本发明涉及转基因技术领域及植物病害防治领域，具体涉及水稻素转录因子osarf17基因及其在抗水稻黑条矮缩病毒植物育种中的应用。
背景技术：
水稻黑条矮缩病毒(riceblack-streakeddwarfvirus,rbsdv)是一种具有重要危害的水稻病毒，该病毒是正二十面体球状结构，直径为75-80nm，其寄主范围主要在禾本科植物。受感染的植物表现出严重的发育迟缓，叶片背面出现白色的蜡状或瘤状突起，对经济作物水稻、玉米、小麦和大麦产量造成严重影响。该病曾在2009-2011年间出现大爆发，造成严重的经济损失。从致病机理层面而言，水稻黑条矮缩病毒(rbsdv)是由灰飞虱(nilaparvatalugens)经卵传播(shikataandkitagawa1977；ruanetal.1984)，一旦植物被感染，通常是无法治愈的；因此，水稻黑条矮缩病毒病在水稻中也被称为“癌症”(azuhataetal.2019)。
rbsdv是呼肠孤病毒科(reoviridae)斐济病毒属(fijivirus)的重要成员之一，近年来，国内外学者对rbsdv分子生物学功能开展了大量的研究，包括基因组学、蛋白组学以及病毒蛋白与寄主因子互作等方面。例如，研究人员发现rbsdvp5-1，p6,p9是病毒复制毒质的重要组成部分。p7-2与s-phasekinase-associatedprotein1(osskp1)相互作用形成scf复合物。p8蛋白编码病毒的内层衣壳蛋白，具有抑制转录活性的功能。p10编码的外壳蛋白，能够激发内质网应激反应。这些报道有助于我们对rbsdv致病机制的进一步研究。
rbsdv侵染的植株表现出的明显发病症状为植株矮缩、叶色浓绿、分蘖增加。rbsdv侵染的寄主范围很广，像禾本科的水稻、玉米、小麦等经济作物都能侵染，目前主要侵染玉米和水稻两种重要的经济作物。气候变化及耕作制度等因素的影响，水稻黑条矮缩病毒病的发生越来越严重，同时防治难度加大。传统的防治是通过喷洒杀虫剂来减少灰飞虱的数量，但喷施杀虫剂会带来一系列的农药残留问题。因此，防治黑条矮缩病毒病最经济有效的措施是培育抗病性品种。近年来，越来越多的水稻转基因抗性材料，为作物抗病育种提供重要的理论及实际意义。
生长素作为植物生长类激素(iaa)，不仅参与调节植物生长发育，而且在植物抗病免疫方面扮演着重要的角色。关于生长素信号途径的研究发现，当植物细胞中iaa含量比较低时，生长素转录抑制蛋白(aux/iaa)会与生长素转录因子(arf)结合，抑制arf的转录活性，进而调控生长素相关基因的表达。当细胞内生长素含量较高时，iaa与生长素受体tir1一起去结合aux/iaa蛋白，在e3泛素连接酶scftir1复合物的作用下促使aux/iaa蛋白发生泛素化降解，同时释放出arf，调控生长素相关应答基因的转录。arf能够特异性结合生长素初期响应基因的启动子，对生长素响应基因的表达起激活或抑制作用。目前，关于植物生长素途径参与植物抗病的研究发现，生长素信号能拮抗sa介导的对病原细菌的抗性；生长素信号在植物应对营腐生生活的病原菌侵染时发挥重要的作用；此外，烟草花叶病毒(tmv)能与arf相互作用，从而影响植物的症状发生。但目前，关于水稻中生长素转录因子osarf17参与抗rbsdv侵染还没有相关报道。
为了克服现有技术的困难，进一步了解病毒致病机制以及水稻自身抗病途径，本发明提供了一种水稻生长素转录因子osarf17基因在抗水稻黑条矮缩病毒中的应用。本发明利用植物转基因技术将全长的osarf17基因导入水稻，进一步筛选到表达量较高的转基因株系，并对其进行接种rbsdv，获得具有显著增强rbsdv抗性的水稻株系，具体而言：本发明通过构建osarf17的过表达载体，利用农杆菌介导法导入水稻品种中花11中，获得可稳定遗传的转基因水稻。通过人工接种水稻黑条矮缩病毒(rbsdv)实验，发现在水稻中过表达osarf17基因，能显著增强水稻对rbsdv侵染的抗性，表现为植株发病症状减轻、发病率降低，病毒含量减少等技术效果。这为我们更好的防控水稻病毒病提供重要的理论依据和新策略，同时也为生产实践中选育水稻抗病毒新品种提供一种新的种质资源。
技术实现要素：
在一个实施方案中,本发明涉及一种水稻生长素转录因子osarf17基因；
