本发明涉及一种芘类化合物ph值荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
ph在细胞的各种生理活动中扮演着重要的角色，如细胞增殖和凋亡、多药耐药、离子转运、内吞作用和肌肉收缩、囊泡运输、细胞极化等。细胞内ph的改变会影响细胞内的信号传递分子的运转，进而影响细胞内信号的传导。异常的细胞ph值与细胞的功能、生长和分裂的异常有关，同时在一些相关常见的疾病如癌症和阿尔兹海默综合征中也可以观察到。此外，不同器官的细胞具有不同的ph值，这也是它们维持各自正常生理活动所必需的。细胞功能障碍往往与各个器官中异常的ph值有关。所以，实时快速监测细胞内ph的变化对于了解细胞内许多生理功能的机制有着重要的作用。
在常见的ph测量方法中，与弱酸弱碱分布法、微电极法、核磁共振法等方法相比较，荧光光谱检测技术具有操作简单、响应快、信噪比高、灵敏度高以及大多数情况下对细胞无损伤等优点，因此得到了广泛的应用。
目前ph荧光探针的检测机理主要基于光致电子转移机理、分子内电荷转移机理、荧光共振能量转移机理、激基缔/复合物机理、激发态分子内质子转移机理及其他作用机理。
技术实现要素：
为了改善现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种芘类化合物ph值荧光探针及其制备方法和应用。本发明合成的芘类化合物ph值荧光探针的优点在于：对ph具有高效的选择性；对ph的选择具有很宽的响应范围(ph＝4.0-10.0)；所述芘类化合物能对ph实现比率型荧光检测；所述芘类化合物通过用纳米水凝胶负载，可自主渗透细胞膜进入到细胞内。
本发明提供了一种芘类化合物，其结构为如下通式(i)所示：
其中，r1、r2相同或不同，彼此独立地选自羟基、-nr4r5，r4、r5相同或不同，彼此独立地选自c1-10烷基；r3为芳基、任选被1-4个取代基取代的芳基，所述取代基为c1-10烷基、c1-10烷氧基。
根据本发明，所述的烷基代表碳原子数为1-10的直链或支链烷基，优选为碳原子数为1-6的直链或支链烷基，例如，甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。
根据本发明，所述的芳基指具有6-20个碳原子的单环或多环芳族基团，代表性的芳基包括苯基、萘基等。
根据本发明，所述r3可为烷基取代的芳基，例如烷基取代的苯基，具体可为被三个叔丁基取代的苯基。
优选地，所述芘类化合物的结构为如下式(ia)所示：
本发明还提供了通式(i)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
将式(ii)化合物、式(iii)化合物与br3(or6)2进行反应，得到式(i)化合物，其中r1、r2、r3的定义如上所述，r6为c1-6烷基。
根据本发明，上述反应中，包括，先将式(ii)化合物、式(iii)化合物中的基团r1和r2(如羟基、胺基)进行保护(例如使用硅烷基进行保护)，再进行反应，之后除去保护基。
例如，当r1和r2均为羟基时，可以采用如下具体制备方法，包括：
(a)将式(1)所示化合物与bbr3反应，得到式(2)所示化合物；
(b)将式(2)所示化合物与叔丁基二甲基氯硅烷反应，得到式(3)所示化合物；
(c)将式(3)所示化合物与br3(or6)2进行反应，其中，r3如上述所定义，r6为c1-6烷基，得到式(4)所示化合物；
(d)将式(4)所示化合物中的保护基除去，得到式(i)所示化合物；
根据本发明，所述步骤(a)中的溶剂选自二氯甲烷。
根据本发明，所述步骤(a)中的式(1)所示化合物与bbr3的摩尔比为1:3。
根据本发明，所述步骤(a)中的反应是在氩气保护条件下进行的。
根据本发明，所述步骤(a)中反应的温度为0-20℃，反应的时间为8-16h，例如为12h。
根据本发明，所述步骤(b)中的式(2)所示化合物与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1:1.5。
根据本发明，所述步骤(b)中加入咪唑作为催化剂，其用量为本领域常规选择。
根据本发明，所述步骤(c)中的反应是在氩气保护条件下进行的。
根据本发明，所述步骤(c)中反应的温度优选低于-40℃，例如-80～-70℃，例如为-78℃，反应的时间为8-12h。
根据本发明，所述步骤(d)中的溶剂选自四氢呋喃。
根据本发明，所述步骤(d)中，所述除去保护基的反应例如可以在四丁基氟化铵中进行反应。
本发明还提供上述芘类化合物的用途，其可作为ph值荧光探针，用于检测ph值。
根据本发明，所述ph值荧光探针用于细胞内ph成像，检测细胞内ph的变化过程。
根据本发明，所述ph值荧光探针用于检测水溶液中的ph值。
优选地，所述ph值荧光探针在水溶液中对ph的响应范围为4.0-10.0。
