本发明属于医药研究领域，具体涉及异甘草苷衍生物及其在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用。
背景技术：
脑卒中俗称“中风”，是由向大脑输送血液的血管疾病引起的一种急性疾病。缺血性脑卒中系由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现(参见文献1：冯加纯,朱宇,饶明利,等.东菱克栓酶对全脑缺血再灌注损伤脑保护作用的实验研究[j].中风与神经疾病杂志,2009,13(1):9-10.)。
脑卒中是严重危害人类健康和生命安全的常见的难治性心脑血管类疾病，与肿瘤疾病、呼吸道疾病并称为现今人类死亡率最高的三大疾病之一，也是三大疾病中发展最快、恢复最慢、死亡最多、致残最重的病种。缺血性脑卒中患者约占脑卒中患者总数的75-85％，是脑卒中“四高”特点的罪魁祸首。目前，丁苯酞(2002年，中国上市)和依达拉奉(1986年，日本首上市)已成为靶向缺血性脑卒中治疗有效且广泛应用于临床的药物，但这两个药物被报道在长期服用的情况下均表现肝毒性和肾毒(参见文献2：段云霞，陈小玉，张梓倩，等.缺血性脑卒中治疗药物研究进展[j].中央民族大学学报(自然科学版)，2012，21(2):65－70.)。临床上迫切需要新型的更加安全有效的缺血性脑卒中治疗药物。
随着我们对缺血性脑卒中及其导致脑梗死后血管新生现象的不断认识，了解到通过药物促进血管形成以增加半暗带区的血供，即治疗性血管新生，在促进脑缺血后局部血液循环、保护神经元和改善神经功能等方面起着重要作用，为缺血性脑卒中造成的脑梗死治疗提供了一个崭新的途径。
异甘草苷是甘草中一种重要的黄酮类化合物，具有抗溃疡、抗艾滋病病毒的作用(参见文献3：付玉杰,祖元刚,赵春建,等.rp-hplc法测定甘草中甘草苷和异甘草苷的含量[j].中草药,2004,35(5):576-577.)。本发明通过斑马鱼动物实验研究，探索出异甘草苷衍生物在治疗缺血性脑卒中方面表现出预料不到的药理作用。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种式(i)的异甘草苷衍生物、其药学可接受的盐或其异构体，其特征在于：
r选自c1-6烷基、c3-10环烷基、c1-6烷基甲酰基、c3-10环烷基甲酰基、c6-10芳基甲酰基或3-c6-10芳基丙烯酰基。
其异构体可选为：
更具体的，本发明提供一种异甘草苷衍生物、其药学可接受的盐或其异构体，选自：
本发明还涉及上述异甘草苷衍生物的制备方法，其特征在于异甘草苷衍生物由异甘草苷通过烷基化或酰基化反应制得。
优选的，反应可选的进一步加入碱性催化剂。
其中，烷基化或酰基化试剂与异甘草苷摩尔比为1:1～10:1，优选1.05:1～6:1，优选1.1:1～4:1，更优选1.2:1～2:1。
碱性催化剂与异甘草苷摩尔比为1:1～10:1，优选1.05:1～6:1，优选1.1:1～4:1，更优选1.2:1～2:1。
其中，碱性催化剂为常用的烷基化或酰基化碱性催化剂，可为无机碱或者有机碱，更优选的为无水碳酸钾、无水碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、三乙胺或n,n-二甲基苯胺中的一种或多种。
本发明还涉及上述异甘草苷衍生物或其药学可接受的盐在制备预防或治疗缺血性疾病药物中的应用，所述疾病包括但不限于心血管疾病、糖尿病致严重肢体缺血、缺血性脑卒中等。
本发明还涉及一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的上述异甘草苷衍生物或其异构体作为活性成分，和一种或多种药用载体物质和/或稀释剂。
本发明还涉及一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物是采用常规或特殊制剂工艺制备而成的口服或非口服途径方式给药的制剂。
本发明还涉及一种预防或治疗缺血性脑卒中或糖尿病致严重肢体缺血疾病的方法，包括向疾病患者给予上述任一项所述的药物组合物。
本发明运用模式脊椎动物斑马鱼进行动物体内实验，发现本发明的化合物，优选的ag-1，ag-2及ag-3三种异甘草苷衍生物均对斑马鱼体节间血管生长有促进作用；并在建立斑马鱼缺血性脑卒中模型和大鼠mcao模型基础上，发现上述三种异甘草苷衍生物可显著减轻脑缺血再灌后动物急性脑损伤。
