本发明属于生物工程领域，涉及一种模拟表位肽，具体来说是一种能够抑制肾组织il-6信号和铁死亡的模拟表位肽及其应用。
背景技术：
慢性肾脏病(ckd)是指由许多不同的疾病引起的持续并超过3个月以上的不可逆转的肾脏结构和功能障碍，主要包括肾脏的病理损伤、血液或尿液成分异常、影像学检查异常，或其他不明原因导致的肾小球滤过率(gfr)的下降(<60ml/min·1.73m2)。引起ckd的疾病包括原发的、继发的肾小球肾炎、肾小管、间质损伤和肾血管的病变等。肾脏病理提示肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化，生化检查提示氮质血症、贫血、维生素d、钙和磷酸盐代谢异常等。
各种ckd尽管病因不同，各种致病因素所导致的肾小球毛细血管压力的增高导致了肾小球基底膜电荷丢失、增厚，足细胞数量减少、足突消失，系膜扩张，这些病理改变促使了肾小球发生硬化。随着病理损伤的不断进展，肾小球和间质不断被细胞外基质(ecm)所取代，加之在原发病的影响下，肾脏自身免疫性炎症和肌成纤维细胞的增殖活化，这些因素共同导致了肾小球和间质逐渐发生纤维化，患者肾功能不断丧失，最终肾功能发生衰竭，进入终末期肾病(esrd)(nogueiraa,etal.pathophysiologicalmechanismsofrenalfibrosis:areviewofanimalmodelsandtherapeuticstrategies.invivo.2017jan2；31(1):1-22.；websterac,etal.chronickidneydisease.lancet.2017mar25；389(10075):1238-1252.)。
由于肾脏在致病环境下不断发生纤维化，致使ckd患者加速进入esrd期，最终迫使患者不得不选择肾脏替代治疗。现今，据世界卫生组织统计，每年死于ckd及其并发症的患者占总疾病死亡人数的1.5％，并预测到2030年，这一数字将达到14％。然而，目前在临床上几乎没有药物能有效干预人类ckd和动物模型中的肾脏纤维化。因此，寻找一种新型的治疗药物用于早期预防ckd患者的肾脏纤维化进程，不仅可以大大提高患者的生存时间和生活质量，而且可以有效减少社会对此投入的大量医疗资源。
白介素-6(il-6)是一种具有多种生物学功能的多效性细胞因子。il-6通过结合细胞膜上的il-6受体(mil-6r)以及可溶性il-6受体(sil-6r)而发挥多种生物学功能。特定细胞il-6表达失调在自身免疫疾病的发病机制中发挥了重要作用(tanakat,etal.aneweraforthetreatmentofinflammatoryautoimmunediseasesbyinterleukin-6blockadestrategy.seminimmunol2014feb；26(1):88-96；hiranot,etal.biologicalandclinicalaspectsofinterleukin6.immunoltoday1990dec；11(12):443-9；akiras,etal.interleukin-6inbiologyandmedicine.advimmunol1993；54:1–78.)。
近年来，il-6在肾纤维化中的潜在致病作用也逐渐被挖掘出来。例如，在肾纤维化进程中，肾损伤分子-1(kim-1)在肾小管上皮细胞(tecs)中的持续表达可刺激tecs分泌il-6，从而吸引炎症细胞，增强肾脏的炎症效应，继而引起纤维化反应(lium,etal.signallingpathwaysinvolvedinhypoxia-inducedrenalfibrosis.jcellmolmed.2017；7:1248-59)。此外，在肾组织缺氧的环境下，腺苷作为一种低氧诱导的信号分子，可增加肾组织中il-6的分泌，而il-6则可以通过促进胶原的生成，促进肾纤维化进程(lium,etal.signallingpathwaysinvolvedinhypoxia-inducedrenalfibrosis.jcellmolmed.2017；7:1248-59)。
因此，如能利用药物在肾纤维化早期干预il-6及其相关信号，可能改善患者的预后，提高患者的生存时间和生活质量，有效减少社会对此投入的大量医疗资源。
人源化的靶向il-6r单克隆抗体(tocilizumab，