本发明还提供一种ph值荧光探针，其包括上述的芘类化合物。
根据本发明，所述芘类化合物负载在纳米水凝胶上。
本发明的有益效果：
1.本发明合成的芘类化合物，可以作为ph值荧光探针，用于检测体外和细胞内ph值，其发光能力随ph值的改变而变化。其原因是所述化合物中含有推拉电子体系，ph值的变化会引起推拉电子体系电荷的变化，从而使其荧光发生改变。
2.本发明合成的芘类化合物，对ph的选择具有专一性，荧光信号受阴离子、阳离子、氨基酸和ros的影响很小，检测结果可信度大大提高。
3.本发明合成的芘类化合物ph值荧光探针，对于ph的检测的范围为4.0-10.0。
4.本发明合成的芘类化合物ph值荧光探针，可自主进入到细胞中，用于细胞内ph成像。所述荧光探针进入细胞后，在荧光显微镜下可以观察到细胞内ph变化的过程。
5.本发明合成的芘类化合物ph值荧光探针具有高效专一性、光稳定性、响应范围宽等优点。
附图说明
图1为实施例4制备的ng-dptb-oh在不同ph值的磷酸缓冲溶液中，随ph值变化而变化的荧光光谱图。
图2为实施例4制备的ng-dptb-oh在不同ph值的磷酸缓冲溶液中，酸碱可逆荧光变化。
图3为实施例4制备的ng-dptb-oh探针干扰性检测的柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外，应理解，在阅读了本发明所公开的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
制备6-溴-1-羟基芘(1-a)和8-溴-1-羟基芘(1-b)
氩气保护下，向250毫升的圆底烧瓶中加入6-溴甲氧基芘和8-溴甲氧基芘10g(0.032mol)和无水二氯甲烷(100ml)。冰浴条件下滴加bbr3(4ml)，室温反应12小时。反应结束水洗，乙酸乙酯萃取，无水mgso4干燥，过滤，旋干，用乙酸乙酯/石油醚过硅胶色谱柱(乙酸乙酯/石油醚的体积比为1:20)，得到白色固体粉末(9.1g，95％)。
实施例2
制备6-溴-1-叔丁基二甲基硅氧基芘(2-a)和8-溴-1-叔丁基二甲基硅氧基芘(2-b)
将7g实施例1制备的6-溴-1-羟基芘和8-溴-1-羟基芘(0.023mol)、6.5ml叔丁基二甲基氯硅烷(0.035mol)和4g咪唑(0.059mol)溶于300mldmf中。室温反应2小时，旋干，用石油醚/二氯甲烷过硅胶柱色谱(石油醚/二氯甲烷的体积比为20:1)，得黄色固体粉末(9.7g，100％)。
实施例3
制备双(6-(二甲基叔丁基硅氧基)芘-1-基)(2,4,6-三异丙基苯基)硼(3-a)、双(8-(二甲基叔丁基硅氧基)芘-1-基)(2,4,6-三异丙基苯基)硼(3-b)和(6-(二甲基叔丁基硅氧基)芘-1-基)(8-(二甲基叔丁基硅氧基)芘-1-基)(2,4,6-三异丙基苯基)硼(3-c)
氩气保护下，将4g实施例2制备的6-溴-1-叔丁基二甲基硅氧基芘和8-溴-1-叔丁基二甲基硅氧基芘(9mmol)溶于50ml脱气乙醚，-78℃条件下加入1当量正丁基锂的乙烷(2.2m)溶液，缓慢恢复至室温，反应2小时，再次降温至-78℃，加入0.45当量的2,4,6-三异丙基苯基硼酸酯，缓慢恢复至室温，反应过夜，二氯甲烷稀释，水洗，硫酸镁干燥，用石油醚/乙酸乙酯过硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯的体积比为50:1)，得黄色固体粉末(5.1g，60％)。
实施例4
制备双(6-羟基芘-1-基)(2,4,6-三异丙基苯基)硼，即式(ia)所示结构的化合物
将2g实施例3制备的化合物(3-a)、(3-b)和(3-c)(4mmol)、以及3.6g四丁基氟化铵(13mmol)溶于100ml四氢呋喃溶剂中，室温反应2小时。反应结束用2m稀盐酸中和反应液，水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，旋干，用石油醚/二氯甲烷过硅胶色谱柱，得到黄色固体粉末(2.9g，99％)，即为式(ia)，记为dptb-oh。
结果分析：
hrms(esi)m/z[m-h] calc.:647.31159found:647.31242.1h-nmr(400mhz,dmso),δ:11.16(s,2h),8.66(d,2h,j＝9.2hz),8.49(d,2h,j＝8hz),8.42(d,2h,j＝9.2hz),8.19(d,10h,j＝7.6hz),7.15(s,2h),3.03(m,1h),2.90(m,2h),1.31(d,6h,j＝6.8hz),0.93(s,6h,j＝6hz),0.68(s,6h,j＝6hz)。
实施例5
将实施例4制备的dptb-oh用于ph检测：
