本发明涉及多肽化合物领域，具体涉及一系列具有双重肠促胰岛素肽类似化合物多肽化合物，其激动人胰高血糖素样肽-1(glp-1)的受体，并且可用于治疗2型糖尿病。本发明还涉及该多肽化合物药学上可接受的盐，多肽药物组合物、药剂、制备方法及其用途。
背景技术：
：代谢综合征的病因是蛋白质、脂肪及碳水化合物等多种物质的代谢异常。营养过剩、体力活动减少等会导致肥胖以及肥胖相关疾病，如糖尿病等。近年来，2型糖尿病、血脂代谢异常的发病率日益增高；2型糖尿病是最常见的糖尿病形式，占所有糖尿病的约90％。2型糖尿病的特征在于由胰岛素抗性引起的高血糖水平。目前的2型糖尿病护理标准包括饮食和运动以及可用的口服和注射降糖药物。尽管如此，许多患有2型糖尿病的患者仍然未得到充分控制。glp-1是一种37个氨基酸的肽，可刺激胰岛素分泌，保护胰腺β细胞，抑制胰高血糖素分泌，胃排空和食物摄入，从而导致体重减轻。glp-1被称为肠促胰岛素；肠降血糖素受体信号传导对葡萄糖体内平衡起关键作用的生理学相关作用。在正常生理学中，glp-1在餐后从肠道分泌，并且这些肠降血糖素增强对食物的生理反应，包括饱腹感，胰岛素分泌和营养处理。2型糖尿病患者的肠促胰岛素反应受损。目前市售的肠降血糖素类似物或二肽基肽酶iv(dpp-4)抑制剂仅利用单一的作用机制用于血糖控制；如果利用双重作用机制的2型糖尿病化合物，就可以得到降糖活性和减重效果俱佳的多肽化合物。已经发现glp-1类似物的剂量受到诸如恶心和呕吐的副作用的限制，并且因此给药通常不能达到血糖控制和体重减轻的完全功效，天然glp-1均被普遍存在的蛋白水解酶，尤其是二肽基肽酶-4(dpp-4)快速灭活，因此，只能用于短期代谢控制。dpp-4属于外肽酶类蛋白水解酶；已经知道dpp-4能快速水解glp-1序列中第7到8位的肽键，所以在序列中的7-8位和其它位点引入非天然氨基酸可以增加任何给定肽的蛋白水解稳定性；显然使用非天然氨基酸有助于肽对dpp-4蛋白水解和其他形式降解的稳定性。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术和化合物体内稳定性，降糖减重效果及副作用等存在的不足，提供一系列利用双重作用机制、具有更优的降糖活性和减重效果的glp-1激动剂多肽化合物，从而用于治疗二类糖尿病，肥胖症和心血管等方面疾病。本发明的另一个目的是提供了前述glp-1激动多肽化合物的制备方法。本发明的再一个目的是提供了前述glp-1激动多肽化合物药学上可接受的盐。本发明的又一个目的是提供了glp-1激动多肽化合物的药物组合物。本发明的又一个目的是提供了glp-1激动多肽化合物的药剂。本发明的又一个目的是提供了前述glp-1激动多肽化合物、其药学上可接受的盐、其药物组合物和药剂的用途。本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的；本发明公开了一类glp-1激动多肽化合物，其特点是，该类多肽化合物的氨基酸序列为：hxaa1egtftsdvssylexaa2qaaxaa3efiawlvrgrg，且该类多肽化合物c末端氨基酸作为羧基或羧基被酰胺化；其中：xaa1取自：xaa2取自：g，xaa1、xaa2相同或不同；r1为：含有2-6个碳原子的直链或支链烷基，r2为：h或ch3,x为：o,s或n-ch3,式中r1和r2烷基可任选地被1-6个卤素原子取代；xaa3取自：上式中，m、n为自然数，优选的n为自然数从12到20；优选的m为自然数0到3。本发明所述的glp-1激动多肽化合物，其进一步优选的技术方案是，该类多肽化合物的优选氨基酸序列为：(1)seqidno：1hx2egtftsdvssylex2qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(2)seqidno：2hx2egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(3)seqidno：3hx3egtftsdvssylex3qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(4)seqidno：4hx3egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(5)seqidno：5hx4egtftsdvssylex4qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(6)seqidno：6hx4egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(7)seqidno：7hx5egtftsdvssylex5qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(8)seqidno：8hx5egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(9)seqidno：9hx6egtftsdvssylex6qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(10)seqidno：10hx6egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(11)seqidno：11hx7egtftsdvssylex7qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(12)seqidno：12hx7egