本发明涉及中药的提取、分离领域，尤其涉及从斑叶兰药材中提取、分离和鉴定出的新化合物及其分离方法，具体为一种从斑叶兰中提取分离的化合物goodyschlea及其制备方法和应用。
背景内容
大斑叶兰(goodyeraschlechtendalianarchb.f.)为兰科斑叶兰属多年生草本植物，以全草入药，为中药斑叶兰基源植物。生于山谷林下阴湿处，主要分布于长江以南各地及西藏。味甘、辛，性平。有润肺止咳、补肾益气、行气活血、消肿解毒等功效。主治肺痨咳嗽、气管炎、头晕乏力、咽喉肿痛、毒蛇咬伤等症。具有很高的药用价值，民间还用于制作药膳。
然而国内外关于斑叶兰的化学成分的报道较少。目前，仅报道从中分离得到黄酮、有机酸等二十多个化合物，物质基础尚不明确。因此亟待对斑叶兰的化学成分进行深入研究，分离其中的活性成分。
技术实现要素：
发明目的：针对上述问题，本发明提供了一种从斑叶兰中提取分离的新化合物goodyschlea及其制备方法和应用，经研究发现本发明的新化合物具有显著的抑制丁酰胆碱酯酶活性、中等强度的抗氧化活性和弱肿瘤细胞毒及抑制乙酰胆碱酯酶活性。同时提供一种针对本发明新化合物的简便、快速、纯度高的提取分离方法。
技术方案：本发明提供的所述新化合物分子式为c13h12o5，命名为goodyschlea，化学结构式为：
上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
a)将斑叶兰干燥药材用95％乙醇溶液提取后，过滤，合并滤液，再减压浓缩干燥，获得95％乙醇提取物；
b)将95％乙醇提取物加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
c)将乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化，得到纯的新化合物。
上述步骤c)乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化的步骤为：
1)将乙酸乙酯部位在硅胶上进行柱层析，用体积比为(20∶1)～(0∶1)的二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，获得二氯甲烷-丙酮洗脱物；作为优选地，所述体积比为20∶1、10∶1、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1的二氯甲烷-丙酮梯度洗脱；
2)取二氯甲烷-丙酮洗脱物再进行硅胶柱层析，用体积比为(30∶1)～(0∶1)的石油醚-丙酮梯度洗脱，得石油醚-丙酮洗脱物；作为优选地，所述体积比为30∶1、10∶1、2∶1、1∶3、0∶1的石油醚-丙酮梯度洗脱；
3)取石油醚-丙酮洗脱物进行凝胶柱色谱分离，用体积比为2∶1的三氯甲烷-甲醇洗脱，得到三氯甲烷-甲醇洗脱物；
4)取三氯甲烷-甲醇洗脱物经半制备高效液相色谱纯化，用体积比为3∶2的甲醇-水洗脱，从甲醇-水洗脱液中得到纯的新化合物。
具体地，所述步骤c)乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化的具体步骤为：用体积比为(20∶1)～(0∶1)的二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，合并后得10个流份；流份3经硅胶柱层析，用体积比为(30∶1)～(0∶1)的石油醚-丙酮梯度洗脱，合并后得10个流份；流份7经sephadexlh-20柱层析，用体积比为2∶1的氯仿-甲醇洗脱，合并后得6个流份；流份3经半制备高效液相色谱纯化，用体积比为3∶2的甲醇-水洗脱，收集主峰，得到该化合物。
本发明内容还包括所述的化合物在制备用于抑制胆碱酯酶活性、抗肿瘤或抗氧化药物中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
本发明中所述斑叶兰中新化合物的分离纯化和药理活性研究未被现有论文期刊所报道；本发明提供来源于斑叶兰的新化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离纯化方法，采用醇提取、硅胶柱层析、凝胶柱层析及半制备hplc进行分离纯化，成功获得新的化合物，操作方法简便及快速，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，均大于95％，此外经研究表明以上化合物具有显著的抑制丁酰胆碱酯酶活性、中等强度的抗氧化活性和弱肿瘤细胞毒及抑制乙酰胆碱酯酶活性，可用于制备抑制胆碱酯酶活性、抗肿瘤和抗氧化的药物。
附图说明
图1、新化合物goodyschlea的1h-nmr谱图；
图2、新化合物goodyschlea的13c-nmr谱图；
图3、新化合物goodyschlea的hmbc谱图；
图4、新化合物goodyschlea的hsqc谱图；
图5、新化合物goodyschlea的1h-ihcosy谱图；
图6、新化合物goodyschlea的noesy谱图；
