本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种猪圆环病毒3型cap蛋白、核酸、病毒样颗粒、疫苗及制备方法和应用。
背景技术：
猪圆环病毒(pcv)是单股环状dna病毒，基因长度约为1.7kb，是最小的动物dna病毒之一，主要引起仔猪多系统衰竭综合征、肺炎、皮炎、肾病综合征、繁殖障碍，给生猪的养殖带来重大损失。pcv3是一种新型圆环病毒，国内尚无针对pcv3的商品疫苗。pcv3和pcv2cap蛋白基因的同源性很低，仅有30％的一致性，这也暗示已有的pcv2疫苗无法保护生猪免受pcv3的侵害。因此pcv3相应疫苗的研发至关重要。
最近的研究表明pcvcap蛋白可在多种系统中表达且获得亚单位或者嵌合表位疫苗，但是普通亚单位疫苗及嵌合表位疫苗的免疫效果不如病毒样颗粒疫苗，因此pcv3的vlp疫苗成重要的研发方向。目前已有研究表明，pcv3cap蛋白在大肠杆菌、昆虫杆状病毒系统中成功表达且能组装成病毒样颗粒，并且能获得较好的免疫效果。但是大肠杆菌表达的pcvcap蛋白可溶性低，且有内毒素的污染，而后期去除内毒素工艺复杂且代价昂贵；昆虫杆状病毒系统表达的vlp具有很好的免疫效果，但是昆虫杆状病毒产生的vlp表达量低、生产成本昂贵、生产工艺复杂、作为动物疫苗难以大规模生产。酵母表达系统作为一个高效的蛋白表达系统，具有很多优点，但由于pcv3cap蛋白其本身核定位序列的影响，直接表达该蛋白很容易形成不溶性蛋白聚集，因此在pcv3cap蛋白在酵母系统进行可溶性表达具有挑战。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一种猪圆环病毒3型cap蛋白，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述猪圆环病毒3型cap蛋白的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供编码权利要求1所述的猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸。
本发明的第四个目的在于提供由上述的猪圆环病毒3型cap蛋白组装成的猪圆环病毒的病毒样颗粒。
本发明的第五个目的在于提供一种抗猪圆环病毒3型的病毒样颗粒疫苗。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种猪圆环病毒3型cap蛋白，所述猪圆环病毒3型cap蛋白为由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。
本发明还提供了上述的猪圆环病毒3型cap蛋白的制备方法，所述制备方法包括：将含有编码上述的猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸序列的重组质粒转入酵母菌株中，经所述酵母菌株表达后，得到所述猪圆环病毒3型cap蛋白。
进一步地，将编码上述的猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸序列整合到真核表达载体中，得到重组质粒；
优选地，所述真核表达载体包括ppiczɑa。
进一步地，所述酵母菌株为x33、gs115、km71或km71h，优选x33。
进一步地，对所述表达产物进行纯化后，得到所述猪圆环病毒3型cap蛋白。
本发明还提供了编码上述的猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸。
进一步地，所述核酸具有如seqidno.3所示的核苷酸序列；或，与seqidno.3所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
本发明还提供了由上述的猪圆环病毒3型cap蛋白组装成的猪圆环病毒的病毒样颗粒。
本发明还提供了上述的猪圆环病毒3型cap蛋白、核酸或病毒样颗粒在制备抗猪圆环病毒3型的疫苗中的应用。