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(13)seqidno：13hx8egtftsdvssylex8qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(14)seqidno：14hx8egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(15)seqidno：15hx9egtftsdvssylex9qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(16)seqidno：16hx9egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(17)seqidno：17hx10egtftsdvssylex10qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(18)seqidno：18hx10egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(19)seqidno：19hx11egtftsdvssylex11qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(20)seqidno：20hx11egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(21)seqidno：21hx12egtftsdvssylex12qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg(22)seqidno：22hx12egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg式中：x1＝g；本发明还公开了所述的glp-1激动多肽化合物的合成方法，其特点是：(1)固相合成化合物多肽的主序列第1-31位氨基酸，其中第1-4位氨基酸采用片段boc-his(trt)xaa1glu(otbu)gly-oh，其中：其中：xaa1取自：r1为：含有2-6个碳原子的直链或支链烷基，r2为：h或ch3,x为：o,s或n-ch3,式中r1和r2烷基可任选地被1-6个卤素原子取代；(2)第20位lys采用片段fmoc-lys(xaa3)；片段结构式如下：所述的n为自然数从12到20；m为自然数0到3；(3)所用的缩合剂为dic/hobt，oxymapure/dic，hbtu/hobt/diea，pybop/hobt/diea其中的一种或多种；所用的反应溶剂为dcm、dmf、nmp、dmso中的一种或多种组合；所使用的fmoc脱除试剂为v/v25％哌啶/dmf溶液；(4)包括以下步骤：步骤一，制备fmoc-gly31-wang树脂；步骤二，制备全保护肽树脂；步骤a，将fmoc-gly31-wang树脂加入到固相反应器中；步骤b，固相合成方法逐一将fmoc-arg30(pbf)-oh、fmoc-gly29-oh、fmoc-arg28(pbf)-oh、fmoc-val27-oh、fmoc-leu26-oh、fmoc-trp25(boc)-oh、fmoc-ala24-oh、fmoc-ile23-oh、fmoc-phe22-oh、fmoc-glu21(otbu)-oh、fmoc-lys20(xaa3)-oh、fmoc-ala19-oh、fmoc-ala18-oh、fmoc-gln17(trt)-oh、fmoc-gly16-oh、fmoc-glu15(otbu)-oh、fmoc-leu14-oh、fmoc-tyr13(tbu)-oh、fmoc-ser12(tbu)-oh、boc-ser11-oh、fmoc-val10-oh、fmoc-asp9(otbu)-oh、fmoc-ser8(tbu)-oh、fmoc-thr7(tbu)-oh、fmoc-phe6-oh、fmoc-thr5(tbu)-oh、boc-his1(trt)xaa1glu3(otbu)gly4-oh偶联到fmoc-gly31-wang上；所述xaa1取自：r1为：含有2-6个碳原子的直链或支链烷基，r2为：h或ch3,x为：o,s或n-ch3,式中r1和r2烷基可任选地被1-6个卤素原子取代；所述片段fmoc-lys20(xaa3)-oh结构式如下：所述的n为自然数从12到20；m为自然数0到3。步骤三，将所述肽树脂进行裂解，得到粗肽，裂解试剂采用复合试剂，配比为：tfa:(苯甲硫醚/tis/edt/苯酚/水)＝90:5，其中捕获剂为苯甲硫醚/tis/edt/水中的任意组合。步骤四，采用反相色谱方法制备多肽化合物，反相色谱填料采用硅胶基键合的c8、c18填料，流动相采用乙腈和水溶液，其中水溶液为一定ph条件下的tfa、磷酸、硫酸溶液，或这些酸形成的钠盐、钾盐、铵盐等。本发明还公开了一类glp-1激动多肽化合物药学上可接受的盐，其特点是：所述的glp-1激动多肽化合物为以上技术方案中所述的多肽化合物，且该类多肽化合物c末端氨基酸作为c末端伯酰胺或其药学上可接受的盐被酰胺化。本发明所述的glp-1激动多肽化合物药学上可接受的盐，其优选的技术方案是：所述的盐为glp-1激动多肽化合物与下述化合物中的一种所形成的盐：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、肥酸、藻酸、马来酸、富马酸、d-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或者硫氰酸。