本发明涉及一种抗菌肽，尤其是涉及一种免疫调节因子idr-1018衍生肽及其应用。
背景技术：
抗菌肽是由生物有机体产生的前体经蛋白酶降解形成的具有生物学活性的小分子多肽，主要构成了机体防御的第一道防线。抗菌肽对细菌的作用机制主要是以膜作为靶位点，通过静电力和受体介导的细胞膜作用力，引起膜通透性改变，降低细胞膜稳定性，或插入细胞膜中形成跨膜的孔洞，最终导致细菌内容物外泄而死亡。由于抗菌肽特殊的作用机制，使其不易产生耐药性，并且对许多临床耐药菌同样具有杀菌作用。因此，抗菌肽被认为可以替代传统抗生素，应用于医药卫生、饲料添加剂和食品防腐等领域。
虽然天然抗菌肽具有普遍的优点，但也存在着某些明显的不足，例如，部分抗菌肽活性相对较低，临床应用中对真核细胞具有强毒性、选择性差，对真核生物体内的正常菌群起到一定的杀伤作用，造成代谢的紊乱，这些都是限制抗菌肽发展的瓶颈。因此，以抗菌肽的结构与功能的关系研究为基础，通过生物信息学方法，对现有抗菌肽进行全新设计和结构改造，以期获得高抗菌活性、低毒性的抗菌肽衍生物。
固有免疫调节因子(innatedefenseregulator，idr)idr-1018(vrlivavriwrr-nh2)是以抗菌肽bactenecin线性突变体bac2a(rlarivvirvar-nh2)为模板，通过氨基酸替换、重新排序改造获得的结构简单具有抗菌、抗生物膜、免疫调节活性及低溶血性小肽。但是在其进一步的临床应用中由于体内不稳定性及活性有限而受到制约。因此，亟需通过对抗菌肽的设计改造，提高抑菌、抗生物膜活性及稳定性，同时降低溶血活性。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种高抗菌性、抗生物膜活性、高稳定性以及低溶血活性的免疫调节因子idr-1018衍生肽及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、免疫调节因子idr-1018衍生肽，该衍生肽为1018m肽或/和d1018肽，其中1018m肽的氨基酸序列如seqidno:1所示，d1018肽的氨基酸序列如seqidno:2所示。
2、上述免疫调节因子idr-1018衍生肽的制备方法，以idr-1018母体肽序列为基础，将第4-7和9位的氨酸残基i、v、a、v、i替换为r、w、w、r、r，得到一个突变体抗菌肽1018m，其氨基酸序列如seqidno:1所示。
3、上述免疫调节因子idr-1018衍生肽的制备方法，以idr-1018母体肽序列为基础，对抗菌肽idr-1018进行d型氨基酸替换，得到一个新型衍生肽d1018，其氨基酸序列如seqidno:2所示。
4、编码上述免疫调节因子idr-1018衍生肽的基因，所述的1018m肽的核苷酸序列如seqidno:3所示。
5、编码上述免疫调节因子idr-1018衍生肽的基因，所述的d1018肽的核苷酸序列如seqidno:4所示。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
6、含有idr-1018衍生肽1018m或idr-1018衍生肽d1018所述基因的表达盒。
7、含有idr-1018衍生肽1018m或idr-1018衍生肽d1018所述基因或上述表达盒的载体。
8、含有idr-1018衍生肽1018m或idr-1018衍生肽d1018所述基因、上述表达盒或上述所述载体的转基因细胞系或工程菌。
9、上述idr-1018衍生肽在制备治疗细菌感染的抗菌药物或组合物中的应用。
10、上述idr-1018衍生肽在制备抗生物膜药物或组合物中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明免疫调节因子idr-1018衍生肽及其应用，通过对抗菌肽idr-1018分子结构进行优化设计，将第4-7和9位的氨酸残基i、v、a、v、i替换为r、w、w、r、r，得到一个突变体抗菌肽1018m。突变体1018m由12个氨基酸组成，分子量为1882.26da，等电点为12.78。此外，发明人通过对抗菌肽idr-1018d型氨基酸替换，得到一个新型衍生肽d1018。本发明的抗菌肽1018m、d1018不仅具有良好的抗菌活性。并且结晶紫染色法和扫描电镜试验结果表明两衍生肽抗生物膜活性较母体肽显著提高。此外，1018m显著降低了对小鼠红细胞的溶血活性，d1018显著提高了对胰蛋白酶的稳定性。
综上所述，本发明免疫调节因子idr-1018衍生肽，两突变体与母体肽相比提高杀菌活性和抗生物膜活性的同时，1018m显著降低了溶血性，d1018显著提高了抗酶解性，同时抗菌肽1018m和d1018分子量小，易于人工合成，是极具应用价值的小分子多肽，可用于制备新型抗菌抗感染药物等，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例2中idr-1018衍生肽1018m、d1018的杀菌曲线实验结果；
