本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种免疫激活多肽及其应用。
背景技术：
toll样受体(toll-likereceptors，tlrs)是机体抵抗感染的一道重要屏障，其能够识别各种不同的疾病相关分子模式(pamp)并引起促炎反应继而介导宿主免疫防御。tlr4是识别细菌的重要的tlrs家族成员，主要识别革兰氏阴性菌的脂多糖(lps)从而激活nf-κb信号通路进而激活宿主免疫反应。为了防止产生过度炎症，避免炎症对机体的损害，tlr4信号通路也受着严格的负调控。例如，胞外的rp105和胞内的sigirr、st2l、myd88s、irak-m以及socs-1等都是已经报道的tlr4通路负调控因子。机体在调控免疫系统防止免疫过度的情况发生的同时也要激活免疫系统并彻底清除入侵机体的病原微生物。如果外界病原微生物不能及时的清除将引发病理性炎症等一系列严重的后果。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种免疫激活多肽及其应用。本发明所述免疫激活多肽能够与cd14竞争性结合转铁蛋白从而阻碍免疫负调控因子转铁蛋白的负调控作用，是一种潜在的多肽类免疫激活剂，对病原微生物的清除具有辅助作用。
本发明提供了一种免疫激活多肽，所述多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备toll样受体4信号通路的免疫激活剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备抑制转铁蛋白的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备通过竞争性结合转铁蛋白实现toll样受体4信号通路的免疫激活的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备通过抑制转铁蛋白，实现对lps诱导的炎症因子分泌的抑制的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备通过抑制转铁蛋白，实现lps诱导的肝组织损伤和细胞凋亡的抑制的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备病原微生物清除用的药物中的应用。
本发明提供了一种免疫激活多肽。本发明所述免疫激活多肽能够与cd14竞争性结合转铁蛋白从而阻碍免疫负调控因子转铁蛋白的负调控作用(即免疫激活多肽能够与脂多糖受体cd14竞争性结合转铁蛋白从而阻碍转铁蛋白与cd14的结合并进一步抑制转铁蛋白对tlr4信号通路的抑制作用)，是一种潜在的多肽类免疫激活剂，对病原微生物的清除具有辅助作用。本发明所述免疫激活多肽还具有结构简单、人工合成方便等优势。
附图说明
图1为本发明提供的免疫激活多肽cd14n与tlr4免疫负调控因子转铁蛋白的相互作用；
图2为本发明提供的免疫激活多肽cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的tlr4信号通路炎症因子的影响；
图3为本发明提供的免疫激活多肽cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的tlr4信号通路炎症的影响；
图4为本发明提供的免疫激活多肽cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的tlr4信号通路炎症的影响；通过tunel染色验证cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的肝组织细胞凋亡的影响；上述各图表示对8只小鼠的统计结果；*p<0.5，**p<0.01。
具体实施方式
本发明提供了一种免疫激活多肽，所述多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明免疫激活多肽(cd14n)是合成的单链多肽，分子量为4486.84道尔顿，氨基酸序列为：elddedfrcvcnfsepqpdwseafqcvsaveveihaggln(seqidno.1)。本发明发现转铁蛋白作用于tlr4通路的cd14分子并负调控tlr4信号通路。本发明提供的免疫激活多肽能够与cd14竞争性结合转铁蛋白并阻碍免疫负调控因子转铁蛋白的负调控作用，是一种潜在的多肽类免疫激活剂。本发明优选依据免疫激活多肽(cd14n)的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过hplc反向柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％，复性后，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)测定其分子量。