果：葡萄糖浓度为2.8g环境中加入不同浓度替米沙坦溶液后胰岛β细胞内钙离子水平变化如图1和图2所示；葡萄糖浓度为11.1g环境中加入不同浓度替米沙坦溶液后胰岛β细胞内钙离子水平变化如图3和图4所示；葡萄糖浓度为16.7g环境中加入不同浓度替米沙坦溶液后胰岛β细胞内钙离子水平变化如图5和图6所示。
从图1-6所示的结果可以看出，当替米沙坦的浓度为10μm和50μm时引起荧光强度增加，尤其当替米沙坦的浓度为50μm时荧光强度急剧增加，说明替米沙坦刺激胰岛β细胞内钙离子水平上升属于剂量依赖型，钙离子水平随着替米沙坦加入剂量的增大而增长。另外，与2.8g葡萄糖条件相比，在高浓度葡萄糖环境中(11.1g或16.7g)钙离子浓度更高，说明替米沙坦对胰岛β细胞内钙离子水平的刺激作用也呈葡萄糖依赖型，在葡萄糖浓度较高的环境中钙离子水平更高。
实施例4替米沙坦抑制kv2.1通道(kv2.1型电压门控钾通道)
实验目的：应用膜片钳技术检测替米沙坦对胰岛β细胞kv2.1通道的影响。
实验步骤：(1)按照上述步骤分离和培养适量数量的含胰岛β细胞的玻片备用。
(2)提前配置电压门控性钾通道，电极外液分为对照组和含药物的干预组，对照组电压门控性钾通道电极外液需加入葡萄糖配置浓度11.1mmol/l，因为11.1mmol/l的葡萄糖可以抑制atp敏感性钾通道，干预组在对照组基础上再分别加入替米沙坦，配置浓度为10μmol/l。
(3)电极制备：采用外径为1.5mm、内径为0.84mm的硼硅酸盐玻璃电极，先在pp-830电极拉制仪上拉制电极后，用mf-200抛光仪将电极抛光，使得电极电阻在5-7mω之间，备用。
(4)膜片钳实验在德国产的heka膜片钳系统上进行。先在倒置显微镜低倍镜下(10×10)找见胰岛细胞，改为高倍镜(40×10)下，选择好状态良好的胰岛β细胞。用注射器将少许电压门控性钾通道电极内液注入制备好的电极管中，排空气泡。
(5)将电极安装到带有银丝的微操纵臂上固定，调整微操将电极尖端没入电压门控性钾通道电极外液浴液液面，查看放大器电极电阻确保在5-7mω之间。先给一个正压，去除进入液面时粘附于尖端的灰尘，提高封接概率。然后快速调整压低电极尖端，使其和选择好的β细胞位于同一层面上，并尽可能接近细胞。将微操调整为细调，缓慢调整电极轻轻压于细胞膜表面，待电极电阻显示增加2-5mω时停止，此时可认为电极尖端与细胞表面已经良好接触。
(6)持续而轻柔的负压吸引，使细胞膜和电极尖端达到高阻封接(电阻＞1gω)。将钳制电压逐渐调整至-70mv，改为whole-cell模式，快电容补偿，消除由于电极电容而在基线上出现的两个小尖峰。等约40s左右待细胞膜稳定后，再给予短促负压破膜，慢电容补偿使基线平稳。将膜片钳改为电压钳模式，高阻封接破膜后，记录细胞膜电容。设置钳制电压为-70mv，刺激步阶为10mv，序贯给予-70mv到 80mv的电压刺激，刺激时程为400ms，在whole-cell模式下记录时程内的电流变化，取最终50ms稳定后的均值作为结果。
实验结果：在不加替米沙坦的情况下，在全电池电压钳模式下检测到kv电流作为对照，加入替米沙坦(tel)，相同电压钳模式下检测kv电流，结果如图7所示。在80mv去极化下的kv通道平均电流密度如图8所示。
将替米沙坦替换为缬沙坦(v)、厄贝沙坦(ir)，在全电池电压钳模式下检测到kv电流，结果如图9、图10所示。
在不加替米沙坦的情况下，在全电池电压钳模式下检测到kv电流作为对照，在空白对照的基础上加入替米沙坦检测kv电流，在空白对照的基础上加入gw9662检测kv电流，在空白对照的基础上加入替米沙坦和gw9662检测kv电流，结果如图11、图12所示。
图7中的电流-电压曲线显示替米沙坦降低了kv电流密度，图8结果显示替米沙坦对kv通道具有明显的抑制作用。
通过图9和图10可以看出，用缬沙坦或厄贝沙坦作用于胰岛β细胞后未观察到两者对kv2.1通道具有与替米沙坦类似的作用，说明缬沙坦和厄贝沙坦并没有抑制kv2.1通道的作用。
gw9662是一种选择性pparγ拮抗剂，通过图11和图12可以看出，gw9662没有抑制kv通道的效果，且gw9662的加入未能逆转替米沙坦对kv通道的抑制作用，同时说明替米沙坦对kv通道抑制作用的机理与gw9662不同。
