本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测细胞内so2的比率型荧光探针及其应用。
背景技术：
二氧化硫（so2）作为重要的生物物种，主要通过谷胱甘肽和半胱氨酸等含硫醇的氨基酸代谢产生。作为独特的抗氧化剂，so2积极参与氧化还原状态的调节，并且被广泛应用于抗微生物剂、酶抑制剂以及食品和制药行业中的防腐剂和抗氧化剂。据研究表明，so2可以通过上调no/cgmp信号通路引起血管舒张，同时在心血管系统中起信使作用。但so2或其衍生物的过量摄入会导致神经系统疾病（例如脑癌，中风，偏头痛等）以及呼吸系统疾病（例如哮喘，慢性支气管炎，肺气肿等）。线粒体作为主要的能量产生细胞器，在细胞损伤和应激的适应性免疫反应中起着关键作用，并且催化l-半胱氨酸产生内源性so2的天冬氨酸转氨酶2（aat-2）主要在细胞的线粒体中组成性表达。然而，关于线粒体so2及其衍生物对细胞的潜在影响及生理特性尚不明确。因此，开发出有效监测细胞内线粒体so2及其衍生物的方法对医学诊断和生物学研究具有重要意义。
迄今为止，已经开发出了多种分析so2及其衍生物的方法，包括高效液相色谱（hplc），毛细管电泳，压电传感器以及分光光度法。但这些方法操作比较复杂且不能实现对样品的无损检测和原位检测。与其他技术相比，小分子荧光探针由于其高的时空分辨率以及实时和非侵入性检测等优势而被认为是一种有力的检测工具。值得注意的是，比率型荧光探针由于其从不同的通道输出荧光信号，不易受外界环境干扰而引起了更多关注。目前已经报道了许多用于检测so2的荧光探针，反应机理主要基于醛/酮的亲核加成或乙酰丙酸酯的裂解。然而这类探针由于容易受到其他生物硫醇的干扰而存在局限性。因此激发我们开发一种新型的，具有高选择性和线粒体靶向性的比率型荧光探针。
技术实现要素：
针对现有技术中的问题，本发明提供一种检测二氧化硫的荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强，并且能够定位线粒体。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内检测硫酸根的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测二氧化硫的荧光探针，简称mnp，其化学结构式如式（i）所示：
式（i）。
上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）将4-溴-1,8-萘二甲酸酐和β-氨基丙酸于溶剂中加热回流反应，分离纯化产物，得到化合物1：
（2）化合物1和n-羟基邻苯二甲酰亚胺在碱性条件下在溶剂中加热回流并搅拌，反应结束后将反应混合液倒入冷水中，用酸调ph至沉淀析出，将沉淀分离并纯化，得到化合物2：
（3）在保护气氛下，将化合物2和4-哌嗪基苯乙酮在edc、hobt和diea存在下于2mldmf中反应，将反应产物浓缩并纯化，得到化合物3：
（4）将化合物3和4-二乙氨基水杨醛在浓硫酸中加热搅拌反应，将反应混合液倒入冷水中，用酸调ph至沉淀析出，将沉淀分离并纯化，得荧光探针。
步骤（2）和（3）中，所述纯化步骤为：用体积比为20:1的ch2cl2:ch3oh为淋洗液过硅胶柱。
步骤（4）中，所述纯化步骤为：用体积比为30:1的ch2cl2:ch3oh为淋洗液过硅胶柱。
一种上述荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中so2、亚硫酸氢根或亚硫酸根试剂的应用。
本发明的机理如下：
本发明使用苯并吡啶盐作为so2识别位点及线粒体靶向基团，并利用具有出色光稳定性的萘酰亚胺荧光团和带正电荷的苯并吡啶部分构建成基于fret机理的比率型荧光探针。so32-可通过迈克尔加成反应中断探针的π共轭体系，从而使深红色发射带的荧光强度降低，获得作为典型荧光团的萘酰亚胺的发射。