本发明的化合物，对血管生成有良好的促进作用，促进血管生成对许多疾病的治疗是十分有益的。如对于骨折及创伤病人，促进其创伤局部的血管生成，可以改善局部血液供应，加快愈合；对于心肌梗死病人，梗死部位新生血管的生成对恢复受损心肌组织血液供应有重要作用。对于对缺血性疾病如糖尿病致严重肢体缺血等也有重要作用。
发明的详细说明
除非有相反陈述，下列用在说明书和权利要求中的术语具有下述含义。
“烷基”指饱和的脂族烃基团，包括1至6个碳原子的直链或支链基团，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等；更优选的是含有1至4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。
“环烷基”指3至10元全碳单环，包含不局限为环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷等。
“甲酰基”表示-c＝o-
“芳基”表示6至10个碳原子的全碳单环或稠合多环基团。包括苯或萘等。
“药用组合物”指的是在此描述的一种或多种化合物、其药学可接受的盐或其异构体的化学成分，例如药用载体物质和/或稀释剂的混合物。药用组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
“药用载体”指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1是实施例1中48hpf荧光显微镜下观察不同浓度ag-1和isn给药后斑马鱼胚胎体节间血管发育情况。
图2是实施例1中48hpf荧光显微镜下观察不同浓度ag-2和isn给药后斑马鱼胚胎体节间血管发育情况。
图3是实施例1中48hpf荧光显微镜下观察不同浓度ag-3和isn给药后斑马鱼胚胎体节间血管发育情况。
图4是实施例1中48hpf荧光显微镜下观察低浓度ag-3和isn给药后斑马鱼胚胎体节间血管发育情况。
图5是实施例1中不同浓度ag-1和isn给药后斑马鱼胚胎体节间血管发育抑制率统计图。
图6是实施例1中不同浓度ag-2和isn给药后斑马鱼胚胎体节间血管发育抑制率统计图。
图7是实施例1中不同浓度ag-3和isn给药后斑马鱼胚胎体节间血管发育抑制率统计图。
图8是实施例1中低浓度ag-3和isn给药后斑马鱼胚胎体节间血管发育抑制率统计图。
图9是实施例2中斑马鱼脑卒中模型对照组、造模组及给药组的斑马鱼脑组织切片tcc染色拍照图。
图10是实施例2中斑马鱼脑卒中模型对照组、造模组及给药组的斑马鱼脑组织切片中脑梗死面积比例统计图。
图11是实施例3中三种异甘草苷衍生物对大鼠神经缺陷症状的影响。
图12是实施例3中三种异甘草苷衍生物对大鼠脑梗塞面积的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。所描述的实施例及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：化合物ag-1的制备
将异甘草苷(100mg，0.239mmol)，无水碳酸钾(66.06mg，0.478mmol)加入到50ml单口圆底烧瓶中，加入10mldmf，室温下搅拌1小时后加入碘甲烷(37mg，0.263mmol)，5小时后用50ml乙酸乙酯稀释反应体系，用饱和食盐水洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干，柱层析得到目标ag-1化合物80mg，产率77.4％。
1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ(ppm)δ＝13.58(s,1h),8.30(d,j＝9.0hz,1h),7.97-7.87(m,2h),7.82(d,j＝15.6hz,1h),7.47(d,j＝8.4hz,1h),7.11(d,j＝8.4hz,2h),6.58-6.55(m,1h),6.55-6.48(m,1h),5.40(d,j＝6.0hz,1h),5.24-5.09(m,2h),4.99(d,j＝7.2hz,1h),4.69-4.58(m,1h),3.83(s,3h),3.71-3.65(m,1h),3.51-3.44(m,2h),3.21-3.14(m,2h).