本发明还公开了glp-1激动多肽化合物的药物组合物，其特点是，该药物组合物以上述技术方案中任意一项所述的glp-1激动多肽化合物为有效原料，或者以上述技术方案中任意一项所述的glp-1激动多肽化合物药学上可接受的盐为有效原料，再加上药学上可接受的载体或稀释剂组成。本发明所述的glp-1激动多肽化合物药学上可接受的盐，以glp-1激动多肽化合物和上述化合物为原料，再采用现有技术中公开的常规方法进行制备。本发明还公开了上述技术方案中任意一项所述的glp-1激动多肽化合物所制备的药剂，其特点是，所述的药剂是任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、酏剂、糖浆、锭剂、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、散剂、颗粒剂、块剂、乳剂、栓剂或者复方制剂，药剂由glp-1激动多肽化合物和药学上可接受的药用辅料、载体或稀释剂组成。本发明所述的药剂，可以按照现有技术常规方法进行制备。本发明记载的glp-1激动多肽化合物的用途是，它可以作为有效原料用来制备用于治疗或者预防糖尿病的药物，或者用于制备减肥药物。本发明记载的glp-1激动多肽化合物药学上可接受的用途是，它可以作为有效原料在用来制备治疗或者预防糖尿病的药物，或者用于制备减肥药物。本发明记载的glp-1激动多肽化合物的药物组合物、药剂，可以用作治疗和预防糖尿病的药物，或者用作减肥药物。在本说明书全文中，采用以下缩写的含义见下表：英文缩写中文dcm二氯甲烷dmfn-甲基吡咯烷酮hbtu苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯hobt1-羟基-苯并三氮唑diea/dipean，n'-二异丙基乙胺fmocn-9-芴甲氧羰基edt乙二硫醇hplc高效液相色谱tfa三氟乙酸tbu叔丁基作为本发明的一部分，非天然氨基酸的取代不仅对增加glp-1激动剂的体内稳定性较大的作用，而且对活性也产生了影响较大的影响。例如，当上述序列中的用不同氨基酸xaa1时，其glp-1激动剂活性有很大的变化，并且当xaa1具有手性时，其中的一个光学异构体比另一个取代的glp-1激动剂具有更强的活性。另外，脂肪酸通过其白蛋白结合基序可以通过延长半衰期来改善肽的药代动力学。虽然使用脂肪酸可以改善肽的半衰期，但申请人发现，作为本发明的一部分，脂肪酸链的长度，组成和位置以及肽和脂肪酸链之间的连接体可能具有意外对glp-1激动剂活性影响，同时延长了肽的半衰期。与现有多肽化合物和制备技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明公开了一系列利用双重作用机制、具有更优的降糖活性和减重效果的glp-1激动剂多肽化合物，本发明多肽化合物同时具备降糖、减重效果，此外心血管方面具有益处，可以作为有效原料用于制备治疗或者预防糖尿病的药物或者减肥药物。基于动物能量消耗数据证明，本发明多肽化合物具有在患者中产生体重减轻的作用，具有低免疫原性特性和支持每周一次给药的药代动力学(pk)特征。适合作为治疗糖尿病、肥胖药物的活性成分。从而用于治疗二类糖尿病，肥胖症和心血管等方面疾病。本发明制备方法所制得的glp-1激动多肽化合物降糖和减缓体重增加活性好，药效时间长，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。附图说明图1为实验中各受试药对db/db小鼠随机血糖的影响图；图2为实验中各受试药对db/db小鼠随机血糖的变化率图；图3为实验中各受试药对ob/ob小鼠的体重影响图；图4为实验中各受试药对ob/ob小鼠的体重化率图。具体实施方式本发明通过下列实施例来进行进一步的说明，但这些实施例不做任何限制本发明权利的解释。式中：x1＝g；实施例1，seqidno：1多肽化合物的合成：hx2egtftsdvssylex2qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg1.seqidno：1多肽化合物肽链的合成1.1树脂的溶胀称取wang-resin10g(取代度0.53mmol/g)，经dcm100ml溶胀30min，抽滤去dcm，再用dmf100ml溶胀30min，分别用dmf，dcm100ml冲洗干净。1.2fmoc-gly-wang-resin的合成将fmoc-gly(tbu)-oh(15mmol)，hobt(18mmol)和dic(18mmol)溶于dmf100ml中，再将此溶液加入上一步得到的树脂中反应2小时，结束后滤去反应液，用dcm和dmf各100ml洗涤树脂3次。1.3fmoc保护基的脱除向洗涤后的树脂中加入含0.1mhobt的25％哌啶/dmf(v/v)溶液脱除fmoc，反应结束后用dcm和dmf各100ml洗涤树脂3次。1.4肽链的延长按照序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到肽树脂。