一方面，一种水稻生长素转录因子osarf17基因,其核苷酸序列如seqidno.1所示或与seqidno:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸或由其组成。
另一方面，一种水稻生长素转录因子osarf17蛋白,其氨基酸序列为seqidno.1所编码的氨基酸或与seqidno:1编码的氨基酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸或由其组成。
在一个实施方案中，本发明涉及所述水稻生长素转录因子osarf17在抗斐济病毒(fijivirus)禾本科粮食作物育种中的应用；
一方面，所述斐济病毒属(fijivirus)包括玉米粗缩病毒(maizeroughdwarfvirus，mrdv)、水稻黑条矮缩病毒(riceblackstreakeddwarfvirus，rbsdv)；最优选水稻黑条矮缩病毒；
另一方面，所述禾本科粮食作物优选水稻，玉米，小麦，燕麦和大麦；更优选水稻，最优选淮稻5号、日本晴、武育粳3号等粳稻品种；
在一个实施方案中，本发明涉及一种转基因水稻的构建方法，包括如下步骤：
1.克隆osarf17基因,将其构建到植物表达载体pcambia1300上，获得pcambia1300-osarf17重组表达载体；
2.将重组表达载体转染农杆菌，愈伤组织诱导培养，农杆菌转染愈伤组织、抗性愈伤组织的筛选培养、获得绿色植株；
3.对绿色植株进行培养，通过rt-pcr及qrt-pcr进行检测，获得表达量较高的osarf17转基因植株；
一方面，所述克隆osarf17基因的步骤包括：根据osarf17的开放阅读框设计引物osarf17-f和osarf17-r，所用的引物序列如下：
osarf17-f：5’-atgaggctttcgtcgtcgt-3；
osarf17-r：5’-gaattcaactgagccgacag-3’；
所述pcr扩增体系：总体积50μl，包括10×pcrbuffer5μl，上下游引物(10μm)各1.5μl，dntpmix(2.5mm)5μl，cdna模板1μl，taq酶(5u/μl)1μl，ddh2o35μl。
pcr扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸3min，40个循环；72℃终延伸10min，将pcr产物回收；
将pcr产物回收产物连接pmd18-t载体，挑克隆，送测，获得正确pmd18-t-osarf17重组表达载体，测序确认克隆基因的正确性。
另一方面，所述转染农杆菌的步骤如下：
取目的质粒加到eha105农杆菌感受态中，轻轻混匀，加入到清洗干净并且预冷的电极杯中，电击转化，加入无抗性的lb液体培养基，摇床震荡培养后,涂布在含卡纳霉素及利福平的平板上，28℃培养箱培养3d；
另一方面，所述愈伤组织诱导培养步骤为：取成熟的水稻种子，脱壳，用75％的酒精浸泡,ddh2o清洗去除酒精；用30％的次氯酸钠溶液，浸泡半小时；用ddh2o清洗后再浸泡半小时，用镊子放入成熟胚诱导培养基中，放入28℃光照培养箱培养，将长出的愈伤组织转移到继代培养基中，28℃光照培养箱继代培养；
成熟胚诱导培养基包括：n6培养基24.1g/l、2mg/l2,4-d、ph＝5.8。
继代培养基包括：n6培养基24.1g/l、2,4-d、50mg/l潮霉素、300mg/ml头孢霉素、ph＝5.8。
另一方面，所述农杆菌转染愈伤组织步骤为：挑取农杆菌的单克隆接种到lb液体培养基，培养od600＝0.6左右；集菌用含aam的农杆菌悬浮培养液悬浮菌体，使od600的终浓度为0.1。将诱导好的愈伤组织放入aam农杆菌悬浮培养液中浸泡。将愈伤组织取出，放入共培养基中，光照培养箱培养。
另一方面，所述抗性愈伤组织的筛选培养步骤为：将愈伤组织放在含有潮霉素b的培养基上经30-45d的筛选，将筛选后的愈伤组织放入生根培养基中，光照培养，产生带根的绿色植株，培养2周，通过筛选获得转基因植株。
生根培养基包括：1/2ms39.45g/l、0.5mg/lnaa、50mg/l潮霉素、ph＝5.8。
附图说明
