【技术领域】
本发明属于生物制药工程领域，涉及一种微生物药物的制备方法，特别涉及一种他克莫司粗晶的制备方法。
背景技术：
他克莫司(tacrolimus，fk-506)是从s.tsukubaensis的发酵液中提取得到的大环内酯类强效免疫抑制剂，其免疫活性是环孢菌素a的10～100倍，在预防各种器官移植出现排斥反应的效果优于环孢菌素。他克莫司能减少肝肾移植受体的急、慢性排斥反应，患者使用后的细菌和病毒感染率也较环孢素治疗者低，尤其是他克莫司有较强的亲肝性，对肝移植的功效比环孢素强，而且fk-506和mmf(霉酚酸酯)及pred(强的松)三联用药具有明显的协同作用，效果更好。他克莫司不仅可用于防止器官移植免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮，具有广阔的应用前景。
目前，他克莫司一般采用微生物发酵生产，发酵液中除了他克莫司外，还有未利用完全的培养基、酸性化合物(如脂肪酸)、碱性物质(如生物碱，多肽，中性脂肪等脂溶性化合物)以及无机盐等，他克莫司在上述产物中的含量低，一般从发酵液中提取得到的黑褐色浓缩物为粘稠状，其中所含他克莫司的量低于40％，高效液相色谱(hplc)测定纯度低于60％，而主杂子囊霉素及二氢他克莫司的含量高于15％。他克莫司在液体状态易降解，在粘稠状浓缩物中亦不利于保存和运输，因而通常都是将发酵所得的黑褐色浓缩物马上纯化成纯度较高的他克莫司晶体以方便储存和运输。然而黑褐色浓缩物要纯化成纯度较高的他克莫司晶体须经过柱层析等以系列繁杂的工序才能得到他克莫司晶体。
有鉴于此，一种生产成本低廉、工艺简单、操作方便适合于工业化生产的他克莫司粗晶制备的改进方法是工业化生产他克莫司原料药所迫切需要的。本发明提供了一种他克莫司粗晶的制备方法,且目前市场上未见他克莫司粗晶形式的产品。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题，在于提供一种生产成本低廉、工艺简单、操作方便适合于工业化生产的他克莫司粗晶的制备方法。
本发明是这样实现的：
一种他克莫司粗晶的制备方法，将筑波链霉菌发酵产生的他克莫司发酵液采用如下步骤进行操作：
(1)富集洗涤：将他克莫司发酵液酸化，树脂吸附；过滤除去上清液，接着用水冲洗菌丝体和树脂，去除菌丝体后得到富含他克莫司的树脂；
(2)浸泡浓缩：将步骤(1)处理所得的富含他克莫司的树脂用丙酮搅拌浸泡，得到他克莫司浸泡液，减压浓缩成浓缩物；
(3)萃取：加入有机溶剂至步骤(2)处理所得的浓缩物中,并搅拌，然后过滤或离心除去固体，再将所得溶液静置以使溶液分为水、有机溶液两层，并除去水层以获得有机溶液；
(4)洗涤浓缩：加入饱和碳酸氢钠溶液至经过步骤(3)处理所得有机溶液中，所述饱和碳酸氢钠溶液与有机溶液体积比为0.1～1:1，对有机溶液进行洗涤，并除去水层，得到有机相，继续用纯化水洗涤到水层中性为止，然后分层以获得有机溶液层，最后将有机溶液减压浓缩，得到黑褐色油状物；
(5)结晶：加入极性溶剂至经过步骤(4)处理所得的油状物中搅拌溶解，获得他克莫司溶液,其中,极性溶剂与所述油状物的体积比为0.1～0.5:1，接着加入非极性溶剂，其中，非极性溶剂与油状物的体积比为5～15:1，并在室温下放置20～30h，结晶后过滤除去液体，得到他克莫司晶体；
(6)干燥：将获得的他克莫司晶体置于40～50℃减压干燥，得到的产品与他克莫司标准品进行比照，确定为他克莫司粗品。
进一步地，步骤(1)中所述树脂是指以苯乙烯-二乙烯基苯共聚体为骨架的非极性大孔树脂，树脂颗粒大小为60～120目，树脂用量为发酵液的1.0～3.5g/100ml(w/v)。
进一步地，所述非极性大孔树脂为hp20、hb16、d101或者hz816中的一种。
进一步地，步骤(3)中所述有机溶剂为丁醇，有机溶剂与步骤(2)所述的浸泡液体积比0.05～0.5：1。
进一步地，步骤(5)中所述极性溶剂为丁醇，所述非极性溶剂为石油醚、己烷、环己烷中的至少一种。
进一步地，所述制备方法还包括以下步骤：
(7)检测：采用高效液相色谱对步骤(6)中获得的他克莫司产品的纯度进行检测；