另外，本发明还提供了一种抗猪圆环病毒3型的病毒样颗粒疫苗，所述病毒样颗粒疫苗包括上述的病毒样颗粒。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的猪圆环病毒3型cap蛋白，通过对普通猪圆环病毒3型cap蛋白(seqidno.1)的核定位序列进行优化，得到具有如seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白质。本发明优化得到的猪圆环病毒3型cap蛋白在酵母表达系统中能够进行可溶性表达，有效地提高了猪圆环病毒3型cap蛋白的酵母表达效率。
并且，本发明提供的猪圆环病毒3型cap蛋白能够自组装为病毒样颗粒，应用该病毒样颗粒制备的疫苗兼有细胞免疫和体液免疫的特性，经免疫学相关实验表明，免疫效果很好。
利用酵母表达系统表达猪圆环病毒3型cap蛋白，具有生产成本低廉、生产工艺简单、通过高密度发酵能获得大量目标蛋白的优点，并且无内毒素污染，可用于大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的猪圆环病毒的病毒样颗粒westernblot鉴定结果图；
图2为本发明实施例提供的猪圆环病毒的病毒样颗粒负染电镜测试结果图；
图3为本发明实施例提供的猪圆环病毒的病毒样颗粒疫苗免疫小鼠抗体评估的elisa抗体检测结果图；
图4为本发明实施例提供的未经优化的序列组装病毒样颗粒后的电镜测试结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
根据本发明的一个方面，提供了一种猪圆环病毒3型cap蛋白，所述猪圆环病毒3型cap蛋白为由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。
本发明提供的猪圆环病毒3型cap蛋白，通过对普通猪圆环病毒3型cap蛋白(seqidno.1)的核定位序列进行优化，得到具有如seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白质。本发明优化得到的猪圆环病毒3型cap蛋白在酵母表达系统中能够进行可溶性表达，有效地提高了猪圆环病毒3型cap蛋白的酵母表达效率。
需要说明的是，对由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质的氨基酸序列不做具体限定，例如可以为，将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而得到的氨基酸序列。凡是具有与由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有相同功能的氨基酸序列均在本发明的保护范围之内。
上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加优选为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。当取代和/或缺失和/或添加的氨基酸数量不超过10个时，衍生得到的蛋白质的性能更贴近本发明提供的猪圆环病毒3型cap蛋白。
其中，取代和/或缺失和/或添加，可以仅为取代、仅为缺失、仅为添加，或者同时存在取代和缺失、同时存在取代和添加、同时存在缺失和添加，或者同时存在取代和缺失和添加。
在一些优选的实施方式中，本发明还提供了上述的猪圆环病毒3型cap蛋白的制备方法，所述制备方法包括：将含有编码上述的猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸序列的重组质粒转入酵母菌株中，经所述酵母菌株表达后，得到所述猪圆环病毒3型cap蛋白。
利用酵母表达系统表达猪圆环病毒3型cap蛋白，与现有的杆状病毒系统表达pcv3vlp相比，生产成本低廉、工艺简单、表达量高，易于放大到生产；与现有大肠杆菌表达系统比较，其能够表达出高质量的可溶性目标蛋白、且无内毒素污染。因此本发明提供的猪圆环病毒3型cap蛋白的制备方法具有生产成本低廉、生产工艺简单、通过高密度发酵能获得大量目标蛋白的优点，并且无内毒素污染，可用于大规模生产。
在一些优选的实施方式中，将编码上述的猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸序列整合到真核表达载体中，得到重组质粒；
优选地，所述真核表达载体包括ppiczɑa。使用ppiczɑa作为表达载体，具有转化效率高，表达量高、易于筛选高拷贝的有益效果。
优选地，所述酵母菌株包括x33、gs115、km71或km71h，其中x33具有易于培养、表达量高的特点，因此优选x33作为酵母菌株。
