本发明涉及医药技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测神经损伤的荧光化合物，本发明还涉及所述化合物在检测神经损伤中的应用。
背景技术：
阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。由于阿尔茨海默病因复杂，确切的发病机理目前尚不清楚，临床上主要通过评价患者的认知能力损伤来诊断，确诊患者多已进入病程的中晚期而延误了治疗。缺乏有效的检测手段已成为阿尔茨海默病早起诊断和治疗的重大障碍。
对于阿尔茨海默病的发病机制，目前主要有3种假说：β-淀粉样蛋白级联假说、tau蛋白假说和血管源性假说。其中，β-淀粉样蛋白级联假说占主导地位，并且研究得较为成熟。该假说认为，β-淀粉样蛋白(amyloid,aβ)是阿尔茨海默病的重要诱发因素之一，神经元纤维缠结(nfts)和β-淀粉样蛋白在脑中的沉积形成aβ斑块，是阿尔茨海默病最为显著的病理性标志。aβ斑块甚至可能在阿尔茨海默病发病前的数十年就开始出现，是阿尔茨海默病最早的神经组织退化标志和重要病理学特征。因此，简单有效且非侵入性的在患者脑中检测并定量aβ斑块的方法将对阿尔茨海默病的诊断和治疗很有用。
由于脑内的aβ斑块与正常脑组织具有许多相同的物理性质(例如密度和水分含量)，因此这些沉积物在体内难以直接成像。以前使用磁共振成像(mri)和计算机x线断层摄影术(ct)对aβ斑块直接成像(不使用探针)的研究，效果都难以令人满意。
此外，也出现了大量放射性aβ分子探针，例如[11c]pib，[123i]ibox，[123i]impy，[18f]fddnp，[11c]sb-13，[11c]-bf-227，其中[18f]fddnp，[11c]pib，[11c]sb-13，[11c]-bf-227都已进入临床阶段。但是放射性显像剂的应用受到众多因素限制，放射性显像剂所发出的射线对人体具有一定的辐射损伤，放射性显像剂的生产较为困难等。
荧光成像技术因具有非侵入、可视化、高时空分辨率、廉价、安全和快速等优势，已被广泛用于肿瘤诊断、生物分子检测、药物分布和代谢等诸多领域。生物体的一些组分(如黑色素、血红蛋白、细胞色素等)对可见光波段有较高的吸收或散射，会导致可见光的组织穿透性较差，且在此波段内生物组织有一定的自荧光干扰。与之相比，血液和人体组织对650-900nm的近红外(nearinfrared，nir)光吸收和散射较低，所以近红外的荧光容易透过生物组织用于活体荧光成像。在过去的数年，已报道了多个用于探测aβ斑块的荧光化合物，但是一般都存在吸收和发射波长过短，使得激发和发射光的组织穿透性较差，与aβ斑块结合后荧光量子产率不高，检测精确较差等问题。
因此，亟需开发更多的荧光量子产率高、吸收和发射波长靠近近红外的用于检测aβ斑块的荧光化合物。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的问题，提供一种对于β-淀粉样蛋白(aβ)具有增强结合特性的荧光化合物。本发明化合物具有接近或位于近红外的最大吸收和发射波长，在与aβ-聚集体结合后荧光大大增强，并有一定程度的红移；此外，本发明化合物易于穿过血脑屏障，特别适合在人体或动物体中检测aβ-斑块，从而检测由aβ-斑块导致的神经损伤。
本发明所述荧光化合物具有式i所示的结构：
其中：
r1、r2各自独立地选自c1-c6烷基；
或者r1、r2可连接在一起，从而与其相连的n原子形成5-7元环。
在本发明的一个实施方案中，r1、r2各自独立地选自c1-c4烷基。
在本发明的一个实施方案中，r1、r2各自独立地选自甲基、乙基、正丙基或正丁基。
在本发明的一个实施方案中，r1、r2选自乙基。
在本发明的一个实施方案中，r1、r2连接在一起，从而与其相连的n原子形成吡咯烷基或哌啶基。
在本发明的一个实施方案中，式i所示的化合物选自：