所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：zorbaxsb-cn柱，色谱柱规格：5μm，4.6mm×250mm，流动相：体积比为乙腈：水：磷酸＝57:43:0.1的乙腈和水的混合溶液，检测波长：210nm，柱温：60℃，流速：1ml/min。
本发明具有如下优点：
他克莫司发酵液仅通过包括富集洗涤、浸泡浓缩、吸附萃取、洗涤浓缩、洗涤结晶、洗晶干燥等步骤，不需要经过柱层析等一系列繁杂工序，即可得到他克莫司粗晶，避免使用大量有机溶媒，制备工艺简单、操作方便、成本低廉，适合工业化生产。本发明极大提高了他克莫司的纯度和含量，同时该产品具有方便储存和运输的优点。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明中实施例1链霉菌发酵产生他克莫司的hplc图谱。
图2是本发明中实施例1树脂hp20他克莫司浸泡液hplc图谱。
图3是本发明中实施例1干燥制得的他克莫司晶体的hplc图谱。
【具体实施方式】
本发明涉及一种他克莫司粗晶的制备方法，将筑波链霉菌发酵产生的他克莫司发酵液采用如下步骤进行操作：
(1)富集洗涤：将他克莫司发酵液ph值调至3.0～4.0进行酸化，树脂吸附；过滤除去上清液，接着用水冲洗菌丝体和树脂，去除菌丝体后得到富含他克莫司的树脂；所述树脂是指以苯乙烯-二乙烯基苯共聚体为骨架的非极性大孔树脂，树脂颗粒大小为60～120目，树脂用量为发酵液的1.0～3.5g/100ml(w/v)。
(2)浸泡浓缩：将步骤(1)处理所得的富含他克莫司的树脂用丙酮搅拌浸泡，得到他克莫司浸泡液，减压浓缩成浓缩物；
(3)萃取：加入有机溶剂至步骤(2)处理所得的浓缩物中,并搅拌，然后过滤或离心除去固体，再将所得溶液静置以使溶液分为水、有机溶液两层，并除去水层以获得有机溶液；所述有机溶剂为丁醇，有机溶剂与步骤(2)所述的浸泡液体积比0.05～0.5：1；
(4)洗涤浓缩：加入饱和碳酸氢钠溶液至经过步骤(3)处理所得有机溶液中，所述饱和碳酸氢钠溶液与有机溶液体积比为0.1～1:1，对有机溶液进行洗涤，并除去水层，得到有机相，继续用纯化水洗涤到水层中性为止，然后分层以获得有机溶液层，最后将有机溶液减压浓缩，得到黑褐色油状物；
(5)结晶：加入极性溶剂至经过步骤(4)处理所得的油状物中搅拌溶解，获得他克莫司溶液,其中,极性溶剂与所述油状物的体积比为0.1～0.5:1，接着加入非极性溶剂，其中，非极性溶剂与油状物的体积比为5～15:1，并在室温下放置24h，结晶后过滤除去液体，得到他克莫司晶体；所述极性溶剂为丁醇，所述非极性溶剂为石油醚、己烷、环己烷中的至少一种。
(6)干燥：将获得的他克莫司晶体置于45℃减压干燥，得到的产品与他克莫司标准品进行比照，确定为他克莫司粗品。
(7)检测：采用高效液相色谱对步骤(6)中获得的他克莫司产品的纯度进行检测；
所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：zorbaxsb-cn柱，色谱柱规格：5μm，4.6mm×250mm，流动相：体积比为乙腈：水：磷酸＝57:43:0.1的乙腈和水的混合溶液，检测波长：210nm，柱温：60℃，流速：1ml/min。
所述非极性大孔树脂为hp20、hb16、d101或者hz816中的一种。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例一
(1)富集洗涤：将650l他克莫司发酵液，用6n盐酸调节ph至3.5酸化，其中所述发酵液的效价为1522μg/ml，树脂吸附，其中，所述的树脂为大孔树脂hp20，树脂颗粒大小为60～120目，树脂用量为发酵液的2.8g/100ml(w/v)；过滤除去上清液，接着用水冲洗菌丝体和树脂，去除菌丝体后得到富含他克莫司的树脂；
(2)浸泡浓缩：将富含他克莫司的树脂用50l丙酮搅拌浸泡2次，合并得到他克莫司浸泡液100l，减压浓缩成浓缩物；
(3)萃取：加入10l丁醇至步骤(2)处理所得的浓缩物中，搅拌，然后过滤除去固体，再将所得溶液静置使溶液分为水、有机溶液两层，并除去水层以获得有机溶液；