具体偶联保护氨基酸如下：固相合成方法逐一将fmoc-arg30(pbf)-oh、fmoc-gly29-oh、fmoc-arg28(pbf)-oh、fmoc-val27-oh、fmoc-leu26-oh、fmoc-trp25(boc)-oh、fmoc-ala24-oh、fmoc-ile23-oh、fmoc-phe22-oh、fmoc-glu21(otbu)-oh、fmoc-lys20(oct(otbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)、fmoc-ala19-oh、fmoc-ala18-oh、fmoc-gln17(trt)-oh、fmoc-gly16-oh、fmoc-glu15(otbu)-oh、fmoc-leu14-oh、fmoc-tyr13(tbu)-oh、fmoc-ser12(tbu)-oh、boc-ser11-oh、fmoc-val10-oh、fmoc-asp9(otbu)-oh、fmoc-ser8(tbu)-oh、fmoc-thr7(tbu)-oh、fmoc-phe6-oh、fmoc-thr5(tbu)-oh、boc-his1(trt)x2glu3(otbu)gly4-oh偶联到fmoc-gly31-wang上；1.5肽树脂的裂解量取三氟乙酸至反应器中，冷却至-10～0℃，加入三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和纯化水(tfa:tis:edt＝95:2.5:2.5)，启动搅拌，混合均匀。缓慢加入肽树脂，升温至20～30℃，裂解反应115～125min。反应结束后滤除树脂，滤除的树脂用m×8×20％ml的tfa洗涤，滤除液和洗涤液全部转移到m×8×1.2×4ml的乙醚中，搅拌5～10min，静置沉降15min以上。将沉降悬浊液放入离心机中，离心收集固体；用乙醚洗涤固体6次，每次用不少于5l。将固体于20～35℃、真空干燥6～10h，得粗肽10.90g。2seqidno：1多肽化合物的纯化采用制备液相色谱进行纯化，色谱条件为：c18柱(100mm×250mm，10μm)；流动相a：0.1％h3po4/水(v/v)，流动相b：0.1％h3po4/乙腈(v/v)；流动相梯度：流动相b20％～60％，60min；流速为200ml/min检测波长为214nm，收集纯度大于98.0％的馏分，旋蒸浓缩后冷冻干燥得3.10g样品。多肽化合物seqidno：2-30的合成方法同实例1：实施例2，seqidno：2多肽化合物的合成：hx2egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.93g。实施例3，seqidno：3多肽化合物的合成：hx3egtftsdvssylex3qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品2.87g。实施例4，seqidno：4多肽化合物的合成：hx3egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品2.55g。实施例5，seqidno：5hx4egtftsdvssylex4qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品2.60g。实施例6，seqidno：6hx4egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品2.61g。实施例7，seqidno：7hx5egtftsdvssylex5qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.1g。实施例8，seqidno：8hx5egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.35g。实施例9，seqidno：9hx6egtftsdvssylex6qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品2.70g。实施例10，seqidno：10hx6egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.90g。实施例11，seqidno：11hx7egtftsdvssylex7qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.74g。实施例12，seqidno：12hx7egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.22g。实施例13，seqidno：13hx8egtftsdvssylex8qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.48g。实施例14，seqidno：14hx8egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品5.30g。实施例15，seqidno：15hx9egtftsdvssylex9qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品2.70g。实施例16，seqidno：16hx9egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.67g。实施例17，seqidno：17hx10egtftsdvssylex10qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品2.33g。实施例18，seqidno：18hx10egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.440g。实施例19，seqidno：19hx11egtftsdvssylex11qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品2.70g。