本发明属于有机分子探针在生物传感中应用技术领域，涉及一种用于特异性识别和高准确性检测微量血液中h2o2传感器。
背景技术：
h2o2作为生物体最丰富和最稳定的ros之一，在各种研究领域得到广泛关注，一方面，h2o2在宿主防御、免疫反应和病原体入侵等各种微生物学过程中发挥着重要作用。另一方面，h2o2的浓度异常会导致氧化应激发生，对蛋白质和dna造成严重损伤，进一步导致各种疾病的发生，如老年神经退行性疾病(阿尔兹海默病、帕金森病)及癌症等。因此，开发一种高灵敏、高选择性和高准确性检测h2o2水平的方法具有重要的生理学意义。
现有的血液中h2o2检测方法主要有荧光法、紫外-可见光谱法、电化学法等。荧光法虽然受到人们广泛的青睐，但对于血液检测由于自身颜色的影响，背景干扰较大；紫外可见光谱法灵敏度较低；电化学法是目前h2o2检测常用的方法之一，已从构建的经典的酶生物传感器发展为金属纳米材料及碳纳米材料催化检测h2o2的无酶电化学传感器。然而，这两种电化学传感器仍存在以下问题：(1)无酶传感器需要消耗贵金属，且选择性不高，易受其它活性物质影响；(2)酶传感器虽然具有高选择性但酶活性容易受环境影响且灵敏度不高，酶的种类也有限。
技术实现要素：
针对现有电化学传感器的不足，本发明的目的在于提高血液中h2o2检测的选择性和准确性。设计合成了一种h2o2特异性有机探针ba和内参比分子nb，并制备检测h2o2微电极cfme/au/ba nb，实现血液中h2o2高选择性、高准确度和高灵敏度检测。
本发明所述h2o2识别电化学探针ba和参比分子nb，其结构如下所示：
本发明所述cfme/au/ba nb的制备方法如下：
(1)h2o2识别电化学探针合成
在有机溶剂和缩合剂中，硫辛酸与氨基苯硼酸频哪酯进行脱水缩合反应得到h2o2识别电化学探针，反应1如下：
步骤(1)中，所述有机溶剂选择二氯甲烷、甲醇、乙醇、甲苯，优选二氯甲烷；
步骤(1)中所述缩合剂为edc/nhs，hatu/三乙胺，优选hatu/三乙胺；
步骤(1)中，所述反应温度为0～30℃，优选室温25℃；
步骤(1)中，所述硫辛酸与氨基苯硼酸频哪酯及缩合剂的摩尔比为1:1～1.5:1～2.5，优选1:1:1.5；
步骤(1)中所述反应时间为5～15h,优选室温下10h；
步骤(1)中所述反应在优选在n2保护条件下进行。
(2)内参比分子nb的合成
在有机溶剂和缩合剂中，硫辛酸与耐尔蓝进行脱水缩合反应，得到内参比分子nb。
其反应如下：
步骤(2)中，所述有机溶剂选择二氯甲烷、甲醇、乙醇、甲苯，优选二氯甲烷；
步骤(2)中，所述缩合剂为2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)/三乙胺、1-羟基苯并三唑(hobt)/三乙胺，优选hatu/三乙胺。
步骤(2)中，所述硫辛酸、耐尔蓝及缩合剂摩尔比为1：1～1.5:1～2.5，优选1:1:1.5；步骤(2)中，所述反应温度为0～30℃，优选25℃；
步骤(2)中所述反应时间为5～15h,优选室温下10h；
(3)h2o2检测微电极cfme/au/ba nb的制备
(3.1)制备cfme玻璃电极；
(3.2)将cfme电极浸入haucl4溶液中，通过恒电位沉积法，得到cfmf/au电极；
(3.3)将cfmf/au电极浸入ba nb混合的有机溶液中，通过au-s键共价修饰一定时间即得cfme/au/ba nb；
步骤(3.1)中所述cfmf玻璃电极，cfme尖端露出0.5-1mm，直径7μm；
步骤(3.2)中所述haucl4溶液浓度为5～40mm，优选20mm；
步骤(3.2)中所述恒电位沉积电位选择0～-0.3v，优选-0.2v；
步骤(3.2)中所述沉积时间为50～400s，优选200s；
步骤(3.3)中所述ba nb混合溶液nb与ba摩尔比为1:1～5，优选1:5；
步骤(3.3)中所述共价修饰时间为1～24h，优选12h；
步骤(3.3)中有机溶液选二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙醇或二甲基亚砜，优选甲醇；
步骤(3.3)中，所述修饰均在室温下进行；
本发明原理：ba的作用为h2o2特异性识别分子，在h2o2存在下ba与h2o2发生亲核氧化反应，生成苯酚结构具有电化学信号，是本发明实现h2o2高选择检测的基础。另外，所述的nb的作用作为内参比，在h2o2存在下，其电化学信号不发生变化，可以提高本发明制备cfme/au/ba nb对血液中h2o2检测的准确性。