图1：osarf17过表达转基因水稻osarf17的相对表达量
图2：rbsdv侵染30d后，osarf17过表达转基因及对照zh11的发病率情况对比
图3：rbsdv侵染30d后，osarf17过表达转基因及对照zh11的发病症状情况对比其中，mock:空白对照；rb：病毒侵染
图4：rbsdv侵染30d后，osarf17过表达转基因及对照zh11中的病毒含量检测情况对比
具体实施方式
本发明所转水稻品种为中花11，简称zh11；
实例1:水稻osarf17植物表达载体构建
(1)水稻叶片总rna的提取及cdna序列的合成
用rna提取试剂trizolreagent提取植物总rna，并利用tiangenfastquantrtkit反转录试剂盒把提取的rna反转录为cdna。
(2)水稻osarf17基因的克隆
根据osarf17的开放阅读框设计引物osarf17-f和osarf17-r，所用的引物序列如下：
osarf17-f：5’-atgaggctttcgtcgtcgt-3’(seqidno:3)；
osarf17-r：5’-gaattcaactgagccgacag-3’(seqidno:4)；
pcr扩增体系：总体积50μl，包括10×pcrbuffer5μl，上下游引物(10μm)各1.5μl，dntpmix(2.5mm)5μl，cdna模板1μl，taq酶(5u/μl)1μl，ddh2o35μl。
pcr扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸3min，40个循环；72℃终延伸10min。
将pcr产物回收，连接pmd18-t载体(takara生物公司，货号d101a)，挑克隆，送测，获得正确pmd18-t-osarf17重组表达载体，送杭州擎科生物公司测序。得到如seqidno:1所示，长度为2754bp，编码971个氨基酸的osarf17基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示：
其cds序列如seqidno.2所示：
植物过表达载体的构建
设计带有酶切位点的引物，利用引物pcambia1300-osarf17-f、pcambia1300-osarf17-r扩增osarf17，用于osarf17双元表达载体的构建。
pcr扩增体系：总体积50μl，包括10×pcrbuffer5μl，上下游引物(10μm)各1.5μl，dntpmix(2.5mm)5μl，cdna模板1μl，taq酶(5u/μl)1μl，ddh2o35μl。
pcr扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸3min，40个循环；72℃终延伸10min。
将pcambia1300载体(公司：上海柯雷生物科技有限公司，货号：kl-zl-0829)用bamh1与sac1双酶切，将获得的pcr产物及载体酶切回收，连接，挑取单克隆，送杭州擎科生物公司测序。获得正确的pcambia1300-osarf17重组表达载体，所用引物序列如下：
pcambia1300-osarf17-f:
gttccagattacgctggatccatgaggctttcgtcgtcgt
(seqidno:5)
pcambia1300-osarf17-r:
atcggggaaattcgagctcttagaattcaactgagccgac
(seqidno:6)
实例2水稻遗传转化
农杆菌转化：取保存在-80℃冰箱pcambia1300-osarf17的重组载体转化根瘤农杆菌eha105(厂家：上海唯地生物技术有限公司，货号：ac1012)，具体步骤如下：取2μl目的质粒加到50μleha105农杆菌感受态中，轻轻混匀，加入到清洗干净并且4℃预冷的电极杯中，用2200v的电压点击转化，加入600μl无抗性的lb液体培养基，28℃,200rpm摇床震荡培养2-3h,涂布在含50μg/ml卡纳霉素及50μg/ml的利福平平板上，28℃培养箱培养3d。