图7、新化合物goodyschlea的高分辨质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1新化合物的制备
材料来源斑叶兰药材于2014年2月采于浙江丽水，标本保存于扬州大学医学院药学系中药标本馆。
提取分离：将斑叶兰干燥全草10kg，剪碎，95％乙醇85℃回流提取4次，合并提取液，减压浓缩干燥，得到总浸膏(617g)。将总浸膏用10倍量的蒸馏水分散，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位(226g)、乙酸乙酯部位(190g)和正丁醇部位(174g)。将乙酸乙酯部位浸膏进行硅胶柱层析，依次用体积比为20∶1、10∶1、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1的二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，合并后得10个流份；流份3经硅胶柱层析，依次用体积比为30∶1、10∶1、2∶1、1∶3、0∶1的石油醚-丙酮梯度洗脱，合并后得10个流份；流份7经sephadexlh-20柱层析，用体积比为2∶1的氯仿-甲醇洗脱，合并后得6个流份；流份3经半制备高效液相色谱纯化，用体积比为3∶2的甲醇-水洗脱，收集主峰，得到该化合物。
实施例2新化合物的结构鉴定
本发明实施例1制备的新化合物为黄色无定形粉末。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z249.0747[m h] (计算值249.0757)，271.0565[m na] (计算值271.0577)，结合1h-nmr和13c-nmr确定该化合物的分子式为c13h12o5，计算不饱和度为8。在1h-nmr中可见1个芳香环上氢信号δh7.07(2h，s)和1个连接在苯环上的甲氧基的氢信号δh3.95(6h，s)，提示结构中存在1，3，4，5取代的对称的苯环片段。另外，1h-nmr中还可见三个烯氢质子信号δh7.47(1h，d，j＝5.4hz)、6.16(1h，d，j＝5.4hz)和5.95(1h，s)。在1c-nmr中可见13个碳信号，包括一个内酯上羰基碳信号δc170.6。以上信息提示该化合物为5-芳基-2(5h)-呋喃酮衍生物。在hmbc谱中，h-5与c-3，c-4和c-6′有相关，h-2′与c-5，c-3′和c-4′有相关，3′-och3与c-3′有相关，5′-och3与c-5′有相关，确定甲氧基连在c-3′和c-5′。在noesy谱中，h-3和h-5有noe相关确定外环上双键构型为z型。综上，确定了该化合物的结构，并命名为goodyschlea。表1为该新化合物的1h-nmr与13c-nmr数据。新化合物的结构如下：
表1：本发明新化合物goodyschlea的1h-nmr(600mhz，cdcl3)和13c-nmr(150mhz，cdcl3)数据
实施例3新化合物的抗胆碱酯酶活性测试
采用ellman法测定实施例1制备的新化合物goodyschlea的乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性。于96孔板中每孔加入100μlpbs(ph＝7.2)，然后每孔加入20μl终浓度为100μm、50μm、25μm、12.5μm和6.25μm的goodyschlea溶液，20μl1.2μm碘化硫代乙酰胆碱或碘化硫代丁酰胆碱作为酶反应底物，以及20μl0.05u/ml电鳗乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶，在37℃条件下孵育30min后，加入20μl4％的十二烷基硫酸钠终止反应，并加入20μl0.6μm显示溶剂5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，立即在412nm下测定吸光度值。试验重复三次，根据以下公式计算抑制率，并进一步用spss22.0计算半数抑制浓度(ic50)。以加兰他敏为阳性对照药。
抑制率(％)＝[1-(od给药-od对照)/od空白]×100％，其中od给药为加goodyschlea的给药组的od值，od对照为未加入酶的对照组od值，od空白为未加goodyschlea的空白组od值。
实验结果显示本发明新化合物抑制乙酰胆碱酯酶的ic50值为78.52±6.43μm，抑制丁酰胆碱酯酶的ic50值为6.88±1.63μm，说明具有显著的抑制丁酰胆碱酯酶活性和弱抑制乙酰胆碱酯酶活性。阳性对照药加兰他敏抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的ic50值分别为：0.45±0.06μm和1.57±0.28μm。
实施例4新化合物的抗肿瘤活性测试
