本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗菌肽rg-27及其应用。
背景技术：
世界上发现的第一种抗菌肽是天蚕素，于1975年由瑞典科学家g.boman发现，是一种具有抗菌活性的多肽物质。随后又在生物体内陆续发现了多种抗菌肽，如蛙皮素（magainsmelittin）、防御素（defensins）等，目前世界上已知的抗菌肽有2500多种。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为抗菌肽，然而国内外研究表明，抗菌肽不仅有广谱抗细菌能力，对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强大的杀伤作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续感染。自从发现抗菌肽以来，人们已对抗菌肽的作用机理进行了大量研究，目前已知其作用机理是抗菌肽作用于细菌细胞膜，可通过增加细胞膜的通透性来杀死微生物。
近年来抗生素滥用问题日益严重，抗生素滥用可导致细菌耐药、肠道菌群错乱、免疫系统摧毁等问题，越来越多的科研人员开始寻求抗生素的替代品。而抗菌肽作为重要的先天免疫分子，具有广谱抗菌活性、不易产生耐药性及错杀肠道菌群，已经成为最具潜力的抗生素替代品之一，具有广泛的市场前景。
目前相当部分天然抗菌肽存在热稳定性和酸碱稳定性差，溶血及细胞毒性副作用强等弊端，影响了抗菌肽的应用。基于此，对抗菌肽进行结构设计和改造，提高抗菌肽的活性和稳定性，降低毒副作用，成为当今生物技术领域的研究热点之一。
技术实现要素：
为了克服天然抗菌肽的不足，本发明的目的在于：提供一种抗菌肽rg-27及其应用。
一种抗菌肽，名为rg-27,其全序列为：nh2-arg-gly-arg-lys-lys-lys-gly-ile-gly-phe-val-gly-ile-ser-val-val-lys-lys-leu-phe-trp-trp-lys-ser-ile-pro-phe-cooh。
所述抗菌肽rg-27为人工设计合成的多活性多肽，为α螺旋直链多肽，其中rg为该肽前2个氨基酸残基的缩写，27为氨基酸残基数，该抗菌肽分子量大小为3162.86da，等电点为12.24。
所述的抗菌肽的用途，rg-27在制备治疗革兰氏阴性菌或者革兰氏阳性菌感染的广谱抗菌药物中的应用。
所述的抗菌肽的用途，rg-27在制备食品添加剂中的应用。
所述的抗菌肽的用途，rg-27在制备饲料添加剂中的应用。
所述的抗菌肽的用途，rg-27在制备化妆品防腐剂中的应用。
本发明rg-27具有光谱抗菌活性，对多数革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有不同程度的抑菌活性。同天然抗菌肽相比，gr-27对常见致病菌的抑菌活性显著增强，同时具有溶血毒副作用小，热稳定性良好，耐酸碱稳定性的特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例1：
本发明抗菌肽rg-27的氨基酸序列为：nh2-arg-gly-arg-lys-lys-lys-gly-ile-gly-phe-val-gly-ile-ser-val-val-lys-lys-leu-phe-trp-trp-lys-ser-ile-pro-phe-cooh。序列特征为：α螺旋直链多肽，氨基酸残基数为27，该抗菌肽分子量大小为3162.86da，等电点为12.24，属于碱性肽。
本发明实施例抗菌肽rg-27产品采用固相合成策略人工合成，最终得到的rg-27粗肽经过反相制备色谱纯化、纳滤、冻干得到纯度大于98%的rg-27精肽，具体制备方法包括以下步骤：
1)树脂溶胀：称取100g替代度为0.35mmol/g的wang树脂，加到固相反应柱中，加dmf(10ml/g),溶胀半小时，抽干。
2)偶联第一个氨基酸：称取2倍当量的fmoc-phe-oh,2.2倍当量的hobt用dmf溶解（10ml/g起始树脂重）澄清后，低温下加入2.2倍当量的dic,0.2倍当量的dmap到氨基酸溶液中，活化5分钟后加入到上述固相反应柱中反应6小时，抽干。用dmf（10ml/g起始树脂重）洗涤树脂3遍，抽干。
3)脱保护：用20%的哌啶的dmf溶液脱保护树脂2次，第一次5min，dmf用量（10ml/g起始树脂重），第二次15min，dmf用量（10ml/g起始树脂重）。用dmf洗涤树脂6遍，每次dmf用量（10ml/g起始树脂重），洗涤干净，取树脂，茚三酮检测反应完全。