实施例20，seqidno：20hx11egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.92g。实施例21，seqidno：21hx12egtftsdvssylex12qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.62g。实施例22，seqidno：22hx12egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg合成方法同实施例1，收集纯化后的样品溶液冻干得纯品3.80g。以下是glp-1激动多肽化合物(下称多肽化合物)的相关药理实验方法以及结果：1、多肽化合物的glp-1受体激动活性胰高血糖素样肽-1受体(glp-1r)属于b类g蛋白偶联受体，且在血糖额体重条件中发挥重要作用，是公认的重要抗糖尿病药物作用靶点。利用稳定表达人glp-1r的中国仓鼠卵巢细胞系(cho)，测定多肽化合物样品及对照化合物对glp-1r下游camp信号的诱导活力。野生型人源glp-1r(nm_002062.5)通过瞬时转染，并以600μg/ml的hygromycin-b筛选两周，获得获得重组整合入flpincho(invitrogen)细胞稳定表达系统的细胞系。flpincho细胞的培养条件为dmem培养液加入10％热灭活的胎牛血清，于5％二氧化碳细胞培养箱中培养。下游camp信号检测的试验中，将细胞种于6孔细胞培养板中过夜培养后，以每孔8000个细胞的浓度转入384孔板中，在37℃，5％co2条件下继续培养24小时。实验采用lancecamp检测试剂盒测定其camp信号强度。细胞孵化30min后，使用lancecamp检测试剂盒，使用酶标仪测定荧光读数，建立标准曲线将荧光读数转化为相应的camp数值，使用graphpadprism7.0软件的非线性回归计算化合物的ec50数值。glp-1r的camp信号分析针对多肽化合物seq.idno:1和seq.idno:2进一步开展了动物体内实验，在降糖作用和减重方面开展了详细比对实验，实验方案及结果如下。2、多肽化合物的降糖及对体重的影响实验对db/db高血糖的小鼠动物适应5-7天后，测定非禁食随机血糖值，禁食12小时后，快速血糖仪测定空腹血糖值。综合考虑体重、12h禁食后空腹血糖、随机血糖结果对动物进行随机分组(随机区组设计)，根据随机体重、随机血糖和空腹血糖分为溶剂对照组、多肽化合物组(选取受试药：seq.idno:1和seq.idno:2)、阳性对照semaglutide组、已知对照组spn013。各受试药组以及对照组小鼠分别单次皮下注射各受试药或对照组溶液，模型对照组小鼠单次皮下注射pbs缓冲液；实验分组和剂量设置情况详见表1:表1.实验动物给药前分组情况注：n每组小鼠数目；给药容积：根据小鼠体重5μl/g。实验仪器:快速血糖仪(强生,onetouchultraeasy,仪器序列号：mgc23b4er，mgc23b5er)实验观察:临床症状：本实验方案的拟定及任何修改将在上海药物研究所苏研院实验动物伦理委员会(iacuc)进行评估核准后方可实行。每天监测动物的健康状况及死亡情况。体重：自动物分组后，体重每天固定时间段测量一次实验指标：血糖值：取小鼠尾尖血以快速血糖仪及血糖试纸测定血糖值。分组后，皮下给予不同受试物1次，分别于给药后0h、2h、4h、6h、10h、24h、34h、48h、58h、72h、82h、96h测定血糖值。受试物的降糖疗效以bg(mmol/l)或auc(mmol/l·min)评价。auc的计算：auc＝[(bg0 bg2)x2 (bg2 bg4)x2 (bg4 bg6)x2 (bg6 bg10)x4 (bg10 bg24)x14 (bg24 bg34)x10 (bg34 bg48)x14 (bg48 bg58)x10 (bg58 bg72)x14 (bg72 bg82)x10 (bg82 bg96)x14]/2。数据分析：t检验用于两组间比较。三组或多组间比较用one-wayanova。如果f值有显著性差异，应在anova分析之后再进行多重比较。用spss17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。如表2－4及图1-2所示，降血糖实验数据及图表的结果表明，本发明的多肽化合物给药浓度为30mmol/kg时，降血糖效果与semaglutide的降糖效果几乎一致；阳性对照组和多肽化合物组均与溶剂对照组均有显著差异。如表5－6及图3-4结果显示，溶剂对照组单次皮下注射给药后对db/db小鼠的随机体重及其变化量没有明显影响。阳性对照组和多肽化合物组均与溶剂对照组均有显著差异；尤其给药24小时后差异最显著。同时实验结果显示多肽化合物seq.idno:1、seq.idno:1、spn013在单次皮下注射给药后24h、48h、72h可显著降低db/db小鼠的随机体重变化量，优于semaglutide组。因此，glp-1激动化合物单次皮下注射给药可显著降低2型糖尿病db/db小鼠的随机血糖，其中seq.idno:1、seq.idno:1与等剂量semaglutide的作用相当。其中seq.idno:1、seq.idno:1多肽化合物表现出了更好的体重控制效果。序列表<110>江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司杭州诺泰澳赛诺医药技术开发有限公司<120>glp-1激动多肽化合物及其盐与合成方法及用途<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>31<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1hisxaagluglythrphethrseraspvalsersertyrleugluxaa151015glnalaalaxaaglupheilealatrpleuvalargglyarggly202530当前第1页1 2 3
