本发明具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法和纯化方法。
背景技术：
β-烟酰胺单核苷酸是一种自然存在的生物活性核苷酸，能在人体中合成，也可由日常蔬菜和肉类中摄入，与人的免疫、代谢息息相关。
β-烟酰胺单核苷酸在体内的功能主要通过烟酰胺腺嘌呤双核苷酸来体现，它广泛分布在所有细胞中，参与上千种生物催化反应。近年来，烟酰胺腺嘌呤双核苷酸的抗衰老功效引起了科学界的广泛关注，大量动物实验表明提升烟酰胺腺嘌呤双核苷酸含量后，其衰老器官可恢复到年轻时的状态，而补充β-烟酰胺单核苷酸正是提高烟酰胺腺嘌呤双核苷酸的最佳手段。目前，日本庆应义塾大学与美国华盛顿大学展开合作，开始进行β-烟酰胺单核苷酸的临床研究，以考察该物质对人体的有效性和安全性。但由于β-烟酰胺单核苷酸的产能较低，生产成本高，限制了其实际应用价格居高不下。
目前，β-烟酰胺单核苷酸的合成方法主要包括两种途径，即生物合成和化学合成。生物合成β-烟酰胺单核苷酸时，以烟酰胺和5’-磷酸核糖基-1’-焦磷酸作为底物，在烟酰胺磷酸核糖转移酶的作用下催化制备β-烟酰胺单核苷酸。这种方法酶的价格较高，而且来源有限，因此采用该方法制备β-烟酰胺单核苷酸时，产能较低，生产成本较高。化学合成一般选择具有呋喃糖结构的物质为底物，经过多步官能团转换得到β-烟酰胺单核苷酸分子骨架，再经树脂柱洗脱得到β-烟酰胺单核苷酸水溶液产品。该方法合成路线选择余地较大，原料来源相对广泛，但是步骤繁多，产率不高。尤其是磷酸化步骤中，成分过于复杂，而且存在竞争反应，不利于后续提纯，产品纯度仍有很大提升空间。专利cn107613990a采用官能团保护与脱保护的方式提升磷酸化反应的选择性，但此方法增加了工艺步骤，也增加了成本，原子经济性不高。因此本领域亟需开发一种产率高，易于纯化，反应原料廉价易得，制备工艺简单的β-烟酰胺单核苷酸制备方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中化学合成β-烟酰胺单核苷酸的方法存在步骤繁多，副产物多，产率低，提纯困难等缺陷而提供一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法和纯化方法。本发明中β-烟酰胺单核苷酸的制备方法可有效提高总产率和纯度，反应原料廉价易得，制备工艺简单，适用于工业化生产。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
本发明提供一种呋喃糖底物中间物料的纯化方法，其具体包括如下步骤：
(1)采用水相和油相对原料呋喃糖底物中间物料进行萃取，收集包含式ⅰ所示化合物的水相；
(2)采用磷酸化助剂对步骤(1)所述包含式ⅰ所示化合物的水相进行萃取，收集包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相，得纯化后的呋喃糖底物中间物料；
其中，所述原料呋喃糖底物中间物料为包含式ⅰ所示化合物的混合物料，其中，r1为乙酰基、溴基、烟酰胺基、烟酸乙酯基和烟酸丁酯基中的一种或多种；
所述式ⅰ所示化合物中，所述r1较佳地为烟酰胺基、烟酸乙酯基或烟酸丁酯基。
步骤(1)中，所述原料呋喃糖底物中间物料可为本领域常规磷酸化反应制备β-烟酰胺单核苷酸的固态原料。
较佳地，所述原料呋喃糖底物中间物料通过以下任意方式制得：
方式ⅰ：烟酸酯类化合物和四乙酰核糖依次经缩合反应、氨解反应即可；
方式ⅱ：烟酸酯类化合物和四乙酰核糖依次经缩合反应、脱乙酰化反应即可。
方式ⅰ或方式ⅱ中，所述烟酸酯类化合物可为本领域常规该类反应常规使用的烟酸酯类化合物，较佳地为烟酸乙酯、烟酸丁酯和烟酰胺中的一种或多种。
方式ⅰ或方式ⅱ中，所述缩合反应的条件和方法可为本领域该类反应常规的条件和方法。一般在溶剂和催化剂存在的条件下进行所述缩合反应。经所述缩合反应可制得式ⅱ所示化合物，其中，r2为c2～c4烷基，
方案ⅰ中，所述氨解反应的条件和方法可为本领域该类反应常规的条件和方法。
方案ⅱ中，所述脱乙酰化反应的条件和方法可为本领域该类反应常规的条件和方法。