在一些优选的实施方式中，通过高浓度zeocin(3mg/ml)的筛选，获取高拷贝的酵母菌株x33。再通过表达量筛选获得pcv3cap蛋白稳定表达的工程菌株。
具体地，将高浓度抗生素平板上长出的单菌落进行挑菌、菌体培养及甲醇诱导表达，然后10000g离心1min收集菌体，抛去上清。再用等体积的裂解液(1xproteinloadingbuffer)进行重悬菌体，沸水浴煮沸10min。随后进行sds-page分析，根据sds-page结果挑选出表达量最高的几株菌株。筛选出的工程菌株表达量不低于50mg/l。
通过对酵母菌株进行进一步的筛选，能够保证得到的工程菌株能够稳定、高效地表达猪圆环病毒3型cap蛋白。
在一些优选的实施方式中，对所述表达产物进行纯化后，得到所述猪圆环病毒3型cap蛋白。
本实施方式对纯化的方法不做限定，本领域常规的蛋白纯化方法均可。优选使用20％硫酸铵沉淀目标蛋白，然后用hepesbuffer重悬，重悬蛋白经过分子排阻层析纯化，从而获取较干净的猪圆环病毒3型cap蛋白。
本发明还提供了编码上述的猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸。
通过核定位序列的突变、毕赤酵母系统最优的密码子、最适的mrna结构、以及加上kozak序列，能够不断增强编码猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸的转录和翻译效率。
在一些优选的实施方式中，所述核酸具有如seqidno.3所示的核苷酸序列；或，与seqidno.3所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
术语“同一性”指的是序列之间的相似性。“同一性”包括与本发明所述的seqidno.3所示的核苷酸序列具有至少85％(例如可以为，但不限于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或者更高)同一性的核苷酸序列。
本发明还提供了由上述的猪圆环病毒3型cap蛋白组装成的猪圆环病毒的病毒样颗粒。
本发明提供的猪圆环病毒3型cap蛋白能够自组装为病毒样颗粒，应用该病毒样颗粒制备的疫苗兼有细胞免疫和体液免疫的特性，经免疫学相关实验表明，免疫效果很好。
本发明还提供了上述的猪圆环病毒3型cap蛋白、核酸或病毒样颗粒在制备抗猪圆环病毒3型的疫苗中的应用。
另外，本发明还提供了一种抗猪圆环病毒3型的病毒样颗粒疫苗，所述病毒样颗粒疫苗包括上述的病毒样颗粒。
病毒样颗粒疫苗的免疫效果优于普通亚单位疫苗及嵌合表位疫苗，应用本发明提供的猪圆环病毒的病毒样颗粒制备的疫苗，能够使得被免疫动物获得pcv3的免疫原性，且兼有细胞免疫和体液免疫的特性，免疫效果好。
在一些优选的实施方式中，本发明提供的病毒样颗粒疫苗还包括药学上可接受的辅料。其中，用于注射制剂的辅料包括佐剂，佐剂可以为铝盐佐剂、水包油乳剂、油包水乳剂、水包油包水佐剂或脂质体，本发明对此不做限定。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
表格2：所用仪器来源
实施例1pcv3cap蛋白的表达与病毒样颗粒(vlp)组装
通过流行病学调查和pcv3病毒进化分析，选取保守性好、广泛流行的毒株的cap蛋白序列(seqidno.1)。
(1)pcv3cap蛋白的一级序列中n端约50个氨基酸是其核定位序列，本实施例根据预测网站(cnlsmapper)将pcv3cap蛋白的nls的进行突变，突变后的序列经nls预测网站预测后不再具有核定位序列的特点即获得所采用的序列(seqidno.2)。然后对其序列的进行密码子优化,密码子优化后的核酸序列的5’端添加碱基gccacc(与起始密码子atg共同形成kozak序列)，获得最终表达所用的核酸序列(seqidno.3)。通过此步骤目的不断增强其转录和翻译效率。
(2)将优化后的核酸序列送去金唯智进行基因合成，合成的序列用无缝克隆试剂盒(in-fusionhdcloningkit)经同源重组的方式整合到ppiczɑa载体的pst1和xbai之间，获得重组质粒。
