本发明涉及体外诊断免疫检测领域，具体而言，涉及一种肺炎支原体抗原及其制备方法和应用。
背景技术：
肺炎支原体(mp)是一种病原性支原体，是社区获得性肺炎的重要病原，其感染可引起原发性非典型肺炎；还可引起人类呼吸道感染性疾病如支气管炎、咽炎等，严重者可引发并发症累及神经系统、血液系统、心血管系统以及皮肤、肌肉、关节等。总之，由mp感染引起的呼吸道损伤及各种肺外并发症已引起广发关注。
由于mp感染常无特异性临床表现，及时确诊病因，避免病情恶化，做到早发现早治疗，已成为mp感染性疾病治疗的当务之急，因此，mp感染的早期诊断尤为重要。
肺炎支原体抗体分为igg和igm抗体两种，mp感染的潜伏期为2-3周，大约7-10天左右出现igm抗体，20天左右出现igg抗体。当患者出现症状而就诊时，igm抗体已达到相当高的水平，因此，igm抗体阳性可作为急性感染期的诊断指标。但如igm抗体阴性，也不能否定肺炎支原体感染，还需检测igg抗体。此外，检测到mp特异性igm并不能表明患者处于急性感染期，因为在感染后一年内，特异性igm仍能持续升高。所以，在mp的血清学诊断方法中，需动态观察，检测igm抗体和igg抗体总抗体，才能较好地辅助mp的临床诊断。
在肺炎支原体感染的体外诊断中，最重要的是选用抗原性强、特异性好的抗原。随着分子生物技术不断发展，许多mp的主要抗原基因被克隆表达、纯化、用于mp抗体检测。schurwanzn等将p1蛋白全长分为16段分别构建了重组蛋白，发现其中hp14段免疫原性最强，将该段蛋白与p30蛋白构建成为融合蛋白hp14/30，用纯化后的融合蛋白可刺激产生相应特异性抗体。hp14/30免疫豚鼠后血清可将mp对人肺支气管上皮细胞的黏附率抑制到5％，接近于mp全菌体免疫豚鼠血清的效果。然而，mp全菌抗原的制备工艺要求严格、步骤复杂，常混有其它蛋白，价格昂贵，批次间产品质量不均一，且在生产使用过程中有感染人类的危险性。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种肺炎支原体抗原。
本发明的第二目的在于提供一种编码肺炎支原体抗原的核酸分子。
本发明的第三目的在于提供与核酸分子相关的生物材料。
本发明的第四目的在于提供肺炎支原体抗原或核酸分子或生物材料在制备肺炎支原体检测产品中的应用。
本发明的第五目的在于提供一种肺炎支原体检测试剂。
本发明的第六目的在于提供一种肺炎支原体检测试剂盒。
本发明的第七目的在于提供一种肺炎支原体抗原的制备方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种肺炎支原体抗原，其为如下(a)或(b)：
(a)由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将seqidno.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有相同功能的蛋白质。
一种编码肺炎支原体抗原的核酸分子，其为如下(a)或(b)：
(a)编码seqidno.1的dna序列；
(b)与(a)的dna序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。
进一步地，核酸分子为seqidno.2所示的dna序列。
与本发明的核酸分子相关的生物材料，所述生物材料为如下任一种：
(a)表达盒，含有本发明的核酸分子；
(b)重组载体，含有本发明的核酸分子或(a)中表达盒；
(c)重组真核细胞，含有本发明的核酸分子、(a)中表达盒或(b)中重组载体；
(d)重组原核细胞，含有本发明的核酸分子、(a)中表达盒或(b)中重组载体。
本发明的肺炎支原体抗原或核酸分子或生物材料在制备肺炎支原体检测产品中的应用。
进一步地，肺炎支原体检测产品所采用的检测方法包括化学发光法、elisa或胶体金快速检测法。
一种肺炎支原体检测试剂，所述肺炎支原体检测试剂所用抗原包括本发明的肺炎支原体抗原。
一种肺炎支原体检测试剂盒，包括本发明的肺炎支原体抗原或检测试剂。
一种肺炎支原体抗原的制备方法，将核酸分子进行表达，得到所述肺炎支原体抗原。
进一步地，将核酸分子与表达载体重组得到重组载体，该重组载体导入宿主后表达，得到肺炎支原体抗原；
优选地，所述表达载体为pet28a载体；
优选地，所述宿主为大肠杆菌，优选为e.colirosetta；
优选地，该重组载体导入宿主后表达，再经纯化和浓缩，得到肺炎支原体抗原。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的肺炎支原体抗原为抗原性的蛋白序列p1m：residues1340-1518，具体为seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将seqidno.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。该抗原序列是通过采用生物信息学、基因工程等技术方法获得的mp特异性抗原片段，经免疫血清学检测技术验证，该抗原的特异性强、灵敏度高，检测效果均高于mp抗原p1，且该抗原易于培养纯化，更有利于工业化生产，节约成本。此外，该抗原适用于mp抗体检测产品的制备，该产品可以为体外免疫诊断领域任何形式的产品，具备广阔的市场前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中肺炎支原体抗原的诱导表达和ni柱纯化样品的sds-page蛋白电泳图，其中，m：proteinmarker；s:超声破碎后的离心上清液；50：50mm咪唑洗脱液；100：100mm咪唑洗脱液；500：500mm咪唑洗脱液；