用聚氨酯水凝胶负载dptb-oh，得到的产物记为ng-dptb-oh，其中，dptb-oh在聚氨酯水凝胶中的浓度为10-6m(mol/l)。配置不同ph值的磷酸缓冲溶液(ph值分别为：4,5,6,6.5,7,7.5,8,8.5,9,10)，最后测得不同ph值下ng-dptb-oh的荧光光谱，结果参见图1，图1中550nm处由上到下各曲线所代表的ph依次为4,5,6,6.5,7,7.5,8,8.5,9,10(图1中，ph为4和ph为5的条件下ng-dptb-oh的荧光光谱略有重合，但ph为4的曲线位于ph为5的曲线上方)；从图1中可以看出，随着ph值的增加，ng-dptb-oh的发射光谱发生红移，且在550nm处的发光强度逐渐减弱，发光颜色由绿色逐渐变为红色。此外ng-dptb-oh在ph值4.0和9.0之间，显示出很好的可逆性(见图2)。不仅如此，ng-dptb-oh对ph的选择具有专一性，荧光信号受阴离子、阳离子、氨基酸和ros(活性氧类，其中gsh为谷胱甘肽，cys为半胱氨酸)的影响很小，检测结果可信度大大提高，具体如图3所示，ng-dptb-oh在两个波长处的荧光强度比值(i550nm/i650nm)随着各离子或者分子的加入没有发生明显的变化。其中钙离子，铜离子，钠离子，锌离子和半胱氨酸对于该比值有较小的影响，是因为体外检测所使用的离子和分子浓度远高于细胞体内浓度，因此可以忽略不计。
实施例6
将实施例4制备的dptb-oh用于细胞内ph成像：
用聚氨酯水凝胶负载dptb-oh，得到的ng-dptb-oh的浓度为10-6m，通过在高浓度钾离子的培养基中添加离子载体尼日利亚菌素调节细胞内外的ph一致。最后测得绿色通道中细胞内的荧光强度随着ph增加而减弱；与此相反，红色通道中细胞内的荧光强度随着ph的增加而增强。此外，根据绿色和红色两个通道荧光强度的比率图片与伪色条对比可以明显看出ph值的变化。
其中，红色通道指的是收集的570-650nm波段的荧光强度，绿色通道指的是收集的470-550nm波段的荧光强度。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种芘类化合物，其结构为如下通式(i)所示：
其中，r1、r2相同或不同，彼此独立地选自羟基、-nr4r5，r4、r5相同或不同，彼此独立地选自c1-10烷基；r3为芳基、任选被1-4个取代基取代的芳基，所述取代基为c1-10烷基、c1-10烷氧基。
2.根据权利要求1所述的芘类化合物，其中，所述r3为烷基取代的芳基，例如烷基取代的苯基，具体可为被三个叔丁基取代的苯基。
3.根据权利要求1或2所述的芘类化合物，其中，所述芘类化合物的结构为如下式(ia)所示：
4.权利要求1-3任一项所述的芘类化合物的制备方法，包括如下步骤：
将式(ii)化合物、式(iii)化合物与br3(or6)2进行反应，得到式(i)化合物，其中r1、r2、r3的定义如权利要求1-3任一项所述，r6为c1-6烷基。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，上述反应中，包括，先将式(ii)化合物、式(iii)化合物中的基团r1和r2(如羟基、胺基)进行保护，再进行反应，之后除去保护基。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其中，当r1和r2均为羟基时，可以采用如下具体制备方法，包括：
(a)将式(1)所示化合物与bbr3反应，得到式(2)所示化合物；
(b)将式(2)所示化合物与叔丁基二甲基氯硅烷反应，得到式(3)所示化合物；
(c)将式(3)所示化合物与br3(or6)2进行反应，其中，r3如上述所定义，r6为c1-6烷基，得到式(4)所示化合物；
(d)将式(4)所示化合物中的保护基除去，得到式(i)所示化合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述步骤(a)中的溶剂选自二氯甲烷，所述步骤(a)中反应的温度为0-20℃，反应的时间为8-16h；
所述步骤(b)中加入咪唑作为催化剂；
所述步骤(c)中反应的温度优选低于-40℃，反应的时间为8-12h；
所述步骤(d)中的溶剂选自四氢呋喃；所述步骤(d)中，所述除去保护基的反应在四丁基氟化铵中进行反应。
8.权利要求1-3任一项所述的芘类化合物的用途，其可作为ph值荧光探针，用于检测ph值。
9.根据权利要求8所述的用途，所述ph值荧光探针用于细胞内ph成像，检测细胞内ph的变化过程。
优选地，所述ph值荧光探针用于检测水溶液中的ph值。
优选地，所述ph值荧光探针在水溶液中对ph的响应范围为4.0-10.0。
10.一种ph值荧光探针，其包括权利要求1-3任一项所述的芘类化合物。
优选地，所述芘类化合物负载在纳米水凝胶上。
技术总结