实施例2：化合物ag-2的制备
将异甘草苷(100mg，0.239mmol)，无水碳酸钾(66.06mg，0.478mmol)加入到50ml单口圆底烧瓶中，加入8mldmf和1mlh2o，室温下搅拌1小时后加入肉桂酰氯(43.8mg，0.263mmol)，5小时后将反应体系倒入30ml水中，有大量黄色固体析出，抽滤，滤渣干燥后柱层析得目标ag-2化合物30mg，产率23％。
1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ(ppm)δ＝13.03(s,1h),8.44-8.36(m,1h),8.07-7.73(m,7h),7.48(s,3h),7.17-7.07(m,2h),6.96-6.84(m,3h),5.39(s,1h),5.22-4.94(m,3h),4.62(s,1h),3.74-3.66(m,1h),3.53-3.13(m,5h)。
实施例3：化合物ag-3的制备
将异甘草苷(100mg，0.239mmol)，无水碳酸钾(66.06mg，0.478mmol)加入到50ml单口圆底烧瓶中，加入10mldmf，搅拌一小时后加入苯甲酰氯(37mg，0.263mmol)，5小时后将体系倒入30ml水中，有大量黄色固体析出，抽滤，滤渣干燥后柱层析得目标ag-3化合物40mg，产率32％。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm)δ＝13.05(s,1h),8.43(d,j＝8.4hz,1h),8.20-8.09(m,2h),8.02-7.84(m,3h),7.81-7.73(m,1h),7.69-7.60(m,2h),7.52-7.43(m,1h),7.17-7.04(m,2h),7.03-6.97(m,2h),5.40(d,j＝6.0hz,1h),5.23-4.93(m,3h),4.62(s,1h),3.78-3.64(m,1h),3.53-3.43(m,2h),3.22-3.11(m,3h).
实施例4：三种异甘草苷衍生物对斑马鱼胚胎血管损伤的修复和再生作用
实验动物：转基因品系tg(flk1：egfp)斑马鱼胚胎。
实验试剂：血管内皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(vegfrtyrosinekinaseinhibitorii，简称vri，cat：676481-5mg，millipore，化学名：n-(4-chlorophenyl)-2-[(pyridin-4-ylmethyl)amino]benzamide)；异甘草苷(isoliquiritin，简称isn，cat：jot10089，hplc≥98％，成都普菲德生物技术有限公司)，异甘草苷衍生物ag-1、ag-2、ag-3。
实验方法：取24hpf(hourspostfertilization)转基因品系tg(flk1：egfp)斑马鱼胚胎，加入脱卵膜酶完成脱卵膜。
胚胎造模：将胚胎吸至六孔板中，加入含有1000nmvri的卵液，28℃培养箱静置4小时，荧光显微镜下观察28hpf胚胎体节间血管(intersegmentalvessels，isv)生长情况，胚胎体节间血管发育受到抑制，表明造模成功。
分组及给药：吸出卵液，将胚胎转移至48孔板，将胚胎分为给药组，造模对照组和空白对照组，给药组分别为低浓度50μm和高浓度100μm的isn及三种衍生化合物，28℃培养箱静置，48hpf时，将各药物浓度处理后的胚胎在荧光显微镜下进行观察拍照，以分析各药物浓度对斑马鱼体节间血管(isv)生成的影响。
统计指标：从各实验组随机取3组，每组10只胚胎进行定量统计，统计完整的体节间血管(isv)数量：连接背主动脉(dorsalaorta,da)和背长轴血管(dorsallongitudinalanastomoticvessel,dlav)之间的血管并计算体节间血管生成抑制率。
体节间血管(isv)生成抑制率(％)＝(1-药物处理组isvs数量/阴性对照组isvs数量)×100％。
实验结果：三种异甘草苷衍生物均表现出促进体节间血管再生的作用；其中，造模组中，vri对血管生长的抑制率为92.2％，低浓度50μm和高浓度100μm的ag-1均表现明显的促进血管新生的作用，其中高浓度ag-1对血管再生的平均抑制率为51.5％，体节间血管生长且促进作用呈剂量依赖型；低浓度50μm的ag-2未表现出促进血管新生的作用，而高浓度100μm却表现出明显的促进作用；而衍生物3，ag-3在50μm和100μm浓度下，不仅表现出促进血管新生的作用，同时表现出对斑马鱼胚胎的致畸性，因此，降低给药浓度后重新实验发现，在更低的浓度下，造模对血管生长的抑制率为91.2％，25μm浓度下的ag-3及异甘草苷分别将血管生长抑制率降低至56.1％和75.9％，ag-3比相同浓度下的异甘草苷促进作用提高21.7％，表现出明显的促进血管新生的能力。不同浓度给药组斑马鱼胚胎体节间血管发育情况如图1-4，体节间血管生长抑制率统计如图5-8。