(3)将上述重组质粒转化到top10感受态细胞，具体操作为：2ng质粒与100μltop感受态混匀后，冰上孵育20min，42℃热激45s，热激45s后置于冰上2min，随后补加1mlllb无抗培养基，置于37℃摇床复苏30min，取20μl复苏的菌液涂布到含100ng/mlzeocin的llb固体培养基上。然后将平板，37℃避光倒置培养16h。
将上述长出的菌落进行培养，具体操作为：挑取单菌落至200ml含50ng/mlzeocin的llb液体培养基中，220rpm37℃避光培养20h，然后取质粒提取试剂盒(nucleobondxtramidiplus(50preps))进行抽提质粒。将提取的质粒取30μg，用pmei酶在37℃水浴中酶切3h，质粒经1％核酸电泳验证重组质粒被切开后(图3)，将线性化的质粒用冷乙醇沉淀的方法回收。冷乙醇沉淀的具体操作为：
1、酶切体系中加入1/10体积的3m醋酸钠(ph5.2)
2、充分混匀后加入2.5倍体积的冰预冷的无水乙醇，混合均匀后放置于-20℃1个小时；
3、12000rpm离心15min，小心吸出上层溶液；
4、向管子中加入750μl75％乙醇，小心颠倒数次后于12000rpm离心15min；
5、小心吸出上清，然后将ep管开盖至于室温至少20min以上，使乙醇充分挥发干净；
6、向ep管中加入15-20μlddh2o，溶解dna，至于-20℃备用。
(4)将10μl线性化的质粒和90μlx33感受态细胞在0.1cm的电转杯中混匀，冰上孵育5min，然后将电转仪设定成时间恒定模式，电转参数为电压为1200v，时间为5.5ms，电转杯直径为0.1cm，电击后迅速加入4℃遇冷的ypds培养基，即获得稳定表达目标蛋白的细胞库，然后将细胞库置于29℃恒温培养箱中静置培养3h，最后将菌液涂布到含有3mg/mlzeocin的ypds平板上，29℃避光静置培养三天。在此高浓度抗生素筛选出的菌落均是高拷贝菌株。
(5)将上述长出的单菌落转接到新的平板上(1mg/mlzeocin的ypd平板)，然后对pcv3cap蛋白菌株进行菌体培养及诱导表达，培养及表达条件为：
挑取酵母单菌落至bmgy培养基中，250rpm29℃过夜培养至菌液od为2-6，20℃3000g离心5min，抛去上清，用bmm培养基重悬菌体至菌液od为2左右，继续放在29℃培养箱中震荡培养24h；培养24h后，补加0.5％甲醇，继续29℃震荡培养24h；24h小时后，再次补加0.5％甲醇，同样的条件继续培养24h。
然后进行10000g离心1min收集菌体，抛去上清。再用等体积的裂解液(1xproteinloadingbuffer)进行重悬菌体，沸水浴煮沸10min。随后进行sds-page分析，根据sds-page结果挑选出表达量最高的几株菌株。
(6)用高压冷冻破碎仪裂解细胞，收取上清，用20％硫酸铵沉淀目标蛋白，然后用hepesbuffer重悬，重悬蛋白经过分子排阻层析纯化获取较干净的pcv3cap蛋白(图1)。
(7)经负染电镜测试，发现获得cap蛋白形成完整的vlp颗粒(图2)，颗粒直径约18nm，与pcv3病毒粒子大小一致。
实施例2pcv3病毒样颗粒疫苗的制备
应用本申请所述方法，将纯化后的pcv3cap蛋白与seppic206佐剂按照体积1：1进行乳化(乳化方法见seppic206说明书)。乳化好的pcv3病毒样颗粒(vlp)蛋白抗原含量为50μg/ml。按照《中国兽药典》(现行版)附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于4℃备用。
实施例3pcv3病毒样颗粒疫苗免疫小鼠抗体评估
材料与方法：
动物和免疫：balb/c小鼠，5-6周龄，雌性，12只，分为2组，每组6只。免疫剂量为0.1mlpcv3病毒样颗粒疫苗或等体积无菌pbs，详见下表。
实验共分2组，均腹腔接种免疫2次。首免后14天，进行二免，每日观察状态，并做好记录。
免疫后采血：免疫后28天(二免后14天)，进行小鼠眼眶后静脉丛采血100μl左右。免疫后35天(二免后21天)，全部实验小鼠进行小鼠眼眶后静脉丛采血100μl后，进行安乐死。所有血清收集管按组别标记清楚，不加任何抗凝试剂，常温静置后分离。血清样本保存于-80℃，于实验结束后统一进行elisa抗体检测。
血清抗体检测：方法简述如下：
样品稀释：血清样品100倍稀释(两步法)。第一步10倍稀释样品，稀释板中每孔加入90μl样品稀释液，然后每孔加入10μl血清样品，充分混匀；第二步再次10倍稀释，稀释板中每孔加入135μl样品稀释液，然后每孔加入15μl第一步混匀后的样品，充分混匀。