图2为本发明实施例3中idr-1018衍生肽1018m、d1018的温度稳定性实验结果，其中横坐标为处理温度，纵坐标为该处理下肽对金黄色葡萄球菌atcc43300的mic；
图3为本发明实施例3中idr-1018衍生肽1018m、d1018的酶稳定性实验结果，其中横坐标为不同种类酶，纵坐标为该处理下肽对金黄色葡萄球菌atcc43300的mic；
图4为本发明实施例3中idr-1018衍生肽1018m、d1018的酸碱稳定性实验结果，其中横坐标为不同ph值，纵坐标为该处理下肽对金黄色葡萄球菌atcc43300的mic；
图5为本发明实施例4中idr-1018衍生肽1018m、d1018的溶血性实验结果；
图6为本发明实施例5中结晶紫染色法测定idr-1018衍生肽1018m、d1018对生物膜抗性实验结果；
图7为本发明实施例5中扫描电镜法测定idr-1018衍生肽1018m、d1018对对生物膜抗性实验结果：其中，a：空白对照；b：101864ug/ml；c：1018m64ug/ml；；d：d101864ug/ml。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
idr-1018衍生肽1018m、d1018的设计与合成
1、以idr-1018母体肽序列为基础，通过替换氨基酸残基，适当增加抗菌肽正电荷和小分子结合特性对多肽进行改造，最终确定突变体抗菌肽1018m、d1018。其中通过对抗菌肽idr-1018分子结构进行优化设计，将第4-7和9位的氨酸残基i、v、a、v、i替换为r、w、w、r、r，得到一个突变体抗菌肽1018m。突变体1018m由12个氨基酸组成，分子量为1882.26da，等电点为12.78。另外，通过对抗菌肽idr-1018d型氨基酸替换，得到一个新型衍生肽d1018。
2、抗菌肽1018m、d1018基因的氨基酸序列如vrlivavriwrr-nh2（seqidno:1）和vrlrwwrrrwrr-nh2（seqidno:2）所示，核苷酸序列如gtgcgcctgattgtggcggtgcgcatttggcgccgc（seqidno:3）和gtgcgcctgcgctggtggcgccgccgctggcgccgc（seqidno:4）所示。
3、抗菌肽合成采用固相合成法，通过十二通道半自动多肽合成仪进行合成。反向高效液相色谱c18柱测定合成肽纯度（>90%），esi-ms质谱确认衍生肽1018m、d1018的分子量。
实施例2
idr-1018衍生肽1018m、d1018的抑菌实验
本实施例中的病原菌来自于美国菌种保藏中心（atcc），具体菌株如表1所示。
衍生肽的最小抑菌浓度（mic，minimuminhibitoryconcentration）的测定参照临床和实验室标准协会（clsi，clinicalandlaboratorystandardsinstitute）制定的方法（wiegand等，agarandbrothdilutionmethodstodeterminetheminimalinhibitoryconcentration(mic)ofantimicrobialsubstances.natureprotocols,2008,3(2):163-175），根据具体情况略有改动，操作细节如下：
将受试菌株的单菌落挑至mh液体培养基中，37℃，250rpm振荡过夜培养活化后，转接至mh液体培养基中培养至对数生长期（od600nm=0.4-0.6），然后制备成105cfu/ml的菌液，加入96孔无菌细胞培养板内，每孔90μl。
用pbs缓冲液通过2倍倍比稀释法对idr-1018衍生肽1018m、d1018进行稀释，每孔10μl抗菌肽，使其终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625μg/ml，阴性对照组为pbs缓冲液代替抗菌肽的受试菌液，空白对照组为无菌mh培养基。每个处理做三个平行样。
将培养板置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，能够完全抑制细菌生长的最低浓度即为抗菌肽对受试菌株的mic值。如果出现跳孔或平行样间结果不一致的情况，则重新测试。结果如表1所示，抗菌肽对各菌种均体现出不同程度的较好抑菌效果。
表1idr-1018衍生肽1018m、d1018的mic值测定
结果如图1所示，由图1可知，经过1×、2×和4×idr-1018及其衍生肽1018m、d1018处理后，s.aureusatcc43300在2h内呈现急速下降的趋势，并且具有时间和浓度依赖性，衍生肽1018m、d1018具有相似的杀菌趋势，且优于母体肽和万古霉素。