(4)洗涤浓缩：加入2l饱和碳酸氢钠溶液至经过步骤(3)处理所得有机溶液中，对有机溶液进行洗涤，并除去水层，得到有机相，再加2l纯化水洗涤到水层中性为止，然后分层以获得有机溶液层，最后将有机溶液减压浓缩，得到黑褐色油状物；
(5)结晶：加入丁醇至经过步骤(4)处理所得的油状物中搅拌溶解，获得他克莫司溶液,其中,丁醇与所述油状物的体积比为0.1:1，接着加入石油醚，其中,石油醚与油状物的体积比为10:1，并在室温下放置24h，结晶后过滤除去液体，得到他克莫司晶体；
(6)干燥：将获得的他克莫司晶体置于45℃减压干燥，得到他克莫司粗品1233.4g。
与他克莫司标准品比照，经高效液相色谱检测，他克莫司粗晶的纯度为91.5％，主杂子囊霉素及二氢他克莫司的含量7.9％，他克莫司粗晶中的他克莫司含量为68.5％，实际收率为85.4％。
请参阅图1～3，其中图1为本发明中实施例1链霉菌发酵产生他克莫司的hplc图谱，从图1中可知发酵液中他克莫司纯度为40.8％，主杂子囊霉素及二氢他克莫司的含量8.0％；
图2是本发明中实施例1树脂hp20他克莫司浸泡液hplc图谱，从图2中可知树脂浸泡液中他克莫司纯度为78.0％，主杂子囊霉素及二氢他克莫司的含量12.8％；
图3是本发明中实施例1干燥制得的他克莫司晶体的hplc图谱，从图3中可知晶体中他克莫司纯度为91.5％，主杂子囊霉素及二氢他克莫司的含量7.5％。
实施例二
(1)富集洗涤：将600l他克莫司发酵液，用6n盐酸调节ph至3.5酸化，其中所述发酵液的效价为1539μg/ml，树脂吸附，其中，所述的树脂为大孔树脂hp20，树脂颗粒大小为60～120目，树脂用量为发酵液的3.0g/100ml(w/v)；过滤除去上清液，接着用水冲洗菌丝体和树脂，去除菌丝体后得到富含他克莫司树脂；
(2)浸泡浓缩：将富含他克莫司的树脂用50l丙酮搅拌浸泡2次，合并得到他克莫司浸泡液100l，减压浓缩成浓缩物；
(3)萃取：加入15l丁醇至步骤(2)处理所得的浓缩物中，搅拌，然后离心除去固体，再将所得溶液静置使溶液分为水、有机溶液两层，并除去水层以获得有机溶液；
(4)洗涤浓缩：加入2l饱和碳酸氢钠溶液至经过步骤(3)处理所得有机溶液中,对有机溶液进行洗涤，并除去水层，得到有机相，再加2l纯化水洗涤到水层中性为止，然后分层以获得有机溶液层，最后将有机溶液减压浓缩，得到黑褐色油状物；
(5)结晶：加入丁醇至经过步骤(4)处理所得的油状物中搅拌溶解，获得他克莫司溶液,其中,丁醇与所述油状物的体积比为0.3:1，接着加入己烷，其中,己烷与油状物的体积比为8:1，并在室温下放置24h，结晶后过滤除去液体，得到他克莫司晶体；
(6)干燥：将获得的他克莫司晶体置于45℃减压干燥，得到他克莫司粗品1133.6g。
与他克莫司标准品比照，经高效液相色谱检测，他克莫司粗晶的纯度为91.3％，主杂子囊霉素及二氢他克莫司的含量4.5％，他克莫司粗晶中的他克莫司含量为70.3％，实际收率为86.3％。
实施例三
(1)富集洗涤：将680l他克莫司发酵液，用6n盐酸调节ph至3.5酸化，其中所述发酵液的效价为1390μg/ml，树脂吸附，其中，所述的树脂为大孔树脂hp20，树脂颗粒大小为60～120目，树脂用量为发酵液的1.0～3.5％；过滤除去上清液，接着用水冲洗菌丝体和树脂，去除菌丝体后得到富含他克莫司树脂；
(2)浸泡浓缩：将富含他克莫司的树脂用50l丙酮搅拌浸泡2次，合并得到他克莫司浸泡液100l，减压浓缩成浓缩物
(3)萃取：加入12l丁醇至(2)处理所得的浓缩物中，搅拌，然后过滤除去固体，再将所得溶液静置使溶液分为水、有机溶液两层，并除去水层以获得有机溶液；
(4)洗涤浓缩：加入2l饱和碳酸氢钠溶液至经过(3)处理所得有机溶液中,对有机溶液进行洗涤，并除去水层，得到有机相，再加50l纯化水洗涤到水层中性为止，然后分层以获得有机溶液层，最后将有机溶液减压浓缩，得到黑褐色油状物；
(5)结晶：加入丁醇至经过(4)处理所得的油状物中搅拌溶解，获得他克莫司溶液,其中,丁醇与所述油状物的体积比为0.2:1，接着加入石油醚，其中,石油醚与油状物的体积比为10:1，并在室温下放置24h，结晶后过滤除去液体，得到他克莫司晶体；