实施例5替米沙坦直接抑制cho-kv2.1细胞上的kv2.1通道
实验目的：在胰岛β细胞上，kv2.1亚型贡献了kv电流的绝大部分，但是同时也存在其他亚型的kv电流，为了验证替米沙坦确实具有直接抑制kv2.1通道的效果，本实验我们构建了cho-kv2.1细胞。由于中国仓鼠卵巢(chinesehamsterovary，cho)细胞没有电压依赖性钾通道，无内生性at-1受体，所以我们在cho细胞过表达kv2.1通道，通过膜片钳实验观察替米沙坦对kv2.1通道是否有直接抑制作用。
实验步骤：通过前期预实验，我们确定转染的最佳条件：cho细胞密度为3万/ml，5ml/瓶(t25)，在细胞传代铺板后12小时感染病毒。过表达kv2.1的慢病毒载体转染cho细胞后，细胞可见绿色荧光如图13所示。我们分别用moi(复感染指数)为5、10和20的病毒量转染cho细胞，通过筛选确定合适的转染moi为10。用0.5μg/ml嘌呤霉素筛选，稳定表达cho-kv2.1细胞系构建成功后，行膜片钳实验，实验操作如实施例4所述。
实验结果：在不加替米沙坦的情况下，在全电池电压钳模式下，cho-kv2.1细胞表现出较高的kv电流密度，达285.88±27.97pa/pf，检测到kv电流作为对照，加入10μm替米沙坦干预后，电流密度减少为199.90±19.52pa/pf，有明显的统计学差异(p<0.05)，具体结果如图14和图15所示。
实施例6替米沙坦激活vgcc(电压门控ca2 通道)
实验1
实验目的：在上述实验的基础上探索是否还有其他机制导致替米沙坦有刺激胰腺β细胞中钙离子浓度增加的作用。
实验步骤：钙成像技术操作过程如实施例3所示。
实验结果：有研究表明20mmkv通道抑制剂四乙基氯化铵(tea)能阻断大多数kv通道并导致钙升高，本实验在胰腺β细胞中加入了有效量的tea封闭β细胞的kv通道，在钙成像仪器下，检测荧光强度的变化，再在加入tea的基础上加入替米沙坦，记录荧光强度变化，结果如图16所示，经过处理的β细胞在30sf340/f380尖峰期间的平均值如图17所示。
图16和图17结果表明，在11.1g葡萄糖条件下，在经过tea处理的胰腺β细胞中加入替米沙坦后细胞内钙离子浓度在原来的基础上又有所升高，说明在kv通道被抑制的前提下替米沙坦依然有刺激钙离子浓度增加的功能，可见替米沙坦的作用通道不仅只有kv通道，应该还有其他作用通道。
实验2
实验目的：通过膜片钳实验观察替米沙坦对胰腺β细胞vgcc的影响，在全细胞电压钳模式下，记录电压依赖性内向ca2 电流。
实验步骤：同实施例4，区别仅在于，电压门控性钙通道电极外液加入葡萄糖配置浓度为2.8mmol/l，高阻封接破膜后，记录细胞膜电容。设置钳制电压为-70mv，刺激步阶为10mv，序贯给予-50mv到 30mv的电压刺激，刺激时程为50ms，在whole-cell模式下记录时程内的电流变化。由于胰岛β细胞的钙通道电流微弱，所以我们在实验中用对钙通道通透性较高的ba2 代替ca2 ，从而达到放大钙信号的作用。
实验结果：在未加入替米沙坦时记录电压依赖性内向ca2 电流，加入替米沙坦作用于β细胞，vgcc的电流-电压关系曲线如图18所示，0mv去极化时平均ca2 电流密度如图19所示。
将替米沙坦替换为缬沙坦、厄贝沙坦，在全电池电压钳模式下记录电压依赖性内向ca2 电流，结果如图20所示，0mv去极化时平均ca2 电流密度如图21所示。
在不加替米沙坦的情况下，全电池电压钳模式下记录电压依赖性内向ca2 电流作为对照，在空白对照的基础上加入替米沙坦后记录内向ca2 电流，在空白对照的基础上加入gw9662后记录内向ca2 电流，在空白对照的基础上加入替米沙坦和gw9662后记录内向ca2 电流，结果如图22所示，0mv去极化时平均ca2 电流密度如图23所示。
图18显示为电流密度(pa/pf)，图19为电流-电压关系曲线，两图均表明替米沙坦与对照相比增加了vgcc电流密度，值得注意的是，替米沙坦在0mv时将电流密度从-3.0232±0.3515pa/pf增加到-5.04±0.5962pa/pf，以上结果表明，替米沙坦刺激钙离子浓度增加的另一个原因是激活vgcc。