实施例3
idr-1018衍生肽1018m、d1018的稳定性
1.热稳定性试验：idr-1018衍生肽1018m、d1018样品肽分别放置20℃、40℃、60℃、80℃和100℃环境孵育1h，冷却后分别取10μl样品肽加入到90μl对数期（1×105cfu/ml）的金黄色葡萄球菌atcc43300菌液中，至肽终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μg/ml，阴性对照组为生理盐水代替抗菌肽的受试菌液，空白对照组为无菌mh培养基，每个处理三个平行样。将培养板置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，观察经不同温度处理后肽的mic改变情况。结果如图2所示，由图2可知，idr-1018及衍生肽d1018置于60℃及以上下孵育1h活性降低2-4倍，而衍生肽1018m对高温耐受能力显著高于母体肽，100℃孵育1h活性未发生变化，该特性可在一定程度上方便药物保存。
2.酶稳定性试验：选用胃蛋白酶（3000u/mg，ph2.0），胰蛋白酶（250u/mg，ph8.0），与抗菌肽冻干粉按1:10（w/w）的比例溶解于上述酶对应的最适缓冲液中，37℃静置孵育3h，取10μl加入90μl对数期（1×105cfu/ml）金黄色葡萄球菌atcc43300菌液中，使抗菌肽终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μg/ml，对应的缓冲液做对照，37℃恒温培养箱孵育16-18h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，观察经不同蛋白酶处理后肽的mic改变情况。结果如图3所示，由图3可知，衍生肽d1018胃蛋白酶或胰蛋白酶处理后抗菌活性均未发生变化，其对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受能力显著高于母体肽。衍生肽1018m较母体肽而言胃蛋白酶耐受能力显著提高，但胰蛋白酶与母体肽一致。衍生肽酶稳定性性提高在一定程度上方便药物体内，尤其是口服应用。
3.ph稳定性试验：将样品肽分别溶于glycine-hcl（ph2.0），柠檬酸缓冲液（ph4.0），磷酸钠缓冲液（ph6.0），tris-hcl（ph8.0）和glycine-naoh（ph10.0）中，37℃静置孵育3h。孵育结束后分别取10μl加入90μl对数期（1×105cfu/ml）的金黄色葡萄球菌atcc43300菌液中，至肽终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μg/ml，同时未加肽的缓冲液在相同的条件下处理作为阴性对照。37℃恒温培养箱孵育16-18h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，观察经不同ph处理后肽的mic改变情况。结果如图4所示，由图4可知，衍生肽d1018及1018m在各个ph下均只有1-2倍差异，ph稳定性显著优于母体肽idr-1018（酸性或碱性环境下mic变化最高可达4倍）。该特性可方便药物在特殊体内外环境下的应用。
实施例4
idr-1018衍生肽1018m、d1018的溶血性研究
溶血性是衡量抗菌肽是否适用于静脉注射治疗的重要指标，具体操作如下：
取6周龄spf级的icr雌鼠，眼球取血，使用肝素钠抗凝管收集。采集的血液于4℃，1500rpm离心10min，用10mmpbs（ph7.3）重复洗涤红细胞三次，至上清无色透明，制成8%的红细胞悬浮液。
将样品肽溶解于无菌0.9%生理盐水中，配制成浓度为128µg/ml的母液，2倍倍比稀释至终浓度为1µg/ml。各取100µl红细胞悬浮液和抗菌肽溶液加入到96孔板中，红细胞终浓度为4%（体积浓度）。
将混合液置于37℃恒温培养箱静置孵育，1h后，4℃，1500rpm离心5min，将上清吸取至96孔板中，使用酶标仪在540nm下检测紫外吸光值。在相同条件下测定生理盐水和0.1%tritonx-100，分别为0%和100%溶血对照实验。溶血程度计算公式如下：
溶血度（%）=[（abs540nm抗菌肽－abs540nm生理盐水）／（abs540nm0.1%tritonx-100－abs540nm生理盐水）]×100%
实验结果如图5所示。抗菌肽1018m和d1018在128μg/ml浓度下溶血率为0%和2.2%具有极低的溶血性，不易引起哺乳动物红细胞破裂溶解而产生伤害，因此十分有利于在医药领域中进一步的开发应用。
实施例5
idr-1018衍生肽1018m、d1018抗生物膜效果