实施例5：三种异甘草苷衍生物在斑马鱼缺血性脑卒中模型上的作用研究
实验动物：野生型成年斑马鱼
实验方法：
斑马鱼脑卒中模型建立：在1000ml烧杯中放置800ml水，该烧杯有两个管道，一个连接至氮气阀，一个连接与空气当中，在这个烧杯内造成缺氧环境是由通入纯净的氮气造成的，当以流速5l/min，通入氮气后,测得≧8min水中的溶解氧含量最低可至1.1mg/l，且保持不变，即烧杯内已接近无氧环境，此时，选取体长在30-40mm的成年野生型斑马鱼放入已经接近无氧环境的烧杯中，继续通入氮气1min保证烧杯内的无氧环境，紧接着持续观察斑马鱼的游动行为，斑马鱼随着无氧环境会逐渐出现挣扎、转圈等反常应急游动行为，直至最后斑马鱼呆在烧杯底部持续一分钟以上的无意识、不游动(“昏迷”状态)，立即将斑马鱼取出转移到正常氧环境的烧杯中，待其恢复，在恢复后24h进行后续评价。
实验试剂：2％ttc(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)溶液的准备
称取0.1gttc粉末，溶于5mlpbs(磷酸盐缓冲液，ph＝7.2-7.4)中，振荡涡旋至全溶，配置浓度为20mg/ml，溶质质量分数为2％，每个样本染色需200μl2％ttc溶液，根据样本数量现用现配。
分组及给药：所述的分组指的是选取成年斑马鱼80条，随机分为对照组和给药组，进行缺血性脑卒中造模实验，在斑马鱼出现呆在烧杯底部持续1min以上的无意识、不游动行为时，对照组立即取出转移至正常烧杯，给药组立即取出给药后转移至正常烧杯，待其恢复并观察恢复行为，记录斑马鱼恢复至初次游动的时间；所述的给药处理方式是将恢复后的斑马鱼放置在含药液的水中，给药浓度为100μm，每天更换新鲜药液，持续给药2天，在给药后处理结束后24h均对上述斑马鱼进行脑切片ttc染色评价。
评价指标：ttc染色
2％ttc染色观察处理方法为：将照射恢复后的斑马鱼放于0.16mg/ml三卡因氨基苯加酸乙酯甲基磺酸盐麻醉至无意识后，使用大头钉将其固定在手术台上，从背部距头部约1cm处切断，在体视显微镜下解剖取出斑马鱼全脑后立即-20度冷冻20min，由切片机切成1mm厚的脑切片，然后放置在37℃水浴锅中避光染色30min，染色完成后转移至4％多聚甲醛中固定过夜，拍照成像并使用imageproplus6.0图像处理软件进行梗死面积定量，记录脑切片组织白色染色面积和脑切片全面积，以梗死面积比率作为缺血性脑卒中发生脑损伤严重程度的指标，其计算方法如下：
梗死面积比％＝(模型组脑切片白色染色面积/模型组脑切片表面全面积)×100％。
实验结果：如图9所示，缺氧造模组的斑马鱼脑组织脑部梗死面积百分比达86.7％，三种异甘草苷衍生物ag-1，ag-2及ag-3均具有减轻脑组织梗死面积的作用，分别将脑梗死面积百分比降低至63.4％，47.3％及65.8％，与造模组相比，均具有显著的统计学差异，可明显的减轻缺氧造成的脑部损伤。
实施例6：三种异甘草苷衍生物在大鼠局灶性脑缺血再灌注模型上的治疗作用研究
实验动物：sd大鼠，雄性，spf级，250-280g；来源：上海斯莱科实验动物有限责任公司。
实验试剂：依达拉奉注射液，批号：80-161103，南京先声东元制药有限公司生产，规格：10.0mg/5ml，临用前使用生理盐水配制浓度为1mg/ml。
ag-1，ag-2及ag-3；处方：5％乙醇 5％solutolhs-15 90％生理盐水，临用前分别使用生理盐水配制浓度为1mg/ml。
给药方式：各组于再灌注后立即尾静脉注射给药1次，共给药1次；给药体积为8ml/kg。
实验方案：实验动物称重，制备脑缺血模型(大脑中动脉阻塞(mcao)再灌注模型)后，将动物随机均等单盲分入各组；实验动物按上述给药方式给药；实验动物于脑缺血后24小时评价神经行为缺陷症状，而后处死动物、取脑、切片、染色，计算脑梗死面积。
评价指标：(1)神经缺陷症状评价：采用改良bederson5分制法进行神经缺陷症状评价。
神经缺陷症状评分bederson5分制法
0：提尾悬空时，动物的两前肢均伸向地板方向，且无其他行为缺陷
1：提尾悬空时，动物的手术对(左)侧前肢表现为腕肘屈曲、肩内旋、肘外展、紧贴胸壁