本发明还提供了式i所示的化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1：在碱的存在下式ii所示的卤代化合物与式iii所示的胺反应得到式iv所示的化合物；
步骤2：式iv所示的化合物与对苯二甲醛、醋酸铵反应得到式v所示的化合物；
步骤3：式v所示的化合物与丙二腈反应得到式i所示的化合物。
其中，r1-r2如本文所定义，x表示卤素，优选氯或溴，更优选溴。
在一个优选的实施方案中，所述方法包括如下步骤：
步骤1：将式ii所示的卤代化合物和式iii所示的胺与碱溶于有机溶剂中，加热至60℃-120℃反应，反应结束后向冷却的反应液中加入水，过滤析出的固体，重结晶得到式iv所示的化合物；
步骤2：将对苯二甲醛和醋酸铵溶解于有机溶剂中，缓慢加入式iv所示的化合物，加热至回流进行反应，反应结束后将冷却的反应液倒入冰水混合物中，中和后过滤生成的固体，重结晶得到式v所示的化合物；
步骤3：将式v所示的化合物和丙二腈溶于酸酐中，加热至回流进行反应，反应结束后减压蒸除酸酐，用水洗涤残余物，重结晶，再用硅胶柱层析进行纯化，得到式i所示的化合物。
在一个优选的实施方案中，步骤1中的碱包括无机碱，所述无机碱例如为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾。
在一个优选的实施方案中，步骤1中的有机溶剂包括乙醇、dmf、dmso、甲苯等。
在一个优选的实施方案中，步骤2中的有机溶剂包括冰醋酸。
在一个优选的实施方案中，步骤3中的酸酐包括醋酸酐。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含式i所示的化合物以及药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种检测aβ斑块的方法，所述方法包括：向有需要的患者施用可检测量的式i所示的化合物，然后非创伤性地检测该化合物。
本发明进一步提供了一种显像aβ斑块的方法，所述方法包括：向有需要的患者施用可检测量的式i所示的化合物，然后非创伤性地使aβ斑块显像。
本发明还提供了一种检测与aβ斑块相关的神经障碍的方法，所述方法包括：向有需要的患者施用式i所示的化合物，然后非创伤性地检测该化合物。在一个优选的实施方案中，所述神经障碍包括阿尔茨海默病或脑淀粉样血管病。
在一个优选的实施方案中，向有需要的患者施用式i所示的化合物包括整体给药或局部给药。在整体给药中，可将式i所示的化合物施用至患者以使其递送至全身，例如通过肠胃外、口服或静脉内递送。在局部给药中，可将式i所示的化合物施用至特定的器官或者组织。
适合这些给药方式的药物组合物，能够使用药学上可接受的载体，例如：水、生理盐水、甘油、滑石、葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉浆、三硅酸镁、玉米淀粉、角质素、胶体硅、土豆淀粉和其他适用于制备固体形式、半固体形式或者液体形式制剂的载体，另外还可以使用辅助剂、稳定剂、增厚剂、着色剂和香料。
在一个优选的实施方案中，优选在施用后足以使式i所示的化合物与aβ斑块充分结合的时间之后进行所述检测。
在一个优选的实施方案中，优选采用光学方式检测式i所示的化合物或使aβ斑块显像。
在另一方面，本发明还提供了式i所示的化合物在制备用于检测aβ斑块和/或用于显像aβ斑块和/或用于检测与aβ斑块相关的神经障碍的药物中的应用。在一个优选的实施方案中，所述神经障碍包括阿尔茨海默病或脑淀粉样血管病。
有益效果
本发明提供了一种用于检测神经损伤的荧光化合物，所述化合物具有以下优点：
1)具有接近或位于近红外的最大吸收和发射波长，检测时的激发和发射光可低损耗地穿透人体或动物体组织，有利于提高检测精度。
2)与aβ结合后荧光大大增强，并有一定程度的红移，只需少量化合物即可实现aβ的检测。
3)易于穿过血脑屏障，因此特别适合在人体或动物体中检测aβ-斑块，从而检测由aβ-斑块导致的神经损伤。