在本发明优选实施例中，所述原料呋喃糖底物中间物料通过发明专利申请cn102876759a中的步骤二制得物料进行除溶剂即可获得，或通过发明专利申请cn102876759a中的步骤b制得物料进行除溶剂即可获得。
根据本领域常识可知，所述原料呋喃糖底物中间物料还包括杂质，例如烟酸乙酯、四乙酰核糖、三氟乙酸、氨和甲醇中的一种或多种。
步骤(1)中，所述水相与所述原料呋喃糖底物中间物料的质量比可为(8～15)：1，较佳地为(10～12)：1。
步骤(1)中，所述油相可为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯中的一种或多种，较佳地为二氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯中的一种或多种。
步骤(1)中，所述油相与所述原料呋喃糖底物中间物料的质量比可为(5～10)：1，较佳地为(6～8)：1，例如7：1。
步骤(1)中，所述萃取的操作和条件可为本领域常规，一般包括混合和静置处理。所述萃取的过程中，所述式ⅰ所示化合物进入油相，少量未反应原料、氨、甲醇进入水相。
其中，所述混合的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为10～30min，更佳地为12～15min。
步骤(2)中，所述磷酸化助剂可为本领域该类操作常规使用的磷酸化助剂，较佳地，所述磷酸化助剂为po(or3)3，其中r3为c1～c5烷基，更佳地，所述磷酸化助剂为磷酸三甲酯和/或磷酸三乙酯。
步骤(2)中，所述萃取的操作和条件可为本领域常规，一般包括混合和静置处理。所述萃取的过程中，所述式ⅰ所示化合物进入所述磷酸化助剂相。
其中，所述混合的时间可为本领域该类操作常规时间，较佳地为10-30min，例如12min。
较佳地，本发明中步骤(2)重复进行2～4次，合并所述包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相，更佳地，步骤(2)重复进行2次，合并所述包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相。
本发明还提供一种由上述纯化方法制得的一种纯化后的呋喃糖底物中间物料。
本发明还提供一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其具体包括如下步骤：
方案ⅰ：当原料呋喃糖底物中间物料的制备过程中包括氨解反应时，将所述纯化后的呋喃糖底物中间物料与三氯氧磷进行磷酸化反应，制得β-烟酰胺单核苷酸；
方案ⅱ：当原料呋喃糖底物中间物料的制备过程中不包括氨解反应时，将所述纯化后的呋喃糖底物中间物料与三氯氧磷依次进行磷酸化反应、氨解反应，制得β-烟酰胺单核苷酸。
方案ⅰ或方案ⅱ中，所述三氯氧磷与所述纯化后的呋喃糖底物中间物料的质量比可为本领域常规的质量比，较佳地为(1～2)：1，更佳地为(1.1～1.5)：1，例如1.3：1。
方案ⅰ或方案ⅱ中，所述磷酸化反应的时间可为本领域该类反应常规时间，较佳地为5～20h，更佳地为8～10h。
方案ⅰ或方案ⅱ中，所述磷酸化反应的温度可为本领域该类反应常规温度，较佳地为-20℃～-5℃，更佳地为-15℃～-10℃。
方案ⅱ中，所述氨解反应的条件和方法可为本领域该类反应常规的条件和方法。
本发明的积极进步效果在于：本发明的制备工艺主要在于β-烟酰胺单核苷酸制备过程中，磷酸化反应原料的纯化步骤，通过纯化步骤不仅避免反应成分过于复杂，也提高磷酸化反应的选择性和β-烟酰胺单核苷酸的总收率。采用的制备工艺操作简单，不涉及复杂的保护和脱保护过程，所使用的溶剂皆可回收利用，节约成本。经过简单的树脂洗脱分离即可制得易于纯化的终产品，适用于工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1制得β-烟酰胺单核苷酸的红外光谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明实施例、对比例中所用原料来源如下：原料呋喃糖底物中间物料由浙江邦成化工有限公司提供。