2：将动物置于光滑平板上，推手术侧肩向对侧移动时阻力降低
3：动物自由行走时，向手术对侧环行或转圈
4：肢体软瘫，肢体无自发活动
(2)脑梗死程度的测定：动物处死后，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，用生理盐水冲洗大脑表面血迹，吸去表面残留水迹，于-20℃放置20min，取出后立即于视线交叉平面垂直向下作冠状切面，并向后每隔2mm切一片，将脑片置于1％ttc染液中孵育(37℃20min)，正常脑组织染成深红色，缺血脑组织则呈苍白色，用生理盐水冲洗后，迅速将脑片从前向后按顺序排成一排，吸干表面残留水迹，拍照。
照片用imagej软件处理，根据公式计算左脑相应的面积以及梗死灶面积，求出梗死灶百分比。
梗死体积计算法：
v＝t(a1 a2 a3 ……… an)
t为切片厚度，a为梗死面积。
％i＝100％×(vc-vl)/vc
％i为梗死体积百分比，vc为对照侧(左脑半球)脑体积，vl为梗死侧(右脑半球)非梗死区域体积。
实验结果：(1)统计结果表明，各组之间不存在统计学差异，但各给药组与模型组相比具有明显的改善神经缺陷的趋势，各组对神经缺陷症状的影响见表1和图11。
(2)gly-2对脑梗塞面积的影响
统计结果表明，模型组脑梗死面积百分比为40.45±3.76％，阳性药依达拉奉8mg/kg剂量给药组将脑梗死面积百分比降低至26.83±3.82％，可以极显著减少脑缺血再灌后动物的脑梗塞面积。8mg/kgag-1，ag-2及ag-3分别将脑梗死面积降低至29.61±5.14％，26.59±4.22％及19.57±4.52％，与模型组相比具有明显的改善神经缺陷的趋势，能显著减少模型动物的脑梗死面积。各组对脑梗塞面积的影响见表1、图12。
与模型组相比，阳性药依达拉奉显著减轻脑缺血再灌后动物急性脑损伤，证明该实验体系可靠，可用于药效评价。与模型组相比，尾静脉分别给予异甘草苷衍生物ag-1(8mg/kg)ag-2(8mg/kg)及ag-3(8mg/kg)，能显著减轻脑缺血再灌后动物急性脑损伤，其中化合物ag-3药效比相同浓度下阳性药依达拉奉提升17.9％，表现出显著地开发为新药的潜力。
表1三种异甘草苷衍生物对神经缺陷症状、脑梗塞面积的影响(mean±sem)
1.一种式(i)的异甘草苷衍生物、其药学可接受的盐或其异构体，其特征在于：
r选自c1-6烷基、c3-10环烷基、c1-6烷基甲酰基、c3-10环烷基甲酰基、c6-10芳基甲酰基或3-c6-10芳基丙烯酰基。
2.异甘草苷衍生物、其药学可接受的盐或其异构体，选自：
3.一种权利要求1所述的异甘草苷衍生物的制备方法，其特征在于异甘草苷衍生物由异甘草苷通过烷基化或酰基化反应制得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，反应可选的进一步加入碱性催化剂。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，烷基化或酰基化试剂与异甘草苷摩尔比为1:1～10:1，优选为1.05:1～6:1，优选为1.1:1～4:1，更优选为1.2:1～2:1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，碱性催化剂与异甘草苷摩尔比为1:1～10:1，优选为1.05:1～6:1，优选为1.1:1～4:1，更优选为1.2:1～2:1。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述碱性催化剂为无机碱或有机碱，优选为无水碳酸钾、无水碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、三乙胺或n,n-二甲基苯胺中的一种或多种。
8.权利要求1或2任一项所述的异甘草苷衍生物、其药学可接受的盐或其异构体在制备预防或治疗心脑血管疾病药物中的应用，优选的，所述心脑血管疾病药物为缺血性脑卒中疾病药物。
9.权利要求1或2任一项所述的异甘草苷衍生物、其药学可接受的盐或其异构体在制备预防或治疗缺血性疾病药物中的应用，优选的，所述缺血性疾病药物为糖尿病致严重肢体缺血药物。
10.一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的权利要求1或2任一项所述的异甘草苷衍生物或其异构体作为活性成分，和一种或多种药用载体物质。
11.一种预防或治疗缺血性脑卒中或糖尿病致严重肢体缺血疾病的方法，包括向疾病患者给予要求10所述的药物组合物。
技术总结