然而，作为一种单克隆抗体药物，tocilizumab仍然存在不足之处：(1)在临床上有些患者对单克隆抗体药物的应答不佳或产生抗药性；(2)需要反复多次长期使用；(3)药物的不良事件影响了单克隆抗体药物的使用；(4)基于我国国情，由于患者个体的经济承受力差别很大，单克隆抗体药物的价格在临床应用中是一个无法回避的问题，大量患者因为无法承受高昂的治疗费用而无法选择单克隆抗体药物(singhja,saagkg,bridgessljr,aklea,bannururr,sullivanmc,vaysbrote,mcnaughtonc,osanim,shmerlingrh,curtisjr,furstde,parksd,kavanaugha,o'dellj,kingc,leonga,mattesonel,schousboejt,drevlowb,ginsbergs,groberj,stclairew,tindalle,milleras,mcalindont；americancollegeofrheumatology.2015americancollegeofrheumatologyguidelineforthetreatmentofrheumatoidarthritis.arthritiscareres(hoboken).2016jan；68(1):1-25；woodworthtg,denbroederaa.treatingtotargetinestablishedrheumatoidarthritis:challengesandopportunitiesinaneraofnoveltargetedtherapiesandbiosimilars.bestpractresclinrheumatol.2015aug-dec；29(4-5):543-9)。因此这些单克隆抗体临床弊处则有待进一步解决。
模拟表位肽是一种小分子多肽，其能够通过诱导机体的免疫系统，产生主动免疫靶向靶分子，从而起到阻断靶分子信号、抑制靶分子生物学功能、治疗疾病的作用。中国专利公开号cn104945485b(公开日2018.11.13)公开四种tocilizumab的模拟表位肽。用该模拟表位肽免疫刺激机体产生的抗体，不仅能识别模拟表位，还能够识别il-6r从而抑制il-6信号的活性，产生与tocilizumab单抗同样的效果。但是该模拟表位肽存在生物稳定性差易在体内降解、缺乏延展性和肽链短小所致的抗原性的不足，也未提及该模拟表位肽在肾脏疾病领域中的应用。
因此，需要开发一种新的模拟表位肽以解决现有技术中存在的缺陷。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种能够抑制肾组织il-6信号和铁死亡的模拟表位肽及其应用，所述的这种能够抑制肾组织il-6信号和铁死亡的模拟表位肽及其应用要解决现有技术中的模拟表位肽生物稳定性差、易在体内降解、缺乏延展性和肽链短小所致的抗原性的不足的技术问题。
本发明提供了一种模拟表位肽，其氨基酸序列如seqidno:1所示。
seqidno:1的氨基酸序列如下：
ktmsaeefdnwlgggsgggs。
进一步的，所述的模拟表位肽是由seqidno:2所示的tocilizumab模拟表位肽的c端与seqidno:3所示的延长肽的n端连接而成；
tocilizumab模拟表位肽段的氨基酸序列如下：
n基端→c末端ktmsaeefdnwl(seqidno:2)；
延长肽：n基端→c末端gggsgggs(seqidno:3)。
本发明还提供了编码上述模拟表位肽的基因，其包括tocilizumab模拟表位肽的编码基因，以及延长肽的编码基因。
在多肽的氨基酸序列已知的情况下，每个氨基酸残基对应的密码子可以是一种或多种，基于此，可以根据需要采用现有技术手段做出不同的密码子连接组合，每条多肽对应的多个密码子组合形成的不同编码基因，均在本发明的保护范围之内。
本发明的模拟表位肽的编码基因，可以为不同的密码子组合形成的多条dna序列中的任意一条。
本发明优选的模拟表位肽的编码基因序列如seqidno:4所示。(aagacgatgagtgctgaggagtttgataattggctg)
本发明还提供了一种表达载体，含有上述的编码基因。
本发明还提供了一种细胞系，含有上述的编码基因。
本发明还提供了一种宿主菌，含有上述的编码基因。
本发明还提供了上述模拟表位肽的应用，其可用于作为抗原免疫动物制备多克隆抗体。
本发明还提供了一种由上述模拟表位肽免疫动物制备得到的多克隆抗体；该抗体可以特异性识别il-6r位点。
本发明还提供了上述模拟表位肽在制备用于预防和/或治疗慢性脏器纤维化疾病的药物的应用。
其中，所述的慢性脏器纤维化疾病为慢性肾纤维化疾病、慢性肝脏纤维化疾病、慢性心肌纤维化疾病或慢性肺纤维化疾病；
本发明还提供了上述多克隆抗体在制备用于预防和/或治疗慢性纤维化疾病的药物的应用。
其中，所述的慢性脏器纤维化疾病为慢性肾纤维化疾病、慢性肝脏纤维化疾病、慢性心肌纤维化疾病或慢性肺纤维化疾病。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明的模拟表位肽通过免疫动物后不仅能靶向纤维化疾病中重要的信号il-6r通路，并且能抑制组织铁死亡信号，从而两方面抑制纤维化信号通路。因此本发明模拟表位肽所引起的主动免疫能产生同单克隆抗体相似的治疗效果，同时提高了特异性(靶向疾病特异性靶点)，且成本低(多肽合成价格低廉)、安全(多肽合成过程无感染源)、不需要反复用药(类似疫苗，只需免疫3-4次)和副作用小(不涉及种属异质性)，因此优于单克隆抗体生物治疗。