所述原料呋喃糖底物中间物料的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)在2l玻璃反应器中加入800ml二氯甲烷和80g四乙酰核糖，启动搅拌。开启夹套循环水，待内温达到12℃后，用恒压滴液漏斗加入5.6g三氟甲磺酸三甲基硅酯，20分钟滴完。加入6g烟酰乙酯，将循环水温度升温，当温度达到49℃后保温反应4h。使用hplc监控烟酸乙酯剩余小于5％后，在-0.09mpa真空度下蒸干溶剂。
步骤(2)再向体系中倒入预冷至10℃的甲醇1l，启动搅拌使物料溶解，开启反应釜循环水，待内温度达到-5℃后，向反应液中通入氨气，氨气通入量达到0.1kg，关闭氮气阀门。将反应釜升温至0℃，保温反应20h。使用hplc监控反应产物大于70％后，停止反应，经过除溶剂处理，制得原料呋喃糖底物中间物料。
下述实施例中，采用hplc测试粗产品中β-烟酰胺单核苷酸的含量，具体采用waters2695高效液相色谱仪，采用c-18柱；流动相为流动相a为含有质量分数为0.25％磷酸二氢钠和0.2‰磷酸的水溶液；流动相b为甲醇，流动相a和流动相b的体积比为1：1。
实施例1
步骤1：采用上述原料呋喃糖底物中间物料的制备方法制得原料呋喃糖底物中间物料；原料呋喃糖底物中间物料的制备方法的步骤(2)中，除溶剂处理在旋转蒸发仪中进行，并在真空度为-0.09mpa，温度为10℃的条件下进行除溶剂处理，并回收溶剂。
步骤2：将原料呋喃糖底物中间物料转入2l烧瓶中，倒入380g水和220g二氯甲烷中，在搅拌的条件下进行混合，混合的时间为12min，混合后转入2l分液漏斗中，静置分层，收集包含式ⅰ所示化合物的油相；水与原料呋喃糖底物中间物料的质量比为8：1；二氯甲烷与原料呋喃糖底物中间物料的质量比为6：1。
步骤3：将步骤2收集的包含式ⅰ所示化合物的油相与150g磷酸三乙酯混合，混合10min后静置分液，收集包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相，即收集纯化后的呋喃糖底物中间物料，重复三次。
步骤4：将步骤3收集的包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相转入1l三口烧瓶中，调整体系温度为-15℃，滴加180g三氯氧磷，滴加完毕后在-15℃的条件下反应10h，制得β-烟酰胺单核苷酸，所述三氯氧磷与所述纯化后的呋喃糖底物中间物料的质量比为1.1：1；取0.5ml反应液，用1-2ml冰水稀释，经0.22～0.45μm滤膜过滤，用hplc计算产率。
实施例2
步骤1：采用上述原料呋喃糖底物中间物料的制备方法制得原料呋喃糖底物中间物料；原料呋喃糖底物中间物料的制备方法的步骤(2)中，除溶剂处理在旋转蒸发仪中进行，并在真空度为-0.085mpa，温度为15℃的条件下进行除溶剂处理，并回收溶剂。
步骤2；将原料呋喃糖底物中间物料转入1l烧瓶中，倒入140g水和100g乙酸乙酯中，在搅拌的条件下进行混合，混合的时间为10min，混合后转入1l分液漏斗中，静置分层，收集包含式ⅰ所示化合物的油相；水与原料呋喃糖底物中间物料的质量比为10：1；二氯甲烷与原料呋喃糖底物中间物料的质量比为7：1。
步骤3：将步骤2收集的包含式ⅰ所示化合物的油相与70g磷酸三甲酯混合，混合10min后静置分液，收集包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相，即收集纯化后的呋喃糖底物中间物料，重复三次。
步骤4；将步骤3收集的包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相转入500ml三口烧瓶中，调整体系温度为-10℃，滴加80g三氯氧磷，滴加完毕后在-10℃的条件下反应8h，制得β-烟酰胺单核苷酸，所述三氯氧磷与所述纯化后的呋喃糖底物中间物料的质量比为1.3：1；取0.5ml反应液，用1-2ml冰水稀释，经0.22～0.45μm滤膜过滤，取样用hplc计算产率。