合成的抗凝多肽溶于生理盐水，用于活性测定。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备toll样受体4信号通路的免疫激活剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备抑制转铁蛋白的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备通过竞争性结合转铁蛋白实现toll样受体4信号通路的免疫激活的药物中的应用。本发明所述免疫激活多肽制备得到的药物能通过竞争性结合转铁蛋白并阻碍负调控因子的负调控作用实现toll样受体4信号通路的免疫激活。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备通过抑制转铁蛋白，实现对lps诱导的炎症因子分泌的抑制的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备通过抑制转铁蛋白，实现lps诱导的肝组织损伤和细胞凋亡的抑制的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫激活多肽在制备病原微生物清除用的药物中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种免疫激活多肽及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
免疫激活多肽cd14n的合成
用fmoc-lys(boc)-wangresin进行合成。
1.树脂溶胀
称取替代度为0.3的fmoc-leu-wangresin5g，倒入反应柱中，加入50mldcm溶胀，浸泡30min。
2.去保护
抽干反应柱中dcm，加入20％的哌啶/dmf溶液脱除fmoc，氮气鼓动30min，抽干，以dmf洗涤5遍，抽干。
3.缩合反应
采用tbtu/diea激活剂组合进行缩合，以3倍投料量计算称取的tbtu及连接氨基酸，用50mldmf溶解加入反应柱中，加入diea(1.55ml)，氮气鼓动，反应1小时。
4.检测、洗涤
用取样管从反应柱中取少许树脂，倒入小试管中，dmf洗涤一遍，倒掉dmf，分别加入a、b、c液各3滴(a液：茚三酮酒精溶液，b液：20％酒精80％苯酚混合溶液，c液：重蒸吡啶)，放入加热器中120℃加热3分钟，取出观察溶液及树脂颜色，溶液黄树脂无色或淡黄，表明缩合反应完全，停止反应柱中反应，抽干，dmf洗涤3遍。
5.复投
如检测出树脂颜色为其他颜色，例绿色蓝色紫色等，则表明反应未完全，同样抽干洗涤3遍，称取当前反应同样的量投入反应柱中重新反应，直至检测反应完全为止。
6.继续缩合
后续氨基酸的连接重复2-5步骤，不同的氨基酸称取的量用同样的算法计算称取，tbtu/diea的量保持不变。
7.收缩
最后一个氨基酸连接完成后，继续重复2步骤，然后dcm洗涤3遍，甲醇洗涤3遍，抽干，将树脂倒出，烘灯烘干装入500ml烧杯中。
8.切割
向烧杯中加入100ml切割液(比例为tfa/苯甲硫醚/苯酚/edt/水＝86/5/4/3/2)，将烧杯置于磁力搅拌器上，烧杯中放入磁子，搅拌反应2小时，后用砂芯漏斗过滤，以tfa润洗砂芯中树脂2次，将切割液倒入600ml的冰乙醚中，此时多肽析出形成多肽乙醚悬浮液，使用大号离心机分别重复离心，倒掉上清液，加入乙醚洗涤过程，重复3次，后用烘灯烘烤，去除乙醚残留，得到的固体即为目标多肽粗品。
9.纯化
将粗品用水溶解，过滤，用高效液相色谱法进行分离纯化，最终得到纯度为95％以上的目标多肽精品。
10.制备
把7克粗品溶解在一定比例的acn:h2o1:4的溶液里面，取一点小样分析一下样品的出峰时间。(高相液相色谱仪hplc分析)在选择制备柱子100dac的柱子，把样品进到柱子里面，根据粗品的出峰时间选择梯度，进去分离，根据hplc图把杂质分开收，通过lc-ms来判断收的产品是不是需要的，把需要的物质留下来进行检测。hplc合格的产品进行旋蒸，冻干。得到所需要的产品的量(白色粉末的状态)。
实施例2
免疫激活多肽cd14n功能的验证：
1.cd14n与tlr4负调控因子转铁蛋白的相互作用：采用biacore2000(ge,usa)分析cd14n与转铁蛋白的结合。具体步骤为首先用n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化液活化cm5芯片(br100012,ge,usa)，后将用醋酸钠溶液(10mm,ph5)稀释的终浓度为20μg/ml的转铁蛋白溶液流经已经活化好的cm5芯片表面以共价偶联转铁蛋白(1000反应值)，流速为5μl/min。用同样的方法和流速使75μl的封闭液乙醇胺流经芯片表面以封闭多余的位点。最后将不同浓度(125,250,500和1000nm)的用tris缓冲液(20mm,ph7.4)稀释的流动相cd14n和cd14随机肽cd14n-scr溶液流经芯片表面以检测与转铁蛋白的结合曲线。结果为：cd14n能够与tlr4免疫负调控因子转铁蛋白相互结合(图1，免疫激活多肽cd14n与tlr4免疫负调控因子转铁蛋白的相互作用图；其中，转铁蛋白作为固定相偶联到cm5芯片上，不同浓度的cd14n和cd14随机肽cd14n-scr作为流动相)。