本发明的模拟表位肽在保留原有tocilizumab模拟表位肽的原有功能的同时，通过增加延长肽从而提高多肽的延展性和稳定性，同时由于肽链长度的增加，使本发明提出的模拟表位肽的抗原性大大增加。在实施发明的过程中，本发明不需借助再偶联大分子的载体(如:klh)即可使本发明在动物体内达到足够高的、能发挥生物学作用的效价，而原tocilizumab模拟表位肽则需借助大分子的载体。同时，本发明首次验证了模拟表位肽在慢性肾病肾脏纤维化的效果。
应用本发明的模拟表位肽处理单侧输尿管结扎法构建的小鼠肾纤维化模型后，masson显示小鼠肾脏纤维化程度显著缓解，免疫组化实验提示肾组织内纤维化相关蛋白的表达显著下降，肾组织内和脾脏巨噬细胞数量显著下降，机制研究提示小鼠il-6和组织铁死亡信号通路受到了抑制。
附图说明
图1是运用masson染色对采用单侧输尿管结扎法进行肾纤维化模型的肾脏进行染色的结果。其中柱状图中横坐标表示动物组别，纵坐标表示masson染色强度。
图2是运用免疫组化法对模型动物肾组织进行纤维化相关蛋白：纤连蛋白(fibronectin),抗平滑肌抗体(sma),胶原1(collageni)的检测结果。图2a为结果代表图；图2b、c、d为数据量化图，其中三个柱状图中横坐标均表示动物组别，纵坐标分别表示三种蛋白的化学染色强度。
图3是运用免疫组化法对参与实验的动物肾组织进行巨噬细胞(f4/80)的检测结果。图3a为结果代表图；图3b为数据量化图，其中柱状图中横坐标表示动物组别，纵坐标表示化学染色强度(巨噬细胞标记物)。
图4是运用流式细胞术对模型动物脾脏巨噬细胞(f4/80)的检测结果。图4a为结果代表图；图4b为数据量化图，其中柱状图中横坐标表示动物组别，纵坐标表示数量百分比(巨噬细胞标记物)。
图5是运用流免疫印迹实验检测模型动物肾组织il-6下游及铁死亡抑制信号通路的检测结果。图5a为结果代表图；图5b-h分别为7个指标数据的量化图，其中柱状图中横坐标表示动物组别，纵坐标分别表示5个指标的条带化学发光强度。β-actin为内部参照条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
生物材料及试剂来源：
图像染色的指标应用imageproplus5.0软件进行分析，免疫印迹的实验结果应用imagej软件进行分析，流式细胞术结果应用仪器自带软件进行分析，量化后的数据的结果通过单因素方式分析(oneanova)进行统计，统计软件为graphpad6.0。
实施例1模拟表位肽的合成、动物免疫
模拟表位肽的合成：按照seqno.1的氨基酸序列委托北京赛百盛基因技术有限公司合成模拟表位肽，纯度>98％。
合成方法为国际上公认的高效液相色谱法合成，本领域的技术人员都熟知，在此不再赘述。
同时以序列为seqidno.5(aiplvvpfyshsgggsgggs)的多肽为对照组用于实验。
每次免疫的剂量为100μg/ml，应用的佐剂为完全弗式佐剂(第一次免疫)和不完全弗式佐剂(后续免疫)。将多肽溶于生理盐水中(浓度为0.2mg/ml的抗原溶液)，后与等体积的弗氏完全佐剂(或不完全弗式佐剂)双推法混匀(此时抗原浓度约0.1mg/ml)，后在小鼠腹部或者腹股沟皮下多点注射，注意观察到皮下隆起及小丘形成。c57/b6小鼠由杭州师范大学提供并饲养。动物在uuo法造模前第1、22、43天免疫，共3次。后进行单侧输尿管结扎法(uuo)法进行肾纤维化模型的制作。
实施例2肾脏纤维化模型的建立
应用uuo法建立肾脏纤维化模型。
10周龄大小的健康雄性c57/b6小鼠。
腹腔注射0.6％戊巴比妥钠溶液(按照100μl/10g)麻醉，左下腹备皮，依次切开皮肤、浅深筋膜、腹膜，用镊子拨开小肠暴露出左侧输尿管，用弯聂挑起左侧输尿管中下段1/3处，用直镊和止血钳协助将丝线从左侧输尿管下方穿过，两端结扎输尿管，在两次结扎线的中间部位剪断输尿管，将输尿管复位严谨牵拉，然后连续缝合切口，放到37度孵育半小时，以防小鼠体温下降死亡。于uuo后第14天处死动物，每组6只，留取小鼠肾组织进行后续实验。
下列实施例3-5的实验分别分成四组进行：
分别为假手术组(sham)、模型组(uuo)、对照多肽组(seqno.5的多肽)(uuo cp)和实施例1的模拟表位肽组(uuo tm)。
实施例3肾脏组织学分析(包括masson染色、纤维化相关分子染色和巨噬细胞染色)
一、masson染色方法为：
1、切片常规脱蜡至水，用配制好的weigert铁苏木素染色5～10min。
2、用酸性乙醇分化液分化，水洗。
3、用masson蓝化液返蓝，水洗。
4、蒸馏水洗1min。