(6)干燥：将获得的他克莫司晶体置于45℃减压干燥，得到他克莫司粗品1186.4g。
与他克莫司标准品比照，经高效液相色谱检测，他克莫司粗晶的纯度为91.8％，主杂子囊霉素及二氢他克莫司的含量4.1％，他克莫司粗晶中的他克莫司含量为67.8％，实际收率为85.1％。
本发明的优点在于：通过将他克莫司发酵液酸化以树脂富集水洗后，进行浸泡浓缩、吸附萃取、洗涤浓缩、洗涤结晶、洗晶干燥等步骤处理即可得到他克莫司粗晶。不需要经过柱层析等一系列繁杂工序，避免了有机溶剂的大量使用，保护了环境，还降低成本，仅仅是通过简单常规的实验操作就可得到他克莫司粗晶，制备工艺简单、操作方便、适合工业化生产。本发明极大提高了他克莫司的纯度和含量，同时该产品具有方便储存和运输的优点。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
1.一种他克莫司粗晶的制备方法，其特征在于：将筑波链霉菌发酵产生的他克莫司发酵液采用如下步骤进行操作：
(1)富集洗涤：将他克莫司发酵液酸化，树脂吸附；过滤除去上清液，接着用水冲洗菌丝体和树脂，去除菌丝体后得到富含他克莫司的树脂；
(2)浸泡浓缩：将步骤(1)处理所得的富含他克莫司的树脂用丙酮搅拌浸泡，得到他克莫司浸泡液，减压浓缩成浓缩物；
(3)萃取：加入有机溶剂至步骤(2)处理所得的浓缩物中,并搅拌，然后过滤或离心除去固体，再将所得溶液静置以使溶液分为水、有机溶液两层，并除去水层以获得有机溶液；
(4)洗涤浓缩：加入饱和碳酸氢钠溶液至经过步骤(3)处理所得有机溶液中，所述饱和碳酸氢钠溶液与有机溶液体积比为0.1～1:1，对有机溶液进行洗涤，并除去水层，得到有机相，继续用纯化水洗涤到水层中性为止，然后分层以获得有机溶液层，最后将有机溶液减压浓缩，得到黑褐色油状物；
(5)结晶：加入极性溶剂至经过步骤(4)处理所得的油状物中搅拌溶解，获得他克莫司溶液,其中,极性溶剂与所述油状物的体积比为0.1～0.5:1，接着加入非极性溶剂，其中，非极性溶剂与油状物的体积比为5～15:1，并在室温下放置20～30h，结晶后过滤除去液体，得到他克莫司晶体；
(6)干燥：将获得的他克莫司晶体置于40～50℃减压干燥，得到的产品与他克莫司标准品进行比照，确定为他克莫司粗品。
2.根据权利要求1所述的一种他克莫司粗晶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述树脂是指以苯乙烯-二乙烯基苯共聚体为骨架的非极性大孔树脂，树脂颗粒大小为60～120目，树脂用量为发酵液的1.0～3.5g/100ml(w/v)。
3.根据权利要求2所述的一种他克莫司粗晶的制备方法，其特征在于：所述非极性大孔树脂为hp20、hb16、d101或者hz816中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种他克莫司粗晶的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述有机溶剂为丁醇，有机溶剂与步骤(2)所述的浸泡液体积比0.05～0.5：1。
5.根据权利要求1所述的一种他克莫司粗晶的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述极性溶剂为丁醇，所述非极性溶剂为石油醚、己烷、环己烷中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的一种他克莫司粗晶的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括以下步骤：
(7)检测：采用高效液相色谱对步骤(6)中获得的他克莫司产品的纯度进行检测；所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：zorbaxsb-cn柱，色谱柱规格：5μm，4.6mm×250mm，流动相：体积比为乙腈：水：磷酸＝57:43:0.1的乙腈和水的混合溶液，检测波长：210nm，柱温：60℃，流速：1ml/min。
技术总结