图2为本发明实施例2中肺炎支原体抗原的q柱纯化样品的sds-page蛋白电泳图，其中，m：proteinmarker；ft：q柱流穿液；1：100mmnacl洗脱液；2：200mmnacl洗脱液；3：1mnacl洗脱液。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明保护一种肺炎支原体抗原，其为如下(a)或(b)：
(a)由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将seqidno.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
本发明提供的肺炎支原体抗原为抗原性的蛋白序列p1m：residues1340-1518。该抗原序列通过采用生物信息学、基因工程等技术方法获得的mp特异性抗原片段，经免疫血清学检测技术验证，该抗原的特异性强、灵敏度高，检测效果均高于mp抗原p1，且该抗原易于培养纯化，更有利于工业化生产，节约成本。此外，该抗原适用于mp抗体检测产品的制备，该产品可以为体外免疫诊断领域任何形式的产品，具备广阔的市场前景。
wlvgqlpstsdgntsstnnlapntntgndvvgvgrlsesnaakmnddvdgivrtplaelldgegqtadtgpqsvkfkspdqidfnrlfthpvtdlfdpvtmlvydqyiplfidipasvnpkmvrlkvlsfdtneqslglrleffkpdqdtqpnnnvqvnpnngdflplltassqgpqt(seqidno.1)。
本发明还保护一种编码肺炎支原体抗原的核酸分子，其为如下(a)或(b)：
(a)编码seqidno.1的dna序列；
(b)与(a)的dna序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。
肺炎支原体采用独特的偏性密码子系统，通用的终止密码子uga在肺炎支原体中编码色氨酸，如果直接采用肺炎支原体的野生基因会造成翻译的中断，限制了抗原的制备。为了克服此困难，本发明采用大肠杆菌偏好性密码子反向翻译本发明的抗原氨基酸序列，获得由大肠杆菌偏好性密码子组成的重组抗原基因核酸分子。该核酸分子可以完整、准确地表达本发明的肺炎支原体抗原。核酸分子优选为seqidno.2所示的dna序列。
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本发明还保护与核酸分子相关的生物材料，生物材料为如下任一种：
(a)表达盒，含有本发明的核酸分子；
(b)重组载体，含有本发明的核酸分子或(a)中表达盒；
(c)重组真核细胞，含有本发明的核酸分子、(a)中表达盒或(b)中重组载体；
(d)重组原核细胞，含有本发明的核酸分子、(a)中表达盒或(b)中重组载体。
本发明还保护肺炎支原体抗原或核酸分子或生物材料在制备肺炎支原体检测产品中的应用。肺炎支原体检测产品所采用的检测方法可以为化学发光法、elisa或胶体金快速检测法等等，本发明提供的肺炎支原体抗原适用于体外免疫诊断领域任何形式的产品。
本发明还保护一种肺炎支原体检测试剂，其所用抗原包括本发明的肺炎支原体抗原。同时提供一种肺炎支原体检测试剂盒，该试剂盒包括本发明的肺炎支原体抗原或检测试剂。检测试剂例如可以为免疫层析试纸等。
本发明最后保护一种肺炎支原体抗原的制备方法，将本发明的核酸分子进行表达，得到所述肺炎支原体抗原。
在优选的实施方式中，将核酸分子与表达载体重组得到重组载体，该重组载体导入宿主后表达，得到肺炎支原体抗原。其中，表达载体可以为pet28a载体；宿主可以为大肠杆菌，优选为e.colirosetta；该重组载体导入宿主后表达，再经纯化和浓缩，得到肺炎支原体抗原。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1：本发明目的基因合成及重组载体的构建
1、利用protscale等软件分析肺炎支原体抗原p1的全部氨基酸序列(mpfh株)，筛选出包含抗原性的蛋白序列p1m:residues1340-1518，其氨基酸序列如seqidno:1所示。
2、本发明采用大肠杆菌偏好性密码子反向翻译上述氨基酸序列，获得由大肠杆菌偏好性密码子组成的重组抗原基因。采用基因合成方法，连接在pet28a载体上，编码抗原的基因序列如seqidno:2所示。
实施例2：肺炎支原体抗原的诱导表达纯化和应用
1、将实施例1中的重组载体p1m-pet28a转入大肠杆菌e.colirosetta(de3)感受态细胞，在含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml的氯霉素的lb培养平板上培养，37℃、培养14-16h；筛选阳性重组菌，挑取单菌落接种到5ml含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml的氯霉素的lb培养基中，过夜培养。
2、按1％接种量将上述过夜培养的菌液接种至含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml的氯霉素的lb培养基中，37℃、250rpm，培养至菌液od600为1.0-1.3，再用终浓度为0.5mm-1.0mm的iptg于25℃、250rpm条件下诱导3-4h。
3、离心收集2得到的大肠杆菌e.colirosetta菌体，冰上加入20mllysisbuffer(ph7.5)重悬固体，至肉眼不可见块状菌体。
4、超声破碎：按照超声功率400w，超声4s，停3s，循环99次的条件破碎细菌，直至菌液清亮透明为止。超声结束后，于4℃，12000rpm,离心30min(离心机提前预冷)分离上清与沉淀。
