本发明属于活性肽领域，具体涉及一种抗炎四肽及其提取分离方法和在制备改善记忆类药物中的应用。
背景技术：
炎症反应是指由有害刺激、感染或外伤引起的微循环系统的复杂生物学反应。通常情况下，炎症由一系列可溶性介质(炎症相关细胞释放的补体、趋化因子、细胞因子和活性氧等)启动而后去消除病灶。但是，过度表达或长期炎症是许多疾病的潜在诱因，包括癌症，类风湿性关节炎，慢性哮喘，多发性硬化症，肥胖症，自身免疫性疾病，糖尿病，炎症肠病和心血管疾病等。而在脑部，神经炎症被认为是神经退行性疾病的发病机理。
小胶质细胞是巨噬细胞样细胞，在中枢神经系统(cns)的炎症反应过程中发挥关键作用。小胶质细胞过度活化时，会释放各种促炎介质，包括一氧化氮(no)，前列腺素e2(pge2)和促炎细胞因子，例如白介素-1β(il-1β)，白介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)以及其他一些具有潜在神经毒性的化合物。这些因子在中枢神经系统中的过量产生会触发炎症反应，并最终导致神经变性。另外，活性氧(ros)通过激活nf-κb途径诱导促炎基因的表达。激活的促炎性转录因子可增强细胞因子和趋化因子的形成，从而引起炎症反应的产生和发展。反之，该过程又会产生更多的ros。这种恶性循环通过介导线粒体功能障碍，加剧细胞损伤并最终对神经元产生有害影响。这表明氧化应激在炎症反应中具有重要作用。
bv-2是一种永生化的小鼠小胶质细胞，由于其激活后可持续、稳定和过量地产生炎性因子，因此被广泛应用于研究炎症相关的神经退行性疾病。脂多糖(lps)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，可通过介导多种细胞反应促进炎症因子的释放，通常用于在体内外诱导炎症的发生。
研究表明在小鼠腹膜内注射lps从而促进炎症反应进程来造成学习和记忆功能障碍模型。此外，越来越多的研究报道了氧化应激在炎症反应发展中的作用。ros的产生会增加bv-2小胶质细胞中炎症介质的表达，从而加速神经元损伤和死亡。据报道，小胶质细胞中ros的过量产生可引起炎症并导致神经系统损伤。作为细胞中ros的主要来源，线粒体的功能变化也参与其中。
因此，为了筛选抗炎肽，使用lps刺激bv-2细胞造成炎症模型，以确定肽是否可以抑制炎症反应的产生和发展。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于提供一种抗炎四肽。
本发明的另一目的在于提供上述四肽的提取分离方法。
本发明的再一目的在于提供上述四肽的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种四肽，其氨基酸序列为gly-val-tyr-tyr(gvyy)。
上述四肽可以采用现有技术化学合成。例如通过固相合成仪合成本发明四肽，将二氯树脂溶胀、洗涤，脱除fmoc保护基后加入氨基酸进行缩合反应，重复脱除-保护-缩合的过程直至所有氨基酸连接完毕。
此外本发明的抗炎四肽也可采用超滤和葡聚糖凝胶色谱等分离手段从核桃蛋白酶解液中分离获得，具体地包括以下步骤：
(1)采用碱溶酸沉的方法从核桃粕中提取核桃蛋白，具体流程如下，核桃粕打粉后加水溶解(物料比为1:12)，溶液调ph值至8.0-9.0，搅拌2-3h，离心(8000-10000rpm，10-15min，4℃)，取上清液调ph值至4.0-5.0，再搅拌2-3h，再次离心(8000-10000rpm，10-15min，4℃)，将沉淀溶解，透析脱盐2d(渣与水1:5)以上，真空干燥得到核桃蛋白粉；
(2)取核桃蛋白粉，加去离子水混合，使用复合植物水解酶和胰酶在50-60℃酶解12-16h，复合植物水解酶和胰酶的加入量均为0.5-1.0％(w/w，以核桃蛋白粉的质量计)；然后灭酶，离心，取上清液，得到核桃蛋白酶解液；使用3kda分子量超滤膜收集透过液以获得核桃蛋白酶解液的低分子量组分(mw<3kda)；
所述的灭酶是95℃下处理10-15min；