5、丽春红品红染色液染色5～10min。
6、在上述操作过程中按蒸馏水:弱酸溶液＝2:1比例配制弱酸工作液，用弱酸工作液洗1min。
7、磷钼酸溶液洗1～2min。
8、用配制好的弱酸工作液洗1min。
9、直接入苯胺蓝染色液中染色1～2min。
10、用配制好的弱酸工作液洗1min。
11、95％乙醇快速脱水。无水乙醇脱水3次，每次5～10s。
12、二甲苯透明3次，每次1～2min。中性树胶封固。
二、组织化学染色方法为(包括纤维化相关分子染色和巨噬细胞染色)：
肾组织取下后即刻放入4％的多聚甲醛中，4℃放置24小时候取出，后转入70％的乙醇在-20℃长期保存。进行组织化学染色实验时，将组织从冰箱取出复温，后用微波炉进行抗原修复(6min*4次，已沸腾为有效时间)，室温下凉片2-3h，画圈笔画圈。用含有triton-x的bsa(抗体封闭液)封闭，室温下封闭30min。
用pbs稀释的纤维化相关分子(fibronectin,sma,collageni)和巨噬细胞标记物f4/80抗体(1:400稀释)，每张切片滴加适量抗体稀释液，放入湿盒4度孵育过夜。放入盛有1×pbs的洗片盒中摇床上清洗3次，每次5min。10％羊血清稀释hrp标记的二抗(1:200)，每张切片滴加适量二抗，室温下孵育1h。dab显色封片，显微镜下照相采图。
masson实验结果见图1：结果说明模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)的肾纤维化程度比假手术组(sham组)显著提高，模拟表位肽处理组(uuo tm组)的肾纤维化程度相比于模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)的纤维化程度显著减轻。图1柱状图为纤维化程度的量化结果，***表示p<0.001，具有显著统计学意义。
免疫组化实验结果见图2：结果显示模拟表位肽处理组的肾纤维化相关蛋白(fibronectin,sma,collageni)的表达程度相比于模型组和对照对肽组显著减轻。
图2中，a图为四组的fibronectin、sma、collageni3个纤维化蛋白的表达情况。模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)的3个纤维化蛋白表达比假手术组(sham组)显著提高，模拟表位肽处理组(uuo tm组)的3个纤维化蛋白表达比于模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)的显著减轻。图2b、图2c、图2d柱状图为3个不同纤维化蛋白的量化结果，*表示p<0.05，***表示p<0.001，具有显著统计学意义。
免疫组化实验结果见图3a：结果说明模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)的肾组织内f4/80 阳性巨噬细胞的浸润程度比假手术组(sham组)显著提高，模拟表位肽处理组(uuo tm组)的肾组织内f4/80 阳性巨噬细胞的浸润程度相比于模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)的显著减轻。图3b柱状图为纤维化程度的量化结果，**表示p<0.01，***表示p<0.001，具有显著统计学意义。
实施例4流式细胞术检测脾脏中巨噬细胞亚群的变化
将uuo第14天小鼠麻醉，置于杀鼠板上固定，pbs灌注后，将脾脏置于放有rpmi1640培养基的大皿中，用载玻片研磨脾脏，用尼龙膜过滤悬液，去掉沉渣。4度1200rpm离心4min。弃去上清，加入红细胞裂解液重悬，室温裂红5min，加入pbs以终止裂红。1200rpm离心4min，弃去上清，以流式液重悬脾脏细胞，流式染色分析备用。充分混匀4度封闭10min，将稀释好的抗f4/80抗体(1:100)加到盛有细胞的流式管中，充分混匀，冰上染色25min。流式液洗涤后，将带有荧光标记的二抗稀释(1:100)，抗体稀释液重悬细胞，充分混匀，冰上染色15-20min，注意避光。加入流式液洗涤，离心，然后上机分析。
流式细胞术结果见图4：结果显示模拟表位肽处理组的脾脏f4/80 巨噬细胞数量相比于模型组和对照对肽组显著减少。
图4a结果说明模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)的脾脏f4/80 巨噬细胞数量比假手术组(sham组)显著提高，模拟表位肽处理组(uuo tm组)的脾脏f4/80 巨噬细胞数量相比于模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)的显著减少。图4b所示柱状图为纤维化程度的量化结果，**表示p<0.01，***表示p<0.001，具有显著统计学意义。