本发明制备的h2o2检测微电极cfme/au/ba nb是一种比率型电化学传感器，将其用于血液中h2o2的检测，与agcl/ag电极、pt为对电极，组成三电极系统，通过方波伏安法(swv)测得电极在不同浓度h2o2下的峰电流(jba)，参比分子nb的电流值jnb，依据jba/jnb的值与h2o2浓度建立线性关系，得到线性范围和检出限。不仅可以实现血液中h2o2的高选择性检测，而且可以实现高准确性检测。
本发明的有益效果在于：(1)本发明以ba作为h2o2特异性识别电化学探针，明显提高了检测的选择性，以nb为内参比，进一步提高检测准确度，有效避免复杂环境或实际样品测定带来误差。(2)制得的新型无酶h2o2传感器，对血液中h2o2检测具有较宽的线性范围(0.5～400μm)，且灵敏度高(检测限＝0.1μm)，选择性好(加入其它ros或rns或rss，所引起峰电流密度比值变化不超过2.0％)，重现性好(5支电极测定相对标椎偏差不超过3.5％)，稳定性高(连续扫描50圈峰电流密度比值下降不超过3.8％)。(3)通过au-s键将ba分子和nb分子共价键合于电极，制备方法简单，快速。(4)微电极尖端尺寸500μm-1mm，可以实现微量样品的定性、定量测定，对于了解人体血液中h2o2对相关疾病作用研究具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1制备的ba的核磁共振表征图。
图2为实施例1制备的nb的核磁共振表征图。
图3为本发明cfme/au/ba nb对h2o2的swv响应电化学表征图，其中a-加入h2o2前，b-加入h2o2后。
图4为本发明cfme/au/ba nb对不同浓度h2o2(0.5-200μm)的swv响应及线性关系图。
图5为本发明cfme/au/ba nb在加入牛血清白蛋白前后swv响应，其中a-加入前，b-加入后。
图6为本发明5支不同cfme/au/ba nb对不同浓度h2o2(0.5-200μm)的swv响应。
图7为本发明cfme/au/ba nb对不同生物干扰物质的选择性实验柱状图。
图8为本发明cfme/au/ba nb对实际血样的swv响应，其中a-正常人，b-患者。
具体实施方式
结合以下具体实例和附图，对本发明作进一步的详细说明，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普通知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：制备微电极cfme/au/ba nb
(1)h2o2特异性识别分子探针的合成
将0.5m硫辛酸溶解在50ml二氯甲烷中，然后加入0.75m的hatu和0.5ml的三乙胺，室温搅拌10min，接着加入0.5m的氨基苯硼酸频哪酯，然后在真空、n2氛围下室温继续搅拌5h，过滤，旋蒸，去除溶剂，在层析硅胶柱下提纯，展开剂选用石油醚:乙酸乙酯＝5:1(体积比)，最终旋干得到淡黄色晶体，为ba分子。
(2)参比分子nb的合成
将0.5m硫辛酸溶解在50ml二氯甲烷中，然后加入0.75m的hatu和0.5ml的三乙胺，室温搅拌10min，接着加入0.5m耐尔蓝，然后抽真空，n2氛围下室温继续搅拌5h，旋干(石油醚:乙酸乙酯＝1:5～1:10)，纯化，最终得到蓝色固体产物。
(3)cfme/au/ba nb的制备
首先制备裸的cfme电极，并在乙醇中清洗，n2吹干，然后在-0.2v的(ag/agcl)恒电位下，将cfme电极浸入20mmhaucl4溶液中沉积200s，即得cfme/au。接着将cfme/au在乙醇中清洗，干燥，浸入含5mmba 1mmnb的甲醇溶液中12h后，取出，依次用乙醇、蒸馏水清洗，得到微电极cfme/au/ba nb。
实施例2：微电极cfme/au/ba nb对h2o2的测定