(3)核桃蛋白酶解液的低分子量组分上样凝胶过滤色谱柱sephadexg-15，用去离子水以1.0-2.0ml/min的流速进行洗脱，检测波长为220nm，收集合并成多个洗脱峰组分，选择抗炎活性较强的组分做质谱检测，证实含有本发明的抗炎四肽；
本发明的抗炎四肽gvyy可抑制lps诱导的细胞炎症反应，同时缓解lps诱导的细胞氧化应激反应，从而具有潜在的缓解脑部神经炎症的功能，可用于改善记忆类药物和保健品中。
所述的抑制lps诱导的细胞炎症反应，包括降低lps诱导的细胞中促炎介质和促炎细胞因子的生成量；
所述的促炎介质包括no和pge2；
所述的促炎细胞因子包括il-6、il-1β和tnf-α。
所述的缓解lps诱导的细胞氧化应激反应是指降低lps诱导的细胞内活性氧的生成量，以及逆转lps诱导的线粒体膜电位的下降。
所述的细胞是小胶质细胞；
所述的细胞是bv-2细胞。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明的抗炎四肽结构清晰明了，可采用固相化学合成方法制得，也可通过对核桃蛋白酶解物进行分离纯化获得。
2、本发明的抗炎四肽对lps刺激的bv-2细胞炎症反应具有较好的抑制活性，具有潜在的缓解脑部神经炎症的功效，可用于制备改善记忆类药物或改善记忆类保健品，也可与其他保健品或食品添加剂复配使用。
附图说明
图1是sephadexg-15凝胶过滤色谱的洗脱曲线。
图2是四肽gvyy的二级质谱图。
图3是gvyy对lps诱导的bv-2细胞内ros和mmp的影响；其中，#代表与正常对照组比较，p<0.05；*表示与模型组比较，p<0.05。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
bv-2细胞培养
向dmem培养基中加入胎牛血清(fbs)，加入量为10％(v/v)，然后加入由100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素组成的混合双抗。细胞培养箱为bv-2细胞的生长提供了所需的环境，箱内条件设定为37℃且含有5％的co2。根据细胞生长情况及时进行换液和传代。
实施例2
固相合成法合成gly-val-tyr-tyr多肽
将二氯树脂溶胀、洗涤，脱除fmoc保护基后加入氨基酸进行缩合反应，重复脱除-保护-缩合的过程直至所有氨基酸连接完毕。切割树脂，得到多肽gly-val-tyr-tyr粗品，用反相高效液相色谱法纯化，得到多肽纯品(>95％)。
实施例3
gly-val-tyr-tyr多肽的分离纯化方法
(1)核桃蛋白粉的制备：采用碱溶酸沉的方法从核桃粕中提取核桃蛋白。具体流程如下，核桃粕打粉后加水溶解(物料比为1:12)→溶液调ph值至8.5→搅拌2h→离心(8000rpm，15min，4℃)→取上清液调ph值至4.5→搅拌2h→离心(8000rpm，15min，4℃)→沉淀溶解→透析脱盐2d(渣与水1:5)→干燥→核桃蛋白粉。
(2)核桃蛋白酶解物的制备：按重量取核桃蛋白粉1份和去离子水8份混合均匀，使用两种蛋白酶(复合植物水解酶和胰酶)在55℃酶解12小时，复合植物水解酶和胰酶的加酶量分别为1.0％和1.0％(w/w)。随后95℃下灭酶15min，离心，取上清液，得到核桃蛋白酶解液；使用3kda分子量超滤膜收集透过液以获得核桃蛋白酶解液的低分子量组分。收集核桃蛋白酶解液低分子量组分(mw<3kda)，冷冻干燥，并在-20℃下储存备用。
(3)抗炎肽的分离纯化：使用凝胶过滤色谱柱sephadexg-15进行分离纯化，用去离子水以1.5ml/min的流速进行洗脱，检测波长为220nm，洗脱曲线如图1所示，选择抗炎活性较强的组分g3和g6进行收集，然后冷冻干燥成粉末。得到目标多肽。目标多肽的二级质谱图如图2所示，序列是gly-val-tyr-tyr。
表1不同洗脱峰组分对lps诱导的bv-2细胞内no和pge2产生的影响
#代表与正常对照组比较，p<0.05，*表示与模型组比较，p<0.05。