1、结晶紫染色法
为了研究fdlps对生物膜形成的影响，s.aureusatcc43300稀释于tsb培养基中浓度为1×108cfu/ml，并在96孔板中进行培养，每孔200μl。在96孔板中加入连续2倍稀释的1018m、d1018，未加抗菌物质的孔为阴性对照空，新鲜tsb培养基孔为空白对照孔，将培养板放入37℃培养箱中培养24h。用移液枪将每孔中的培养基上清小心吸弃，之后pbs清洗3次，自然晾干。每孔加入100ul2.5%戊二醛，90min然后弃掉固定液，再用pbs缓冲液洗两次；用0.1%结晶紫100ul染色15min，用蒸馏水冲去染液，室温干燥；再用200ul95%乙醇溶解30min，波长570测od值。结果如图6所示，由图6可知，1018m、d1018以浓度依赖性的方式抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的形成。经32和64μg/ml1018m处理24h后，s.aureusatcc43300生物膜量百分比下降78.9%及91.4%。经4、8、16、32和64μg/mld1018处理24h后，s.aureusatcc43300生物膜量百分比下降16.7%、30.8%、76.2%、86.9%及82.8%。说明1018m、d1018能够有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，且效果显著高于母体肽。
2、扫描电镜法
将培养至对数中期的s.aureusatcc43300用tsb培养基制备成1×108cfu/ml的菌悬液；菌悬液加入48孔板中，每个孔板中放置一个无菌引导片，用来附着生物膜。加入64μg/ml1018m、d1018，37℃恒温培养箱培养24h后取出引导片，无菌生理盐水冲洗引导片三次，去除浮游菌；在4℃条件下，2.5%戊二醛固定15min，无菌生理盐水漂洗三次；用乙醇（50%-70%-85%-95%×2-100%×2）梯度脱水，每次5min，室温干燥，用离子溅射仪使样品表面形成一层金属膜，扫描电子显微镜观察。结果如图7所示，由图7可知，阴性对照组呈现菌体成团聚在一起，片状呈现；添加64μg/ml母体肽idr-1018及衍生肽1018m、d1018，细菌的菌团明显减少，衍生肽1018m、d1018组只有零星细菌团，且菌体形态严重受损，这表明衍生肽1018m、d1018对s.aureu生物膜生成具有有效的抑制作用，且抑制效果显著高于母体肽。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110>宁波大学
<120>免疫调节因子idr-1018衍生肽及其应用
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>12
<212>rna
<213>1018m肽的氨基酸序列
<400>1
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<213>d1018肽的氨基酸序列
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1.免疫调节因子idr-1018衍生肽，其特征在于：该衍生肽为1018m肽或/和d1018肽，其中1018m肽的氨基酸序列如seqidno:1所示，d1018肽的氨基酸序列如seqidno:2所示。
2.根据权利要求1所述的免疫调节因子idr-1018衍生肽的制备方法，其特征在于：以idr-1018母体肽序列为基础，将第4-7和9位的氨酸残基i、v、a、v、i替换为r、w、w、r、r，得到一个突变体抗菌肽1018m，其氨基酸序列如seqidno:1所示。
3.根据权利要求1所述的免疫调节因子idr-1018衍生肽的制备方法，其特征在于：以idr-1018母体肽序列为基础，对抗菌肽idr-1018进行d型氨基酸替换，得到一个新型衍生肽d1018，其氨基酸序列如seqidno:2所示。
4.编码权利要求1所述的免疫调节因子idr-1018衍生肽的基因，其特征在于：所述的1018m肽的核苷酸序列如seqidno:3所示。
5.编码权利要求1所述的免疫调节因子idr-1018衍生肽的基因，其特征在于：所述的d1018肽的核苷酸序列如seqidno:4所示。
6.含有权利要求4或5所述基因的表达盒。
7.含有权利要求4或5所述基因或权利要求6所述表达盒的载体。
8.含有权利要求4或5所述基因、权利要求6所述表达盒或权利要求7所述载体的转基因细胞系或工程菌。
9.权利要求1所述的idr-1018衍生肽在制备治疗细菌感染的抗菌药物或组合物中的应用。
10.权利要求1所述的idr-1018衍生肽在制备抗生物膜药物或组合物中的应用。
技术总结