本发明制备的微电极cfme/au/ba nb为工作电极，以ag/agcl为参比电极，pt丝为对电极，测定在0.1mpbs溶液中加入50μmh2o2前后swv响应，电位窗口：-0.5-0.6v。结果如图3，当没有h2o2时，在-0.2v仅有一个氧化峰(a)，这归属于nb的电化学信号，当加入h2o2后，在0.38v左右出现一个新峰(b)，这主要是由于h2o2与ba反应生成酚结构而产生的电化学信号，其中nb作为内参比，ba作为h2o2特异性识别分子。并且随着h2o2浓度升高，在0.38v处的峰电流(jba)与nb所产生的电流信号(jnb)的比值与h2o2浓度(0.5～400μm)的对数之间的存在良好的线性关系，相应的线性方程为：jba/jnb＝0.422 0.501lgc(h2o2)(μm)，检测限为0.1μm(图4)。
实施例3：h2o2检测微电极的抗污能力评估
以本发明制备的微电极cfme/au/ba nb为工作电极，以agcl/ag为参比电极，pt丝为对电极，采用swv记录在电位窗口-0.5～0.6v下，0.1mpbs溶液含50μmh2o2加入5mgml-1牛血清白蛋白(bsa)前后swv响应，结果：通过计算发现在加入bsa前后峰电流比值jba/jnb基本不变(图5)，说明本发明制备的h2o2检测微电极cfme/au/ba nb在引入内参比后可以消除蛋白污染引起的误差，可以应用于复杂血液样品的检测。
实施例4：重现性的测定
采用如实施例1中微电极cfme/au/ba nb制备方法，分别修饰5支电极，以其中任一支电极为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，pt丝电极为对电极，采用swv法记录在不同浓度h2o2下的swv曲线。依据h2o2引起ba峰电流变化与nb峰电流比值与h2o2浓度建立线性关系，采用同样的方法记录其他4支电极对h2o2响应的线性关系(图6)，通过对比发现，5支电极的灵敏度相对偏差不超过0.5％，说明本发明制备的h2o2检测微电极具有较好的重现性。
实施例5：抗干扰实验
利用chi660e电化学工作站对本发明制备的检测h2o2微电极cfme/au/ba nb进行干扰测定。如图7所示，向50μmh2o2溶液中加入其它ros或rns或rss，所引起峰电流比值变化不超过2.0％，说明本发明制备的h2o2检测微电极对h2o2检测具有较高的选择性。
实施例6：血液样品中h2o2的测定
取正常人和患者的血液样品，无需处理，分别直接取100μl，将h2o2检测微电极cfme/au/ba nb作为工作电极，ag/agcl作为参比电极，pt丝作为对电极，直接植入血液，然后采用swv法在-0.5～0.6v电位窗口下测定(图8)，得到h2o2引起峰电流变化和nb所产生电流值，得比值jba/jnb，根据图4中的线性关系，计算实际血样中h2o2的浓度。
1.一种h2o2特异性识别分子ba，其特征在于，具有如下结构式：
2.合成如权利要求1所述的h2o2特异性识别分子ba的方法，其特征在于，在有机溶剂中，加入缩合剂，硫辛酸与氨基苯硼酸哪酯进行脱水缩合反应，得到目标物；
所用有机溶剂为二氯甲烷，甲醇，乙醇，甲苯；所述缩合剂为2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)/三乙胺或1-羟基苯并三唑(hobt)/三乙胺。
3.一种内参比分子nb，其特征在于，具有如下结构式：
4.合成如权利要求3所述内参比分子nb的方法，其特征在于，在有机溶剂中，加入缩合剂，硫辛酸与耐尔蓝进行脱水缩合反应，得到内参比分子nb；
所用有机溶剂为二氯甲烷、甲醇、乙醇或甲苯；所述缩合剂为2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)/三乙胺或1-羟基苯并三唑(hobt)/三乙胺。
5.检测h2o2微电极cfme/au/ba nb，其特征在于，通过如下如下方法制备而成：
(1)将cfme电极浸入haucl4溶液中，采用恒电位沉积法，得到cfme/au电极；
(2)将步骤(1)制得的cfme/au电极浸泡于h2o2特异性识别分子ba和内参比分子nb混合的有机溶液中，得到h2o2检测微电极cfme/au/ba nb。
6.如权利要求5所述的检测h2o2微电极cfme/au/ba nb，其特征在于，所述ba nb混合溶液中nb与ba摩尔比为1:1～5；所述有机溶液选二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙醇或二甲基亚砜。
7.如权利要求5或6所述的检测h2o2微电极cfme/au/ba nb的应用，其特征在于，将其用于体外血液中h2o2的定性或定量测定。
技术总结