技术特征：1.glp-1激动多肽化合物，其特征在于，该类多肽化合物的氨基酸序列为：
hxaa1egtftsdvssylexaa2qaaxaa3efiawlvrgrg，且该类多肽化合物c末端氨基酸作为羧基或羧基被酰胺化；
其中：
xaa1取自：
xaa2取自：g，
xaa1、xaa2相同或不同；
r1为：含有2-6个碳原子的直链或支链烷基，
r2为：h或ch3,
x为：o,s或n-ch3,
式中r1和r2烷基可任选地被1-6个卤素原子取代；
xaa3取自：
m、n为自然数。
2.根据权利要求1所述的glp-1激动多肽化合物，其特征在于：所述的n为自然数从12到20；m为自然数0到3。
3.根据权利要求1或2所述的glp-1激动多肽化合物，其特征在于：该类多肽化合物的氨基酸序列选自：
(1)seqidno：1
hx2egtftsdvssylex2qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(2)seqidno：2
hx2egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(3)seqidno：3
hx3egtftsdvssylex3qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(4)seqidno：4
hx3egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(5)seqidno：5
hx4egtftsdvssylex4qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(6)seqidno：6
hx4egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(7)seqidno：7
hx5egtftsdvssylex5qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(8)seqidno：8
hx5egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(9)seqidno：9
hx6egtftsdvssylex6qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(10)seqidno：10
hx6egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(11)seqidno：11
hx7egtftsdvssylex7qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(12)seqidno：12
hx7egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(13)seqidno：13
hx8egtftsdvssylex8qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(14)seqidno：14
hx8egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(15)seqidno：15
hx9egtftsdvssylex9qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(16)seqidno：16
hx9egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(17)seqidno：17
hx10egtftsdvssylex10qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(18)seqidno：18
hx10egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(19)seqidno：19
hx11egtftsdvssylex11qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(20)seqidno：20
hx11egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(21)seqidno：21
hx12egtftsdvssylex12qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
(22)seqidno：22
hx12egtftsdvssylex1qaak(hooc-(ch2)16-co-γ-glu-aeea-aeea)efiawlvrgrg
式中：
x1＝g；
4.权利要求1或2或3所述的一类glp-1激动多肽化合物的合成方法，其特征在于：
(1)固相合成化合物多肽的主序列第1-31位氨基酸，其中第1-4位氨基酸采用片段boc-his(trt)xaa1glu(otbu)gly-oh，其中：
其中：
xaa1取自：
r1为：含有2-6个碳原子的直链或支链烷基，