本发明具有以下优点：
本发明提供的线粒体靶向用于检测细胞内so2的荧光探针可经化学合成获得，合成方法简单易行，原料廉价易得，制备成本低。本荧光探针具有高选择性，检测过程中不受其他组分的干扰。本荧光探针的响应速度快、灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性，可以实现对细胞内so2的快速准确检测。本发明的探针在研究生物细胞内so2对生理及病理过程的影响具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是荧光探针的1hnmr图谱；
图2是荧光探针在不同浓度na2so3条件下的荧光光谱；
图3是荧光探针与na2so3浓度的线性关系；
图4是荧光探针与na2so3反应的动力学；
图5是荧光探针对不同物质的选择性；
图6是荧光探针在活细胞中的成像应用。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1荧光探针的合成
（1）将4-溴-1,8-萘二甲酸酐（554mg，2mmol）和β-氨基丙酸（267mg，3mmol）溶于10ml乙醇中，于90℃下加热回流4h。待冷却至室温后，将析出的沉淀进行抽滤并用乙醇洗涤，在真空下干燥，得到化合物1（605mg，87％）：
（2）将化合物1(522mg，1.5mmol)、n-羟基邻苯二甲酰亚胺（293.4mg，1.8mmol）和碳酸钾（310.5mg，2.25mmol）溶于2mldmso中，于120℃下回流搅拌5h后，将反应混合液倒入5ml冷水中，用hclo4调ph至沉淀析出，抽滤后在真空下减压浓缩，并用ch2cl2:meoh=20:1的洗脱液通过柱层析纯化，得到化合物2（248mg，58%）：
（3）将化合物2（171mg,0.6mmol）、4-哌嗪基苯乙酮（122mg，0.6mmol）、edc（230mg，1.2mmol）和hobt（40.5mg，0.3mmol）溶于2mldmf中，搅拌10min后加入100µldiea，在氮气保护下于室温搅拌5h后，萃取除去dmf，将反应混合物真空浓缩，并通过柱层析纯化（ch2cl2:meoh=20:1）得到化合物3（200.6mg，71%）：
（4）将化合物3（141.3mg，0.3mmol）和4-二乙氨基水杨醛（116mg，0.6mmol）溶解于2ml浓硫酸溶液中于90℃下搅拌5h。冷却至室温后，将混合物倒入5ml冰水，并向溶液滴加高氯酸至沉淀析出。然后将沉淀过滤，洗涤以提供粗产物。粗产物通过柱层析法纯化（ch2cl2:meoh=5:1），得到荧光探针（127mg，58％）：
其1hnmr图谱如图1。
实施例2荧光探针对不同浓度na2so3的响应
将实施例1中获得的探针，用乙腈溶解后，用pbs稀释成5μm探针缓冲溶液（含10%乙腈，ph7.4）。取若干份上述探针溶液，加入na2so3溶液使其浓度分别为：0-200μm，然后进行荧光检测（λex=405和561nm）；计算各体系中相对荧光强度；该探针对不同浓度na2so3的响应如图2所示：最大荧光强度峰值为534和634nm，随着na2so3溶液浓度的提高，绿色荧光强度逐渐增强，红色荧光强度逐渐减弱。
以na2so3浓度分别为0-100μm时检测物浓度为横坐标，以534和634nm处相对应荧光强度比率(i534/i634)为纵坐标，得图3a，可见i534/i634的荧光强度比率与检测物浓度呈线性相关，随着浓度的增大荧光强度增强。当na2so3的浓度从0μm增加到200μm时，荧光强度的比率（i534/i634）从0.621增加到16.998，对na2so3的响应约为27倍，如图3b所示。
实施例3荧光探针对na2so3反应的响应动力学