4)制备工艺简单、操作容易、三废少，原料便宜、易得，具有很高的经济性和环保性。
附图说明
图1为本发明化合物2的吸收光谱图。
图2为本发明化合物2的荧光光谱图。
图3为本发明化合物2与aβ1-42聚集体的滴定图。
图4为本发明化合物2在小鼠脑成像中的相对荧光强度。
具体实施方式
通过以下实施例，更详细地描述了本发明式i所示的化合物的制备过程，仅用于说明目的，而不限制本发明的范围。
实施例1：2-(4-(9-(二乙基氨基)-1h-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉-2-基)苯亚甲基)丙二腈(化合物1)
步骤1：将2-溴-1,10-菲罗啉-5,6-酮)(10.0mmol)、碳酸钾(20.0mmol)和二乙胺(11.0mmol)溶解于30mldmf中，搅拌下加热至100℃反应2h，tlc监测反应进行。在反应结束后冷却至室温，加入200ml的水以析出固体，过滤后滤饼用水洗两次，再用乙醇重结晶，得到2-(二乙基氨基)-1,10-菲罗啉-5,6-二酮2.03g，产率：72.3％。ms(esi)m h：282。
步骤2：将对苯二甲醛(5.0mmol)和醋酸铵(50mmol)溶解于40ml的冰醋酸中，搅拌下加热至回流，然后缓慢滴加2-(二乙基氨基)-1,10-菲罗啉-5,6-二酮(5.0mmol)溶于10ml冰醋酸的溶液，滴完后继续回流反应3h，tlc监测反应进行。在反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水混合液中，用氨水中和至ph为7左右，过滤生成的固体沉淀物并用大量的热水洗涤，再用甲醇重结晶，得到4-(9-(二乙基氨基)-1h-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉-2-基)苯甲醛1.63g，收率82.5％。ms(esi)m h：396。
步骤3：4-(9-(二乙基氨基)-1h-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉-2-基)苯甲醛(3.0mmol)溶于5ml醋酸酐，再加入丙二腈(3.3mmol)溶于2ml醋酸酐的溶液，搅拌下回流18小时，减压蒸除溶剂，加入20ml的水并用超声波分散，过滤后滤饼用乙醇重结晶，然后用硅胶柱色谱(乙酸乙酯:石油醚＝1:99-10:99)进行纯化，得到标题化合物0.73g，收率54.9％。
ms(esi)m h：444。
元素分析：理论值c,73.12；h,4.77；n,22.11
实测值c,73.65；h,4.56；n,21.79
氢谱(400mhz，dmso-d6)δ8.80(d,1h,j＝7.5hz),8.23(d,1h,j＝7.5hz),8.05(t,1h,j＝7.5hz),7.97(d,2h,j＝7.5hz),7.79(s,1h),7.62-7.65(m,3h),7.26(d,1h,j＝7.5hz),3.70(q,4h,j＝8.0hz),1.18(t,6h,j＝8.0hz)。
实施例2：2-(4-(9-(吡咯烷-1-基)-1h-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉-2-yl)苯亚甲基)丙二腈(化合物2)
步骤1：将2-溴-1,10-菲罗啉-5,6-酮)(10.0mmol)、碳酸钾(20.0mmol)和四氢吡咯(11.0mmol)溶解于30mldmf中，搅拌下加热至100℃反应4h，tlc监测反应进行。在反应结束后冷却至室温，加入150ml的水以析出固体，过滤后滤饼用水洗两次，再用甲醇重结晶，得到2-(吡咯烷-1-基)-1,10-菲罗啉-5,6-二酮2.27g，产率：81.4％。ms(esi)m h：280。