r2为：h或ch3,
x为：o,s或n-ch3,
式中r1和r2烷基可任选地被1-6个卤素原子取代；
(2)第20位lys采用片段fmoc-lys(xaa3)；片段结构式如下：
所述的n为自然数从12到20；m为自然数0到3；
(3)所用的缩合剂为dic/hobt，oxymapure/dic，hbtu/hobt/diea，pybop/hobt/diea其中的一种或多种；所用的反应溶剂为dcm、dmf、nmp、dmso中的一种或多种组合；所使用的fmoc脱除试剂为v/v25％哌啶/dmf溶液；
(4)包括以下步骤：
步骤一，制备fmoc-gly31-wang树脂；
步骤二，制备全保护肽树脂；
步骤a，将fmoc-gly31-wang树脂加入到固相反应器中；
步骤b，固相合成方法逐一将fmoc-arg30(pbf)-oh、fmoc-gly29-oh、fmoc-arg28(pbf)-oh、fmoc-val27-oh、fmoc-leu26-oh、fmoc-trp25(boc)-oh、fmoc-ala24-oh、fmoc-ile23-oh、fmoc-phe22-oh、fmoc-glu21(otbu)-oh、fmoc-lys20(xaa3)-oh、fmoc-ala19-oh、fmoc-ala18-oh、fmoc-gln17(trt)-oh、fmoc-gly16-oh、fmoc-glu15(otbu)-oh、fmoc-leu14-oh、fmoc-tyr13(tbu)-oh、fmoc-ser12(tbu)-oh、boc-ser11-oh、fmoc-val10-oh、fmoc-asp9(otbu)-oh、fmoc-ser8(tbu)-oh、fmoc-thr7(tbu)-oh、fmoc-phe6-oh、fmoc-thr5(tbu)-oh、boc-his1(trt)xaa1glu3(otbu)gly4-oh偶联到fmoc-gly31-wang上；
所述xaa1取自：
r1为：含有2-6个碳原子的直链或支链烷基，
r2为：h或ch3,
x为：o,s或n-ch3,
式中r1和r2烷基可任选地被1-6个卤素原子取代；
所述片段fmoc-lys20(xaa3)-oh结构式如下：
所述的n为自然数从12到20；m为自然数0到3；
步骤三，将所述肽树脂进行裂解，得到粗肽，
裂解试剂采用复合试剂，配比为：tfa:(苯甲硫醚/tis/edt/苯酚/水)＝90:5，其中捕获剂为苯甲硫醚/tis/edt/水中的任意组合。
5.glp-1激动多肽化合物药学上可接受的盐，其特征在于：所述的glp-1激动多肽化合物为权利要求1或2或3所述的多肽化合物，且该多肽化合物c末端氨基酸作为c末端伯酰胺或其药学上可接受的盐被酰胺化。
6.根据权利要求5所述的glp-1激动多肽化合物药学上可接受的盐，其特征在于：所述的盐为glp-1激动多肽化合物与下述化合物中的一种所形成的盐：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、肥酸、藻酸、马来酸、富马酸、d-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或者硫氰酸。
7.权利要求1－3项中任意一项所述的glp-1激动多肽化合物所制备的药剂，其特征在于，该药剂以glp-1激动多肽化合物为有效成份，药剂剂型是任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、酏剂、糖浆、锭剂、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、散剂、颗粒剂、块剂、乳剂、栓剂或者复方制剂。
8.glp-1激动多肽化合物的药物组合物，其特征在于，该药物组合物以权利要求1－3中任何一项所述的glp-1激动多肽化合物为有效原料，或者以权利要求4或5所述的glp-1激动多肽化合物药学上可接受的盐为有效原料，再加上药学上可接受的载体或稀释剂组成。
9.权利要求1－3中任意一项所述的glp-1激动多肽化合物或者权利要求4所述制备方法所制得的glp-1激动多肽化合物的用途，其特征在于，所述的用途为glp-1激动多肽化合物作为有效原料在制备用于治疗或者预防糖尿病的药物中的用途，或者用于制备减肥药物中的用途。
10.权利要求5或6所述的glp-1激动多肽化合物药学上可接受的盐或者权利要求7所述的药剂或者权利要求8所述的药物组合物的用途，其特征在于，所述的用途多肽化合物药学上可接受的盐或者药剂或者药物组合物作为有效原料在制备用于治疗或者预防糖尿病的药物中的用途，或者用于制备减肥药物中的用途。
技术总结本发明公开了一系列GLP‑1激动多肽化合物，属于多肽药物化学技术领域；针对现有化合物体内稳定性，降糖减重效果及副作用等存在的不足，提供一系列利用双重作用机制、具有更优的降糖活性和减重效果的GLP‑1激动剂多肽化合物。该类GLP‑1激动的多肽化合物的氨基酸序列为：H Xaa1EGTFTSDVSSYLE Xaa2QAA Xaa3EFIAWLVRGRG，且该类多肽化合物C末端氨基酸作为C末端为羧基或羧基被酰胺化。本发明还公开了该类多肽化合物的制备方法、药学上可接受的盐、药物组合物和药剂。本发明多肽化合物同时具备降糖及减重效果，可以作为有效原料用于制备治疗或者预防糖尿病的药物或者减肥药物。
技术研发人员：赵呈青;施国强;李顺子;王蔡典
受保护的技术使用者：江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司;杭州诺泰澳赛诺医药技术开发有限公司
技术研发日：2020.02.18
技术公布日：2020.06.09