5、向步骤4分离的上清加入平衡好的1mlniresin，置于冰盒中摇床振荡孵育1hour。
6、将孵育好的混合物倒入重力柱，用干净的ep管收集流穿液，待流穿液全部流完之后，加入15ml的lysisbuffer将管路中残留的流穿液洗干净。
7、洗脱：ni柱分别用50mm、100mm和500mm咪唑洗脱，按峰分管收集洗脱液，并留样20μl。
8、将上述步骤留样的样品，按照洗脱的先后的顺序进行sds-page，结果如图1所示，其中，m：proteinmarker；s:超声破碎后的离心上清液；50：50mm咪唑洗脱液；100：100mm咪唑洗脱液；500：500mm咪唑洗脱液，colony-3和colony-4为两株菌株的检测结果。
9、q柱纯化
q柱准备：用q柱高盐buffer冲洗10cv，然后用低盐buffer平衡10cv。
上样：将ni柱纯化后的样品用buffera稀释至10ml，以1ml/min的流速q柱层析，用干净的瓶子收集流穿液。
清洗：上样结束后，用buffera冲洗柱子15cv以上。洗脱：以100mmnacl、200mmnacl、1mnacl梯度洗脱，按峰分管收集洗脱液，并留样20μl。电泳：按洗脱顺序进行sds-page(4％-20％梯度胶)，结果如图2所示，其中，m：proteinmarker；ft：q柱流穿液；1：100mmnacl洗脱液；2：200mmnacl洗脱液；3：1mnacl洗脱液。
实施例3：特异性和灵敏度检测
基于抗原抗体特异性结合的原理，利用酶标记的igm抗体、肺炎支原体抗原包被的磺化磁珠，采用化学发光法检测肺炎支原体抗原与igm抗体的结合反应性。采用免疫血清学检测技术，检测本发明提供的重组p1m抗原以及p1抗原(作为对比例)的应用效果，具体地，包括如下步骤：
包被磺化磁珠：将肺炎支原体抗原与磺化磁珠以一定比例混合，采用珠海丽珠试剂股份有限公司自主研发的buffer洗涤、包被、清洗后，制成磁珠工作液；
按照珠海丽珠试剂股份有限公司自主研发的工艺流程，制成酶标记的抗体igm工作液；
采用化学发光法检测肺炎支原体抗原的反应性，记录发光值，进行数据统计分析，结果如下表1所示。
表1p1m抗原和p1抗原免疫血清学检测结果
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
sequencelisting
<110>珠海丽珠试剂股份有限公司
<120>肺炎支原体抗原及其制备方法和应用
<160>2
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<210>1
<211>178
<212>prt
<213>人工序列
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<213>人工序列
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ctggagttcttcaaaccggatcaagacacccagccgaacaacaacgtgcaggttaacccg480
aacaacggtgactttctgccgctgctgaccgcgagcagccaaggtccgcagacctaa537
1.一种肺炎支原体抗原，其特征在于，其为如下(a)或(b)：
(a)由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将seqidno.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
2.一种编码肺炎支原体抗原的核酸分子，其特征在于，其为如下(a)或(b)：
(a)编码seqidno.1的dna序列；
(b)与(a)的dna序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，核酸分子为seqidno.2所示的dna序列。
4.与权利要求2或3所述的核酸分子相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为如下任一种：
(a)表达盒，含有权利要求2或3所述的核酸分子；
(b)重组载体，含有权利要求2或3所述的核酸分子或(a)中表达盒；
(c)重组真核细胞，含有权利要求2或3所述的核酸分子、(a)中表达盒或(b)中重组载体；
(d)重组原核细胞，含有权利要求2或3所述的核酸分子、(a)中表达盒或(b)中重组载体。
5.权利要求1所述的肺炎支原体抗原或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料在制备肺炎支原体检测产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，肺炎支原体检测产品所采用的检测方法包括化学发光法、elisa或胶体金快速检测法。
7.一种肺炎支原体检测试剂，其特征在于，所述肺炎支原体检测试剂所用抗原包括权利要求1所述的肺炎支原体抗原。
8.一种肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的肺炎支原体抗原或权利要求7所述的检测试剂。
9.一种肺炎支原体抗原的制备方法，其特征在于，将权利要求2或3所述的核酸分子进行表达，得到所述肺炎支原体抗原。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，将核酸分子与表达载体重组得到重组载体，该重组载体导入宿主后表达，得到肺炎支原体抗原；
优选地，所述表达载体为pet28a载体；
优选地，所述宿主为大肠杆菌，优选为e.colirosetta；
优选地，该重组载体导入宿主后表达，再经纯化和浓缩，得到肺炎支原体抗原。
技术总结