实施例5westernblot检测组织中il-6下游信号及铁死亡信号的变化
获得肾脏组织后提取组织蛋白，后运用bca法测蛋白浓度。上样后恒定电压进行电泳。恒定电流进行湿式电转法将蛋白转移至pvdf膜上。用tbst配制5％牛血清白蛋白封闭液于室温条件下封闭1hr，摇床上轻摇。将il-6下游信号蛋白(pstat3、perk、stat3、erk)、铁死亡信号抑制蛋白(xct、gpx4、ferritin)和内参蛋白(β-actin)(以1：1000稀释)与pvdf膜共同孵育,4℃条件下于摇床上轻摇过夜。洗涤后加入hrp标记的抗兔二抗(以1：3000稀释)。漂洗二抗，化学发光法显色，照相并保存实验结果。免疫印迹实验见图5：结果提示模拟表位肽处理组的tocilizumab下游信号相比于模型组和对照对肽组的受到显著抑制。
wb实验结果见图5：图5a图为il-6下游信号蛋白(pstat3、perk、stat3、erk)、铁死亡抑制信号蛋白(xct、gpx4、ferritin)和内参蛋白(β-actin)的条带显示图，条带越深代表表达越强，结果说明：(1)模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)的perk蛋白水平比假手术组(sham组)显著提高，代表il-6下游erk信号的活化。模拟表位肽处理组(uuo tm组)的perk蛋白水平相比于模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)显著减轻。(2)模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)的xct、gpx4、ferritin蛋白水平比假手术组(sham组)没有显著区别，代表铁死亡信号并没有发生显著变化。模拟表位肽处理组(uuo tm组)的xct、gpx4、ferritin蛋白水平相比于模型组(uuo组)和对照对肽组(uuo cp)显著提高，代表铁死亡信号受到显著抑制。下方图5b、图5c、图5d、图5e、图5f、图5g、图5h柱状图为上述各蛋白水平的量化结果，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，均具有统计学意义。
序列表
<110>上海市第五人民医院
<120>一种能够抑制肾组织il-6信号和铁死亡的模拟表位肽及其应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
lysthrmetseralagluglupheaspasntrpleuglyglyglyser
151015
glyglyglyser
20
<210>2
<211>12
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
lysthrmetseralagluglupheaspasntrpleu
1510
<210>4
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
glyglyglyserglyglyglyser
15
<210>4
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
aagacgatgagtgctgaggagtttgataattggctg36
<210>5
<211>20
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
alaileproleuvalvalprophetyrserhisserglyglyglyser
151015
glyglyglyser
20
1.一种模拟表位肽，其特征在于：其氨基酸序列如seqidno:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种模拟表位肽，其特征在于：由seqidno:2所示的tocilizumab模拟表位肽的c端与seqidno:3所示的延长肽的n端连接而成。
3.编码权利要求2所述的模拟表位肽的基因，其特征在于：包括tocilizumab模拟表位肽的编码基因，以及延长肽的编码基因。
4.编码权利要求1或者2所述的模拟表位肽的基因，其特征在于：其碱基序列如seqidno:4所示。
5.一种表达载体，其特征在于：含有权利要求3或者4所述编码基因。
6.一种细胞系，其特征在于：含有权利要求3或者4所述编码基因。
7.一种宿主菌，其特征在于：含有权利要求3或者4所述编码基因。
8.一种多克隆抗体，其特征在于：由权利要求1或者2所述的模拟表位肽作为抗原免疫动物制备得到。
9.权利要求1或者2所述的模拟表位肽在制备用于预防和/或治疗慢性脏器纤维化疾病的药物的应用。
10.权利要求8所述的多克隆抗体在制备用于预防和/或治疗慢性纤维化疾病的药物的应用。
技术总结