3.检测动物水平cd14n对转铁蛋白抑制的lps诱导的炎症因子的影响。具体操作为先采用尾静脉注射的方式注射不同浓度的cd14n(4、1和0.25mg/kg)对小鼠进行干预,后通过尾静脉注射转铁蛋白(16mg/kg)。最后通过给小鼠尾静脉注射lps(1mg/kg)以诱导炎症反应，诱导时间为2h。最后检测小鼠血浆炎症因子tnf-α、il-1β和il-6的含量。结果为：cd14n可以抑制转铁蛋白对lps诱导的小鼠血浆炎症因子分泌的抑制作用，激活免疫应答(图2，免疫激活多肽cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的tlr4信号通路炎症因子的影响结果图；其中，a表示cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的小鼠血浆炎症因子tnf-α的影响；b表示cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的小鼠血浆炎症因子il-1β的影响；c表示cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的小鼠血浆炎症因子il-6的影响；图2中各图中每个柱子的bar表示对8只小鼠统计结果，第一个柱子是对照；*p<0.5，**p<0.01；tf：转铁蛋白)。
4.检测动物水平cd14n对转铁蛋白抑制的lps诱导的炎症的影响。具体操作为先采用尾静脉注射的方式注射不同浓度的cd14n(4、1和0.25mg/kg)对小鼠进行干预,后通过尾静脉注射转铁蛋白(16mg/kg)。最后通过给小鼠尾静脉注射lps(1mg/kg)以诱导炎症反应，诱导时间为2h。最后通过he染色和tunel染色分别评估cd14n对转铁蛋白抑制的lps诱导的肝组织损伤和细胞凋亡的影响。结果为：cd14n可以抑制转铁蛋白对lps诱导的小鼠肝组织损伤和细胞凋亡，激活免疫应答(图3和图4；图3为免疫激活多肽cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的tlr4信号通路炎症的影响结果图，其中，从左到右五个图分别代表对照组、脂多糖lps注射处理组、lps 转铁蛋白(tf)注射处理组、lps 转铁蛋白(tf) cd14n(4mg/kg)注射处理组和lps 转铁蛋白(tf) cd14n(1mg/kg)注射处理组，通过he染色验证cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的肝组织损伤的影响；图4为免疫激活多肽cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的tlr4信号通路炎症的影响图，其中a为细胞凋亡染色图，b为对细胞凋亡(a)的定量统计图，通过tunel染色验证cd14n对转铁蛋白抑制脂多糖lps诱导的肝组织细胞凋亡的影响，图4中各图表示对8只小鼠的统计结果(每个柱子的bar代表8只小鼠的统计结果)；*p<0.5，**p<0.01)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国科学院昆明动物研究所
<120>一种免疫激活多肽及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>40
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gluleuaspaspgluasppheargcysvalcysasnpheserglupro
151015
glnproasptrpserglualapheglncysvalseralavalgluval
202530
gluilehisalaglyglyleuasn
3540
1.一种免疫激活多肽，所述多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。
2.权利要求1所述免疫激活多肽在制备toll样受体4信号通路的免疫激活剂中的应用。
3.权利要求1所述免疫激活多肽在制备抑制转铁蛋白的药物中的应用。
4.权利要求1所述免疫激活多肽在制备通过竞争性结合转铁蛋白实现toll样受体4信号通路的免疫激活的药物中的应用。
5.权利要求1所述免疫激活多肽在制备通过抑制转铁蛋白，实现对lps诱导的炎症因子分泌的抑制的药物中的应用。
6.权利要求1所述免疫激活多肽在制备通过抑制转铁蛋白，实现lps诱导的肝组织损伤和细胞凋亡的抑制的药物中的应用。
7.权利要求1所述免疫激活多肽在制备病原微生物清除用的药物中的应用。
技术总结