4)偶联第二个氨基酸：称取2倍当量的fmoc-pro-oh,2.2倍当量的hobt用dmf溶解（10ml/g起始树脂重）澄清后，低温下加入2.2倍当量的dic到氨基酸溶液中，活化5分钟后加入到上述固相反应柱中反应2~3小时，茚三酮检测反应完全，抽干。用dmf（10ml/g起始树脂重）洗涤树脂3遍，抽干。
5)脱保护：用20%的哌啶的dmf溶液脱保护树脂2次，第一次5min，dmf用量（10ml/g起始树脂重），第二次15min，dmf用量（10ml/g起始树脂重）。用dmf洗涤树脂6遍，每次dmf用量（10ml/g起始树脂重），洗涤干净，取树脂，茚三酮检测反应完全。
6)重复第4步偶联和第5步脱保护操作，从c端到n端依次偶联第3个到第27个氨基酸。
7)将1-27个氨基酸全部偶联完毕，脱保护dmf洗涤6遍后，用dcm洗涤3遍，真空干燥。
8)裂解：将树脂在常温下用裂解液（tfa/tis/h2o,v/v/v,95/2.5/2.5,干燥后树脂重量的8倍）裂解，过滤，滤液减压浓缩掉1/2体积，加入到异丙醚（滤液浓缩液剩余体积的8倍）中沉降，离心，过滤，常温真空干燥得到rg-27粗肽。
9)制备及冻干：将rg-27粗肽用反相制备柱（re-hplc）制备(a相0.1%tfa,b相乙醇)按照反相梯度洗脱（20%-65%b相，30分钟）得到合格馏分，合并后减压浓缩，冷冻干燥，得到高纯度（大于98%）的rg-27精肽。
10)包装：将冻干精肽rg-27用密封避光保存在2-8℃冰箱。
11)抗菌肽rg-27的制备方法中，dmf指n,n-二甲基甲酰胺，dcm指二氯甲烷，dmap指n,n-二甲基吡啶，hobt指1-羟基苯并三氮唑，dic指二异丙基碳二亚胺，tfa指三氟乙酸，tis指三异丙基硅烷。其中用量取最优值，在本制备方法上通过对原料取用树值进行变化或者取相似物对原料进行替换，进而获取抗菌肽rg-27,也应该视为本发明的保护范围。
实施例2：抗菌肽rg-27的最小抑菌浓度（mic）的测定
对比例天蚕素cecropina:序列如下：nh2-lys-trp-lys-leu-phe-lys-lys-ile-glu-lys-val-gly-gln-asn-ile-arg-asp-gly-ile-ile-lys-ala-gly-pro-ala-val-ala-val-val-gly-gln-ala-thr-gln-ile-ala-lys–cooh,由37个氨基酸残基组成，分子量4004.77。
将细菌接种于肉汤固体培养基上，培养至长出单菌落，挑取单菌落接种于5ml肉汤培养基中，放入摇床培养至菌液浑浊，取50ul菌悬液转接至5ml新鲜肉汤培养基中，恒温震荡培养至0d600=0.5左右；取菌悬液10ul转接至10ml新鲜肉汤培养基中涡旋混匀，控制浓度在1x105-5x105cfu/ml，用于mic的测定;将抗菌肽（rg-27,天蚕素cecropina,抗生素金霉素）进行梯度稀释，至终浓度为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125（ug/ml）,共13个系列浓度的稀释液。先向无菌96孔圆底板加入90ul制备好的细菌悬液，再逐一加入10ul相应浓度的稀释液，每种抗菌物质做三个重复，另外设阳性对照孔为不加抗菌物质，只加100ul菌悬液，阴性对照孔加100ullb培养基；将96孔板至于37℃生化培养箱中保湿静置培养18-24小时，培养完后观察各孔底部是否有细菌沉淀，无肉眼可见细菌沉淀的最小浓度可判定为抗菌物质的最小抑菌浓度（mic）。
表一：
从上表可以看出，rg-27和天蚕素cecropina均对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有抑菌效果，但是对比可知实施例组的抗菌肽rg-27的最小抑菌浓度mic值均明显小于对比组天蚕素cecropina，说明抗菌肽rg-27的抑菌效果比抗菌肽天蚕素cecropina的抑菌效果更显著，可见本发明抗菌肽rg-27具有较好的研究开发价值。
实施例3：抗菌肽rg-27的溶血副作用的测定
采集新鲜的大鼠血液，待静置分层，去除上层血清，加入生理盐水，用吸管轻轻吹散管底的红细胞，1200转离心5分钟，用吸管小心吸取上层生理盐水并弃去，直至上清液没有红色。取底部压实的红细胞2滴，加入2.0ml的等渗pbs重悬红细胞，配置成4%血红细胞悬液。
实验组：加入50ul不同浓度的，用等渗pbs溶解的抗菌肽rg-27,然后加入50ul配置好的4%血红细胞悬液。