通过图20和图21可以看出，用缬沙坦或厄贝沙坦作用于胰岛β细胞后未观察到两者对vgcc具有与替米沙坦类似的激活作用，说明缬沙坦和厄贝沙坦并没有激活vgcc的作用。
gw9662是一种选择性pparγ拮抗剂，通过图22和图23可以看出，gw9662没有激活vgcc的效果，且gw9662的加入并不会影响替米沙坦激活vgcc的作用，同时说明替米沙坦激活vgcc的作用机理与gw9662不同。
综上，可以看出，相比较于其他沙坦类药物，替米沙坦具有令人惊讶的抑制kv2.1通道的功能，替米沙坦抑制kv2.1通道的作用使细胞内钙离子水平升高，替米沙坦抑制了kv2.1通道后使细胞动作电位时间延长，使细胞外ca2 流入细胞内的持续时间延长，从而使细胞内钙离子水平增加。因此，替米沙坦对于一些与钙离子相关的疾病具有治疗效果，所述疾病的部分病因是由于细胞内钙离子低导致的。另外，替米沙坦还通过激活vgcc的作用使细胞内钙离子水平升高，替米沙坦激活vgcc后增强细胞外钙离子内流，从而使细胞内钙离子水平升高。进一步证实了替米沙坦治疗与钙离子相关疾病的新用途。
我们的实验结果表明替米沙坦促进胰岛素分泌与ppar-γ无关，一方面因为厄贝沙坦与替米沙坦类似，除了可以阻断at-1受体外，均有部分激活ppar-γ的活性；另一方面，我们又进一步使用了ppar-γ的阻断剂gw9662，发现替米沙坦与gw9662联合应用并没有阻断替米沙坦的促胰岛素分泌作用。
我们首次发现替米沙坦可以直接抑制kv2.1通道，这是一个非常有意义的发现。kv2.1是胰岛β细胞上最为重要的kv通道亚型，贡献了β细胞kv电流的绝大部分。研究证实激活kv2.1不仅负向调节β细胞的胰岛素分泌，而且促进β细胞的凋亡。同时，鉴于kv2.1亚型在神经细胞的凋亡过程中发挥重要作用在调节神经紧张，保护神经细胞方面的重要作用，而我们的研究则表明需要进一步研究替米沙坦对kv2.1直接抑制作用参与其中发挥效应。虽然间断有kv2.1小分子抑制剂的报道，但尚未有此类的药物真正运用于临床。替米沙坦作为临床已经应用多年的经典的抗高血压药物，药物代谢动力学和安全性已经达成广泛共识，我们的发现无疑为这类药物的新用途的研发提供了宝贵思路。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
1.一种式i所示的替米沙坦衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，r1、r2、r3独立地选自：-h、-oh、-cn、c1-5烷基、-oc1-5烷基、-n(c0-5烷基)(c0-5烷基)。
2.根据权利要求1所述的替米沙坦衍生物，其特征在于，所述衍生物结构式为：
3.一种如权利要求1或2所述替米沙坦衍生物的药学上可接受的盐，所述盐为钠盐或钾盐。
4.一种如权利要求1-3任一项所述替米沙坦衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗与钙离子相关疾病的药物中的用途，所述替米沙坦通过抑制kv2.1通道的作用和/或通过激活vgcc的作用使细胞内钙离子水平升高。
5.如权利要求4所述的用途，所述钙离子相关疾病包括糖尿病、心脏病、高血压、贫血、风湿痛、神经痛、痛风、便秘、骨质疏松、佝偻病、肌肉疼痛、癫痫、神经退行性疾病、肌无力综合征。
6.一种如权利要求1-3任一项所述替米沙坦衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗kv2.1通道相关疾病的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述kv2.1通道相关的疾病包括癫痫、脑缺血性疾病、神经退行性疾病或糖尿病。
8.一种如权利要求1-3任一项所述替米沙坦衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗与vgcc相关疾病的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述与vgcc相关的疾病包括但不限于：癫痫、顽固性疼痛、慢性神经性疼痛、糖尿病、肌萎缩疾病、肌无力综合征。
技术总结