lps激活的小胶质细胞可通过过量产生促炎介质(no和pge2)加速炎症反应进程，最终导致细胞死亡。因此，no和pge2的产生量被用来评估样品对lps刺激的bv-2细胞炎症的抑制作用。通过sephadexg-15凝胶过滤色谱将核桃蛋白酶解液低分子量组分(mw<3kda)分成6个主要组分(g1-g6)。测定结果如表1所示，lps处理后细胞培养基中no和pge2含量显著增加，分别为101.73±7.98μm和205.58±23.58pg/ml。但是，g3和g6处理可以显著抑制lps所致的bv-2细胞中no和pge2的产生(p<0.05)。因此，通过uplc-esi-q-tof-ms/ms分析g4和g6中包含的特定氨基酸序列抗炎肽，随后得到本发明抗炎四肽gvyy。
实施例4
四肽gvyy对lps诱导的bv-2细胞促炎介质和促炎细胞因子水平的影响
本研究采用在bv-2细胞中同时添加诱导剂lps和抗炎四肽gvyy，即共培养细胞模型来评估gvyy对lps诱导的bv-2小胶质细胞炎症损伤的保护作用。将细胞以2×105个/ml的密度接种于12孔板中贴壁生长24小时，随后加入gvyy和lps(0.1μg/ml)处理bv-2细胞24小时。正常对照组中不加gvyy和lps，用相同量的dmem培养基处理。待细胞处理结束时，收集上清液并根据试剂盒使用说明书测定其中一氧化氮(no)、前列腺素e2(pge2)、白细胞介素-1β(il-1β)，白细胞介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)含量。
表2gvyy对lps诱导的bv-2细胞内no和pge2产生的影响
#代表与正常对照组比较，p<0.05，*表示与模型组比较，p<0.05。
lps激活的小胶质细胞可通过过量产生促炎介质(no和pge2)加速炎症反应进程，最终导致细胞死亡。因此，no和pge2的产生量被用来评估gvyy对lps刺激的bv-2细胞炎症的抑制作用。测定结果如表2所示，lps处理后细胞培养基中no和pge2含量显著增加，分别为84.41±7.98μm和235.46±23.56pg/ml。但是，gvyy处理可以显著抑制lps所致的bv-2细胞中no和pge2的产生(p<0.05)，使其分别降低到53.37±4.75μm和107.83±10.58pg/ml。
表3gvyy对lps诱导的bv-2细胞内il-1β，il-6和tnf-α产生的影响
#代表与正常对照组比较，p<0.05，*表示与模型组比较，p<0.05。
据报道，过度激活的小胶质细胞中促炎细胞因子的产生会引发急性和慢性炎症，从而引起神经退行性疾病。在本研究中，通过检测il-6，il-1β和tnf-α的产生水平以评估gvyy对lps刺激的bv-2细胞促炎性细胞因子暴增的抑制作用。测定结果如表3所示，在lps处理的bv-2细胞中观察到il-6，il-1β和tnf-α的含量突增。然而，加入gvyy保护的bv-2细胞中tnf-α产生从4000.53±357.75pg/ml显著降低至1300.18±159.51。同时，与lps组相比，使用gvyy可显著减少模型组细胞中il-1β和il-6的产生(p<0.05)。
实施例5
四肽gvyy对lps诱导的bv-2细胞内活性氧和线粒体膜电位的影响
细胞内的ros水平使用荧光探针法(dcfh-da)来测定。将细胞以2×105个/ml的密度接种于96孔板中贴壁生长24小时，随后加入gvyy和lps处理bv-2细胞24小时。待bv-2细胞样品处理完成后，将bv-2细胞与10μmdcfh-da探针在培养箱中放置30分钟，然后用pbs清洗。在存在ros的情况下，dcfh可以转化为具有强绿色荧光的二氯荧光素(dcf)。使用多模板读数器测量荧光强度(ex＝488nm，em＝525nm)。