阳性对照：每一个孔加入50ul2%的tritonx-100，50ul配置好的血红细胞悬液。阴性对照：每一个孔加入50ul等渗pbs,50ul配置好的4%血红细胞悬液。
37℃孵育1小时后，1000转离心96孔板5分钟后，各孔板吸取50ul上清到96孔板中，414nm波长测定od值，计算溶血百分比=[(实验孔od值-阴性孔od值)/(阳性孔od值-阴性孔od值)]x100。
结果表明，在所有测得的最小抑菌值浓度下，抗菌肽rg-27对红细胞的溶血率与阴性对照相当。当抗菌肽rg-27的浓度达到134um时，其对红细胞的溶血率不到5.88%，说明本发明的抗菌肽rg-27对红细胞的溶血作用很小。
实施例4：抗菌肽rg-27的细胞毒性测定
将分离纯化的外周围单核细胞（pbmcs）用培养基rmp1640稀释至1x106个/ml,按照
每孔90ul接种96孔板，同时设背景对照（100ul,rmpi1640培养基），低水平对照孔（90ul细胞悬液 10ulpbs）和高水平对照孔（90ul细胞悬液 10ul20%的tritonx-100）。将96孔板于37℃，5%二氧化碳培养箱中静置培养2小时；加入10ul相应浓度的抗菌肽rg-27，使抗菌肽终浓度分为为512ug/ml、256ug/ml、128ug/ml、64ug/ml、32ug/ml、16ug/ml、8ug/ml，处理6个重复。培养箱中培养24小时后，向阳性对照孔中加入10ul20%的tritonx-100，并用移液枪吹打混匀，继续培养15分钟；培养结束后，1500转每分钟离心10分钟；离心后自各自孔中小心吸取60ul细胞上清转移到透明平底96孔培养板相应孔中；每孔加入稀释好的ldh检测试剂30ul,室温避光震荡培养30分钟，酶标仪测定od492nm，od900nm，计算δod值。ldh释放率按下面公式计算：ldh释放率（%）=100%*（δod试验-δod阴性对照）/（δod阴性对照-δod阳性性对照）。
结果表明，在浓度低于256ug/ml，抗菌肽rg-27猪外周单核细胞的ldh释放率小于10%，在浓度低于512ug/ml时，抗菌肽rg-27猪外周单核细胞的ldh释放率小于15%，。说明本发明的抗菌肽rg-27的细胞毒性很低。
实施例5：抗菌肽rg-27的热稳定性测定
将rg-27分别煮沸10min，30min，60min，90min，再以金黄色葡萄球菌为指示剂进行抑菌试验。
结果表明，rg-27经100℃水浴处理90分钟，其抑菌活性不受影响，热稳定性良好。
实施例6：抗菌肽rg-27的酸碱稳定性测定
将抗菌肽rg-27加入到不同ph值的缓冲液中（ph值2-12），37℃下摇床培养24小时，以不加抗菌肽rg-27的不同ph值缓冲液为对照，做抑菌实验。
结果表明，rg-27在ph值2-12下培养24小时后，其抑菌活性不受影响，说明rg-27耐酸碱性较好。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明地精神和实质地条件下，可进行各个条件地适当改变。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
1.一种抗菌肽rg-27，其特征在于，所述抗菌肽rg-27的氨基酸序列为：
nh2-arg-gly-arg-lys-lys-lys-gly-ile-gly-phe-val-gly-ile-ser-val-val-lys-lys-leu-phe-trp-trp-lys-ser-ile-pro-phe-cooh。
2.根据权力1所述的抗菌肽rg-27,其特征在于：所述抗菌肽rg-27为α螺旋直链多肽，含有27个氨基酸残基，分子量大小为3162.86da，等电点为12.24，属于碱性肽。
3.根据权力1所述的抗菌肽rg-27,其特征在于：可以是游离的形式或者盐形式，盐形式包括但不局限于盐酸盐形式、醋酸盐形式、磷酸盐形式、三氟乙酸盐形式。
4.如权利要求1或权利要求2或权利要求3中抗菌肽rg-27应用，其特征在于：所述抗菌肽rg-27在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌或真菌感染的药物中的应用。
5.如权利要求1或权利要求2或权利要求3中抗菌肽rg-27应用，其特征在于：所述抗菌肽rg-27在食品添加剂中的应用。
6.如权利要求1或权利要求2或权利要求3中抗菌肽rg-27应用，其特征在于：所述抗菌肽rg-27在饲料添加剂中的应用。
7.如权利要求1或权利要求2或权利要求3中抗菌肽rg-27应用，其特征在于：所述抗菌肽rg-27在化妆品防腐剂中的应用。
技术总结