实施例3
步骤1：采用上述原料呋喃糖底物中间物料的制备方法制得原料呋喃糖底物中间物料；原料呋喃糖底物中间物料的制备方法的步骤(2)中，除溶剂处理在旋转蒸发仪中进行，并在真空度为-0.095mpa，温度为25℃的条件下进行除溶剂处理，并回收溶剂。
步骤2：将原料呋喃糖底物中间物料转入2l烧瓶中，倒入500g水和350g甲苯中，在搅拌的条件下进行混合，混合的时间为15min，混合后转入2l分液漏斗中，静置分层，收集包含式ⅰ所示化合物的油相；水与原料呋喃糖底物中间物料的质量比为12：1；二氯甲烷与原料呋喃糖底物中间物料的质量比为8：1。
步骤3：将步骤2收集包含式ⅰ所示化合物的油相与200g磷酸三乙酯混合，混合12min后静置分液，收集包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相，即收集纯化后的呋喃糖底物中间物料，重复三次。
步骤4：将步骤3收集的包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相转入2l三口烧瓶中，调整体系温度为-10℃，滴加240g三氯氧磷，滴加完毕后在-10℃的条件下反应10h，制得β-烟酰胺单核苷酸，所述三氯氧磷与所述纯化后的呋喃糖底物中间物料的质量比为1.5：1；取0.5ml反应液，用1-2ml冰水稀释，经0.22～0.45μm滤膜过滤，取样用hplc计算产率。
对比例1(与实施例1相比区别在于不进行纯化处理)
采用上述原料呋喃糖底物中间物料的制备方法制得原料呋喃糖底物中间物料；原料呋喃糖底物中间物料的制备方法的步骤(2)中，除溶剂处理在旋转蒸发仪中进行，并在真空度为-0.09mpa，温度为10℃的条件下进行除溶剂处理，并回收溶剂。
用三角漏斗向制得的原料呋喃糖底物中间物料中加入磷酸三乙酯150g，开启搅拌。混合均匀后，开启循环水，调整体系温度为-15℃，滴加180g三氯氧磷，滴加完毕后在-15℃的条件下反应10h，制得β-烟酰胺单核苷酸，所述三氯氧磷与所述原料呋喃糖底物中间物料的质量比为1.1：1；取0.5ml反应液，用1-2ml冰水稀释，经0.22～0.45μm滤膜过滤，用hplc计算产率。
效果实施例1
利用hplc分别测定实施例1-3和对比例1制得的粗产品中β-烟酰胺单核苷酸的含量，并计算β-烟酰胺单核苷酸的总收率，见表1。利用傅里叶红外光谱仪测试实施例1制得β-烟酰胺单核苷酸的红外光谱，见图1。利用核磁共振波谱仪测试β-烟酰胺单核苷酸的核磁数据，具体为：1hnmr(d2o，600mhz):δ9.58(s，1h)，9.33(d，1h，j＝6.5hz)，8.97(d，1h，j＝7.8hz)，8.30(t，1h，j＝6.2hz)，6.20(d，1h，j＝5.4hz)，4.52(t，1h，j＝2.5hz)，4.41(t，1h，j＝5.1hz)，4.36-4.32(m，1h)，4.25-4.20(m，1h)，4.03-4.09(m，1h)。
表1
从上述实施例和对比例的效果数据可知，本发明提供的β-烟酰胺单核苷酸制备工艺能在不改变反应路线和反应条件的基础上，通过磷酸化前的纯化步骤，提高了终产品中β-烟酰胺单核苷酸的纯度，也提升了β-烟酰胺单核苷酸整个制备过程中的产率，对设备要求极低，溶剂可回收利用，节约生产成本，使产品的价格和品质更具有竞争性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例。在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。对于本领域技术人员而言，任何依据本发明的反应原理对以上实施例所作的用量替换、投料方式变化、简单修改和修饰都在本发明的技术范围之中。
1.一种呋喃糖底物中间物料的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用水相和油相对原料呋喃糖底物中间物料进行萃取，收集包含式ⅰ所示化合物的水相；