细胞内线粒体膜电位(mmp)使用jc-1荧光探针法来测定。jc-1荧光探针法是一种对线粒体膜电位变化十分敏感的测定方法，当细胞具有较高的线粒体膜电位时，荧光探针在线粒体基质中形成有红色荧光的聚集体(j-aggregate)。反之，则jc-1以单体(j-monomer)的形式存在，本身具有绿色荧光。将细胞以2×105个/ml的密度接种于96孔板中贴壁生长24小时，随后加入gvyy和lps处理bv-2细胞24小时。待bv-2细胞进行样品处理培养后，将细胞与jc-1工作溶液在37℃共孵育30分钟。然后收集细胞样品并用pbs洗涤两次，随后重新悬浮并用荧光分光光度计分析。计算δψm单体和聚集体荧光强度比率的变化。
越来越多的证据表明氧化应激可促进炎症反应的进程，因此对细胞内氧化应激的抑制将有助于抗炎。测定结果如图3所示，gvyy可缓解lps刺激引起的ros生成。同时，gvyy也显著逆转了bv-2细胞中lps诱导的mmp损失。bv-2细胞经lps处理后，细胞内ros含量相比于对照组提高了2.24倍，gvyy可将细胞内ros的产生降低至对照组的137.10％±5.24％(p<0.05)。此外，lps刺激引起bv-2细胞中mmp的损失(68.48％±3.34％)，gvyy可显著逆转细胞内因lps刺激导致的mmp的降低(79.99％±4.00％)。
综上所述，本发明的四肽gvyy可显著抑制lps诱导所致的bv-2细胞内的炎症反应，同时gvyy对氧化应激的缓解也有助于其抗炎活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种抗炎四肽，其特征在于氨基酸序列为gly-val-tyr-tyr。
2.权利要求1所述的抗炎四肽的提取分离方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)核桃粕打粉后加水溶解，溶液调ph值至8.0-9.0，搅拌2-3h，离心，取上清液调ph值至4.0-5.0，再搅拌2-3h，再次离心，将沉淀溶解，透析脱盐2d以上，真空干燥得到核桃蛋白粉；
所述的离心，是在4℃下，8000-10000rpm离心10-15min；
(2)取核桃蛋白粉，加去离子水混合，使用复合植物水解酶和胰酶在50-60℃酶解12-16h，复合植物水解酶和胰酶的加入量均为0.5-1.0％(w/w，以核桃蛋白粉的质量计)；然后灭酶，离心，取上清液，得到核桃蛋白酶解液；使用3kda分子量超滤膜收集透过液以获得核桃蛋白酶解液的低分子量组分；
(3)核桃蛋白酶解液的低分子量组分上样凝胶过滤色谱柱sephadexg-15，用去离子水以1.0-2.0ml/min的流速进行洗脱，检测波长为220nm，收集合并成多个洗脱峰组分，选择抗炎活性较强的组分做质谱检测，证实含有本发明的抗炎四肽；
所述的抗炎活性是指对lps诱导的细胞中促炎介质生成量的影响。
3.权利要求1所述的抗炎四肽在制备改善记忆类的药物和保健品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的改善记忆是指缓解脑部神经炎症。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的缓解脑部神经炎症，是指抑制lps诱导的细胞炎症反应，同时缓解lps诱导的细胞氧化应激反应。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的抑制lps诱导的细胞炎症反应，包括降低lps诱导的细胞中促炎介质和促炎细胞因子的生成量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述的促炎介质包括no和pge2；
所述的促炎细胞因子包括il-6、il-1β和tnf-α。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的缓解lps诱导的细胞氧化应激反应是指降低lps诱导的细胞内活性氧的生成量，以及逆转lps诱导的线粒体膜电位的下降。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的细胞是小胶质细胞。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的细胞是bv-2细胞。
技术总结