人胃癌sgc-7901和人肝癌hepg-2细胞购自中科院上海细胞库，用含10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素的rpmi-1640完全培养液，于37℃，5％co2培养箱中培养传代。取对数生长期的sgc-7901和hepg-2细胞接种于96孔板，每孔约5×103个细胞，随机分成对照组(含0.1％dmso的完全培养液)、给药组(goodyschlea用dmso配成100mm的母液，用完全培养液稀释，终浓度分别为100μm、50μm、25μm、12.5μm和6.25μm)，每组设5个复孔，放置于37℃，5％co2培养箱中培养。作用48小时后，每孔加入20μl的mtt溶液，放入培养箱中孵育4h，弃上清，每孔加150μldmso，置摇床上震荡10min，使结晶充分溶解。在酶标仪490nm波长处测吸光度(od值)。试验重复三次，根据以下公式计算抑制率，并进一步计算其ic50值。以顺铂为药性对照药物。
抑制率＝[1-(od给药组/od对照组)]×100％。其中od给药组为加goodyschlea的给药组od值，od对照组为不加goodyschlea的对照组od值。
实验结果显示本发明新化合物对sgc-7901和hepg-2细胞的ic50值分别为74.97±5.72μm和89.80±6.39μm，阳性对照药顺铂对sgc-7901和hepg-2细胞的ic50值分别为32.34±3.98μm和24.12±2.22μm。说明goodyschlea对上述两种肿瘤细胞具有弱细胞毒活性，可用于制备抗胃癌和肝癌的药物。
实施例5新化合物的抗氧化作用测试
比色法测定goodyschlea清除dpph自由基的能力。给药组取1ml含dpph的甲醇溶液(126.80μm)加入到试管中，再加入1ml不同浓度的含goodyschlea的甲醇溶液，使其终浓度为分别为100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm和3.125μm；对照组取1ml甲醇溶液加入到试管中，再加入1ml不同浓度的goodyschlea溶液；空白组取1mldpph溶液加入到试管中，再加入1ml甲醇溶液。三组均充分混匀，室温避光静置30min，517nm下测定吸光值。试验重复三次，根据以下公式计算dpph自由基的清除率，并进一步计算ic50值。以维生素c为阳性对照药。
dpph清除率(％)＝[1-(od给药组-od对照)/od空白]×100％，其中od给药为给药组的od值，od对照为对照组的od值，od空白为空白组的od值。
实验结果显示本发明新化合物的ic50值为16.25±0.21μm，与阳性对照药维生素cic50(12.52±0.44μm)相当，说明其具有良好的抗氧化活性。
1.一种化合物，其特征在于，所述化合物的分子式为c13h12o5，其化学结构式如下：
2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将斑叶兰干燥药材用95％乙醇提取后，过滤，合并滤液，再减压浓缩干燥，获得95％乙醇提取物；
b)将95％乙醇提取物加水分散，并以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
c)将乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化，得到所述的化合物。
3.根据权利要求2所述化合物的制备方法，其特征在于：步骤c)所述乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化的步骤为：
1)将乙酸乙酯部位在硅胶上进行柱层析，用体积比为(20∶1)～(0∶1)的二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，获得二氯甲烷-丙酮洗脱物；
2)取二氯甲烷-丙酮洗脱物再进行硅胶柱层析，用体积比为(30∶1)～(0∶1)的石油醚-丙酮梯度洗脱，得石油醚-丙酮洗脱物；
3)取石油醚-丙酮洗脱物进行凝胶柱色谱分离，用体积比为2∶1的三氯甲烷-甲醇洗脱，得到三氯甲烷-甲醇洗脱物；
4)取三氯甲烷-甲醇洗脱物经半制备高效液相色谱纯化，用体积比为3：2的甲醇-水洗脱，从甲醇-水洗脱液中得到纯的化合物。
4.根据权利要求3所述化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤c)乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化的具体步骤为：用体积比为(20∶1)～(0∶1)的二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，合并后得10个流份；流份3经硅胶柱层析，用体积比为(30∶1)～(0∶1)的石油醚-丙酮梯度洗脱，合并后得10个流份；流份7经sephadexlh-20柱层析，用体积比为2∶1的氯仿-甲醇洗脱，合并后得6个流份；流份3经半制备高效液相色谱纯化，用体积比为3∶2的甲醇-水洗脱，收集主峰，得到该化合物。
5.权利要求1所述的化合物在制备用于抑制胆碱酯酶活性、抗肿瘤或抗氧化药物中的应用。
技术总结