阳性对照血清(pc)与阴性对照血清(nc)不做稀释。
操作步骤：
1)向抗原包被板孔中加入100μl提前在稀释板中稀释后的样品。
2)向指定孔中分别加入100μl未稀释的阴性对照血清(nc)和阳性对照血清(pc)。
3)盖上封板膜，室温(25±3℃)下孵育30分钟(±2分钟)。
4)用elisa洗板机洗板，弃去孔中液体，每孔加300μl1倍洗涤液，洗涤三次。最后一次洗涤后将酶标板在吸水纸上轻轻拍干。
5)每孔加入100μlpcv2hrp标记抗体。
6)盖上封板膜，室温(25±3℃)下孵育30分钟。
7)重复步骤4)。
8)每孔中加入100μltmb底物液。
9)盖上封板膜，室温(25±3℃)下孵育15分钟。
10)每孔中加入50μl终止液，终止酶促反应。
11)使用450nm波长测量吸光度值。
12)结果判定与计算(图3)。
判定标准：阳性s/p≥0.4；阴性s/p＜0.4
实验结果：(s/p值)
实验结果显示，小鼠二免后14天，制备的pcv3病毒样颗粒(vlp)疫苗就可以产生特异性抗体，二免后21天，抗体效价更强，全部疫苗免疫组小鼠均产生抗pcv3特异性抗体，制备的pcv3病毒样颗粒(vlp)疫苗显示出良好的免疫原性。对照组小鼠，无论是二免后14天还是二免后21天，小鼠血清pcv3抗体检测结果均为阴性。
对比例1
应用本发明实施例1提供的方法对未加优化的序列即seqidno.1进行病毒样颗粒的组装，结果如图4所示，从图中可以看出未加优化的序列无法稳定在体外组装成病毒样颗粒(vlp)，即电镜下观察蛋白，颗粒形态不均一，呈片状或聚集成团。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
sequencelisting
<110>天康生物(上海)有限公司
天康生物股份有限公司
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1.一种猪圆环病毒3型cap蛋白，其特征在于，所述猪圆环病毒3型cap蛋白为由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型cap蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将含有编码权利要求1所述的猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸序列的重组质粒转入酵母菌株中，经所述酵母菌株表达后，得到所述猪圆环病毒3型cap蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将编码权利要求1所述的猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸序列整合到真核表达载体中，得到重组质粒；
优选地，所述真核表达载体包括ppiczɑa。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酵母菌株包括x33、gs115、km71或km71h，优选x33。
5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，对所述表达产物进行纯化后，得到所述猪圆环病毒3型cap蛋白。
6.编码权利要求1所述的猪圆环病毒3型cap蛋白的核酸。
7.根据权利要求6所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有如seqidno.3所示的核苷酸序列；或，与seqidno.3所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
8.由权利要求1所述的猪圆环病毒3型cap蛋白组装成的猪圆环病毒的病毒样颗粒。
9.权利要求1所述的猪圆环病毒3型cap蛋白、权利要求6或7所述的核酸或权利要求8所述的病毒样颗粒在制备抗猪圆环病毒3型的疫苗中的应用。
10.一种抗猪圆环病毒3型的病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述病毒样颗粒疫苗包括权利要求8所述的病毒样颗粒。
技术总结