步骤2：将对苯二甲醛(5.0mmol)和醋酸铵(50mmol)溶解于50ml的冰醋酸中，搅拌下加热至回流，然后缓慢滴加2-(吡咯烷-1-基)-1,10-菲罗啉-5,6-二酮(5.0mmol)溶于15ml冰醋酸的溶液，滴完后继续回流反应5h，tlc监测反应进行。在反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水混合液中，用氨水中和至ph为7左右，过滤生成的固体沉淀物并用大量的热水洗涤，再用乙醇重结晶，得到4-(9-(吡咯烷-1-基)-1h-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉-2-基)苯甲醛1.52g，收率77.6％。ms(esi)m h：394。
步骤3：4-(9-(吡咯烷-1-基)-1h-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉-2-基)苯甲醛(3.0mmol)溶于5ml醋酸酐，再加入丙二腈(3.3mmol)溶于2ml醋酸酐的溶液，搅拌下回流24小时，减压蒸除溶剂，加入30ml的水并用超声波分散，过滤后滤饼用乙醇重结晶，然后用硅胶柱色谱(乙酸乙酯:环己烷＝1:99-10:99)进行纯化，得到标题化合物0.63g，收率47.8％。
ms(es)m h：442。
元素分析：理论值c,73.45；h,4.34；n,22.21
实测值c,73.12；h,4.54；n,22.34
氢谱(400mhz，dmso-d6)δ8.80(d,1h,j＝7.5hz),8.23(d,1h,j＝7.5hz),8.05(t,1h,j＝7.5hz),7.97(d,2h,j＝7.5hz),7.79(s,1h),7.62-7.65(m,3h),7.27(d,1h,j＝7.5hz),3.58(t,4h,j＝8.0hz),2.05(m,4h)。
实施例3：本发明化合物的吸收和荧光光谱。
以化合物2为例，测试本发明化合物在不同溶剂中的吸收和荧光光谱。
将化合物2溶于二甲基亚砜中，配制成10mm母液，避光贮存在4℃冰箱中备用。取10μl母液，分别用dmso、乙醇和pbs稀释成10μm的浓度，测量其吸收光谱，结果如图1所示。化合物2在dmso、乙醇和pbs中的最大吸收波长分别为607nm、603nm和611nm。
以610nm的光进行激发，测试化合物2的荧光光谱，结果如图2所示。化合物2在dmso、乙醇和pbs中的最大发射波长分别为686nm，685nm和663nm。
上述实验结果表明，本发明化合物具有接近近红外的最大吸收波长和位于近红外的最大发射波长，这对于激发和发射光低损耗地穿透人体或动物体组织特别有利；此外，这也有利于提高检测精度。
实施例4：本发明化合物的荧光量子产率
以化合物2为例，测量本发明化合物在pbs中的荧光量子产率。
选取甲酚紫为标准化合物(在乙醇中，其荧光量子产率为0.53)，根据φp＝φs*fp/fs*as/ap*100％进行运算，其中φp、φs为待测化合物及标准化合物的荧光量子产率，fp、fs为待测化合物及标准化合物的积分荧光强度，ap、as为待测化合物及标准化合物在该激发波长的入射光强度。
经计算，化合物2在pbs中以610nm的光进行激发时，荧光量子产率为1.5％。
实施例5：本发明化合物与aβ1-42聚集体的体外结合实验
以化合物2为例，测试本发明化合物与aβ1-42聚集体的体外结合情况
取实施例3的化合物2母液，用pbs将其以1：10000的比例稀释成1μm的浓度，分别加入不同量的由aβ1-42蛋白在37℃水浴中培育的aβ1-42聚集体进行荧光滴定(使aβ1-42聚集体的浓度分别为0μm，1μm，2μm，3μm，4μm，5μm，10μm，15μm，20μm，25μm，30μm，35μm，40μm，45μm，50μm)，每次加入后孵育5分钟测其荧光光谱，测试情况如图3所示。
结果表明，随着aβ1-42聚集体的增加，体系的荧光强度显著增强，并有一定程度的红移(5nm)，荧光增强的程度最高可达15倍左右。这表明化合物2与aβ1-42聚集体产生结合，并且结合的情况可通过荧光强度的变化反映出来。