将实施例1中获得的探针，用乙腈溶解后，用pbs稀释成5μm探针缓冲溶液（含10%乙腈，ph7.4）。取适量上述探针溶液，加入浓度为100μm的na2so3溶液，进行动力学检测（λex=405和561nm），每隔30s检测一次，检测12min。该探针对na2so3的动力学响应如图4所示：i534/i634的荧光强度比率以时间依赖性方式逐渐增加，在8min时荧光信号基本稳定。说明本探针反应迅速，可作为实时检测活细胞中na2so3的荧光探针。
实施例4荧光探针对不同离子的选择性
将实施例1中获得的探针，用乙腈溶解后，用pbs稀释成5μm探针缓冲溶液（含10%乙腈，ph7.4）。取18份体积为4ml的上述探针溶液，分别加入10μl浓度为40mm的不同物质的pbs溶液，然后进行荧光扫描（λex=405和561nm），计算各体系中相对荧光强度比率；以534和634nm处相对应荧光强度（i534/i634）为纵坐标，得到探针对不同物质的响应柱状图，如图5所示，其中，1-18分别为空白、ca2 、mg2 、k 、zn2 、ba2 、f-、i-、s2-、onoo-、clo-、葡萄糖、vc、dtt、cys、hcy、gsh、so32-。可知，荧光探针仅对加入na2so3的溶液有响应，抗干扰性强。
实施例5荧光探针与商业化探针对线粒体的共定位
将实施例1中获得的探针，用乙腈溶解后，用pbs稀释成5μm探针缓冲溶液（含10%乙腈，ph7.4）。然后将商业探针mtr配制为终浓度为1μm的探针稀释液。分别将接种好的细胞在两种探针稀释液中37°c孵育30min，用pbs洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（mnp激发波长405nm；mtr激发波长561nm），结果显示：商业探针mtr能够定位线粒体中，发出红色荧光；荧光探针mnp能够在线粒体中发出绿色荧光；两者的荧光图像叠加后计算得共定位系数达0.9以上，说明探针mnp能够成功定位于线粒体中。
实施例6荧光探针在活细胞中的成像应用
将3份hela细胞放置于含有10%胎牛血清（fbs）的培养基（dmem）中，在含5%co2的湿润环境下于37℃培养48h。用微量进样器吸取荧光探针mnp的溶液于含有hela细胞的培养基中，使探针浓度为5μm继续在培养箱中培养30min。之后用pbs冲洗3遍，然后分别与等量的pbs溶液、50μm和100μmna2so3溶液一起孵育30min，在激发波长为405nm下于dapi、fitc、tritc通道进行荧光成像，结果如图6所示。随着na2so3的浓度升高，绿色通道的荧光强度逐渐增强，红色通道的荧光强度逐渐减弱，表明探针mnp能够实现活细胞内so2的可视化检测。
1.一种检测二氧化硫的荧光探针，其化学结构式如式（i）所示：
式（i）。
2.根据权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将4-溴-1,8-萘二甲酸酐和β-氨基丙酸于溶剂中加热回流反应，分离纯化产物，得到化合物1：
（2）化合物1和n-羟基邻苯二甲酰亚胺在碱性条件下在溶剂中加热回流并搅拌，反应结束后将反应混合液倒入冷水中，用酸调ph至沉淀析出，将沉淀分离并纯化，得到化合物2：
（3）在保护气氛下，将化合物2和4-哌嗪基苯乙酮在edc、hobt和diea存在下于2mldmf中反应，将反应产物浓缩并纯化，得到化合物3：
（4）将化合物3和4-二乙氨基水杨醛在浓硫酸中加热搅拌反应，将反应混合液倒入冷水中，用酸调ph至沉淀析出，将沉淀分离并纯化，得荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）和（3）中，所述纯化步骤为：用体积比为20:1的ch2cl2:ch3oh为淋洗液过硅胶柱；
步骤（4）中，所述纯化步骤为：用体积比为30:1的ch2cl2:ch3oh为淋洗液过硅胶柱。
4.一种如权利要求1所述的荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中so2、亚硫酸氢根或亚硫酸根试剂的应用。
技术总结