(2)采用磷酸化助剂对步骤(1)所述包含式ⅰ所示化合物的水相进行萃取，收集包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相，得纯化后的呋喃糖底物中间物料；
其中，所述原料呋喃糖底物中间物料为包含式ⅰ所示化合物的混合物料，其中，r1为乙酰基、溴基、烟酰胺基、烟酸乙酯基和烟酸丁酯基中的一种或多种；
2.如权利要求1所述的呋喃糖底物中间物料的纯化方法，其特征在于，所述式ⅰ所示化合物中，所述r1为烟酰胺基、烟酸乙酯基或烟酸丁酯基。
3.如权利要求1所述的呋喃糖底物中间物料的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述原料呋喃糖底物中间物料为磷酸化反应制备β-烟酰胺单核苷酸的固态原料；
较佳地，所述原料呋喃糖底物中间物料通过以下任意方式制得：
方式ⅰ：烟酸酯类化合物和四乙酰核糖依次经缩合反应、氨解反应即可；
方式ⅱ：烟酸酯类化合物和四乙酰核糖依次经缩合反应、脱乙酰化反应即可。
4.如权利要求3所述的呋喃糖底物中间物料的纯化方法，其特征在于，方式ⅰ或方式ⅱ中，所述烟酸酯类化合物为烟酸乙酯、烟酸丁酯和烟酰胺中的一种或多种；
和/或，方式ⅰ或方式ⅱ中，经所述缩合反应制得式ⅱ所示化合物，其中，r2为c2～c4烷基，
5.如权利要求1所述的呋喃糖底物中间物料的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水相与所述原料呋喃糖底物中间物料的质量比为(8～15)：1，较佳地为(10～12)：1；
和/或，步骤(1)中，所述油相为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯中的一种或多种，较佳地为二氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯中的一种或多种；
和/或，步骤(1)中，所述油相与所述原料呋喃糖底物中间物料的质量比为(5～10)：1，较佳地为(6～8)：1，更佳地为7：1；
和/或，步骤(1)中，所述萃取包括混合和静置处理；所述混合的时间较佳地为10-30min，更佳地为12～15min。
6.如权利要求1所述的呋喃糖底物中间物料的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述磷酸化助剂为po(or3)3，其中r3为c1～c5烷基，较佳地所述磷酸化助剂为磷酸三甲酯和/或磷酸三乙酯；
和/或，步骤(2)中，所述萃取包括混合和静置处理；所述混合的时间较佳地为10-30min，更佳地为12min。
7.如权利要求1～6中任一项所述的呋喃糖底物中间物料的纯化方法，其特征在于，步骤(2)重复进行2～4次，合并所述包含式ⅰ所示化合物的磷酸化助剂相。
8.一种如权利要求1～7中任一项所述的呋喃糖底物中间物料的纯化方法制得的纯化后的呋喃糖底物中间物料。
9.一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，其以如权利要求8所述的纯化后的呋喃糖底物中间物料为原料，包括如下步骤：
方案ⅰ：当原料呋喃糖底物中间物料的制备过程中包括氨解反应时，将所述纯化后的呋喃糖底物中间物料与三氯氧磷进行磷酸化反应，制得β-烟酰胺单核苷酸；
方案ⅱ：当原料呋喃糖底物中间物料的制备过程中不包括氨解反应时，所述纯化后的呋喃糖底物中间物料与三氯氧磷依次进行磷酸化反应、氨解反应，制得β-烟酰胺单核苷酸。
10.如权利要求9所述的β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，方案ⅰ或方案ⅱ中，所述三氯氧磷与所述纯化后的呋喃糖底物中间物料的质量比为(1～2)：1，较佳地为(1.1～1.5)：1，更佳地为1.3：1；
和/或，方案ⅰ或方案ⅱ中，所述磷酸化反应的时间为5～20h，较佳地为8～10h；
和/或，方案ⅰ或方案ⅱ中，所述磷酸化反应的温度为-20℃～-5℃，较佳地为-15℃～-10℃。
技术总结