实施例6：小鼠脑成像实验
以化合物2为例，测试本发明化合物穿过血脑屏障的情况。
取实施例3中化合物2母液，配置成化合物2的注射液(10mg/kg,10％吐温80，20％dmso，70％pbs)，经尾静脉注射入4组app/ps1双转基因小鼠(14月龄，雌性)以及4组同龄野生型小鼠体内(每组5只)，分别于注射后5、10、30、60min时断头取全脑，以610nm的光激发并测量荧光强度。各组取平均值，以5min时app/ps1双转基因小鼠所测得的荧光强度为基准(100％)，计算其余各组小鼠的相对荧光强度，测试情况如图4所示。
结果表明，化合物2可以快速通过小鼠的血脑屏障，小鼠脑部的荧光信号在初始时很快达到最大值。app/ps1双转基因小鼠的脑部荧光信号显著强于野生型小鼠，并且荧光信号保留的时间更长。这说明化合物2与app/ps1双转基因小鼠脑内的aβ斑块产生结合，一方面，这导致其脑部荧光信号的大大增强；另一方面，这也导致化合物2的清除速率下降。上述结果表明，本发明化合物适用用于检测脑部的aβ斑块，因此也适合用于检测与aβ斑块相关的神经障碍。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
1.一种式i所示的化合物：
其中：
r1、r2各自独立地选自c1-c6烷基；
或者r1、r2可连接在一起，从而与其相连的n原子形成5-7元环。
2.根据权利要求1所述的式i所示的化合物，其特征在于，所述r1、r2各自独立地选自c1-c4烷基，优选甲基、乙基、正丙基或正丁基，更优选乙基。
3.根据权利要求1所述的式i所示的化合物，其特征在于，所述r1、r2连接在一起，从而与其相连的n原子形成吡咯烷基或哌啶基。
4.根据权利要求1所述的式i所示的化合物，其特征在于，所述化合物选自：
5.根据权利要求1所述的式i所示的化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1：在碱的存在下式ii所示的卤代化合物与式iii所示的胺反应得到式iv所示的化合物；
步骤2：式iv所示的化合物与对苯二甲醛、醋酸铵反应得到式v所示的化合物；
步骤3：式v所示的化合物与丙二腈反应得到式i所示的化合物；
其中，r1-r2如权利要求1中所定义，x表示卤素，优选氯或溴，更优选溴。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1：将式ii所示的卤代化合物和式iii所示的胺与碱溶于有机溶剂中，加热至60℃-120℃反应，反应结束后向冷却的反应液中加入水，过滤析出的固体，重结晶得到式iv所示的化合物；
步骤2：将对苯二甲醛和醋酸铵溶解于有机溶剂中，缓慢加入式iv所示的化合物，加热至回流进行反应，反应结束后将冷却的反应液倒入冰水混合物中，中和后过滤生成的固体，重结晶得到式v所示的化合物；
步骤3：将式v所示的化合物和丙二腈溶于酸酐中，加热至回流进行反应，反应结束后减压蒸除酸酐，用水洗涤残余物，重结晶，再用硅胶柱层析进行纯化，得到式i所示的化合物。
7.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的式i所示的化合物以及药学上可接受的载体。
8.权利要求1-4中任一项所述的式i所示的化合物在检测aβ斑块和/或显像aβ斑块和/或检测与aβ斑块相关的神经障碍中的应用，其特征在于，向有需要的患者施用式i所示的化合物，然后非创伤性地检测该化合物或使aβ斑块显像。
9.权利要求1-4中任一项所述的式i所示的化合物在制备用于检测aβ斑块和/或用于显像aβ斑块和/或用于检测与aβ斑块相关的神经障碍的药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述神经障碍选自阿尔茨海默病或脑淀粉样血管病，优选阿尔茨海默病。
技术总结