(2)水稻愈伤组织诱导培养：成熟的水稻种子(本实验选用成熟的中花11水稻种子)，脱壳，用75％的酒精浸泡1min,ddh2o清洗2-3遍去除酒精；用30％的次氯酸钠溶液，浸泡半小时；用ddh2o清洗后再浸泡半小时。用镊子放入成熟胚诱导培养基中，放入28℃光照培养箱，培养3周，将长出的愈伤组织用灭菌的镊子转移到继代培养基中，28℃光照培养箱继代培养1周。
成熟胚诱导培养基成分：n6培养基(厂家：海博生物科技有限公司，货号：hbz0601)24.1g/l、2mg/l2,4-d、ph＝5.8。
继代培养基成分：n6培养基(厂家：海博生物科技有限公司，货号：hbz0601)24.1g/l、2,4-d、50mg/l潮霉素、300mg/ml头孢霉素、ph＝5.8。
农杆菌转染愈伤组织：挑取eha105的单克隆接种到lb液体培养基，培养od600＝0.6左右。集菌用含aam的农杆菌悬浮培养液(厂家：今品化学技术上海有限公司，货号：b01154)悬浮菌体，使od600的终浓度为0.1。将诱导好的愈伤组织放入aam农杆菌悬浮培养液中浸泡5min。将愈伤组织取出，放入共培养基中，26℃光照培养箱培养2.5d。
共培养基成分：n6培养基(厂家：海博生物科技有限公司，货号：hbz0601)24.1g/l、2mg/l2,4-d、200μmol/l的乙酰丁香酮、ph＝5.2。
(4)抗性愈伤组织的筛选与培养：将愈伤组织放在含有潮霉素b的培养基上经30-45d的筛选，将筛选后的愈伤组织放入生根培养基中，光照培养，产生带根的绿色植株，培养2周，通过筛选获得转基因植株oe17-2-5和oe17-3-2。
生根培养基：1/2ms(厂家：海博生物科技有限公司，货号：hb8469-6)39.45g/l、0.5mg/lnaa、50mg/l潮霉素、ph＝5.8。
实例3转基因植株的阳性鉴定
rt-pcr检测
用sds法提取转基因水稻的基因组dna。
步骤如下：称取1-2mg新鲜水稻叶片于2mlep管中，液氮研磨，震碎。加入400μltp，震荡混匀，放于65℃金属浴中，30min。4℃，1,3000g离心，10min。取上清于新的1.5mlep管中，加入等体积的异丙醇，4℃，30min。4℃，1,3000g离心，10min。弃上清。加入700μl的75％的酒精洗，4℃，1,3000g离心，2min(可再重复一次)。弃上清，空离，1min，室温干燥10-20min，加入适量的mq水，得到的dna可用于后续实验或保存于-20℃。
取0.5μldna模板，进行pcr扩增，扩增体系10μl，pcr产物大小2754bp。检测引物如下：
osarf17-detect-f:atgaggctttcgtcgtcgt(seqidno:7)
osarf17-detect-r:gaattcaactgagccgac(seqidno:8)
转基因植株qrt-pcr验证分析
提取阳性转基因植株叶片总rna，反转录为cdna，以水稻的多聚泛素酶ubq基因作为内参。定量引物采用qrt-osarf17，osarf17的相对表达量如图1所示，2个过表达株系(oe17-2-5和oe17-3-2)osarf17基因的相对表达量显著高于对照组zh11。定量引物序列如下：
qrt-osarf17-f:gctttgggagattgagccct(seqidno:9)
qrt-osarf17-r:tctcggagccacatgagaga(seqidno:10)
ubq-f:accacttcgaccgccactact(seqidno:11)
ubq-r:acgcctaagcctgctggtt(seqidno:12)
实例4转基因水稻接种rbsdv
将需要接种病毒的转基因水稻株系及对照组zh11浸种2d，用湿润的纱布覆盖催芽1d，播种于1l烧杯中，每杯30-35株苗，3个生物学重复，30℃，16h光照8h黑暗培养。
刚孵化出1-2龄的无毒灰飞虱，在rbsdv侵染的水稻苗上获毒3-5d，转移至健康的水稻苗上度循回期(rbsdv在灰飞虱体内完成侵染循环所需时间)10d后，得到可用来传播rbsdv的灰飞虱。
用龄期相同携带rbsdv和健康的灰飞虱进行病毒接种实验，按3头每株苗接的比例，将带毒/不带毒灰飞虱接种于三～四叶期(15d左右的苗)水稻苗上，接毒3d后扫出所有的虫子。
将接毒的水稻苗移栽至人工智能温室(30℃，16h光照8h黑暗)培养观察。30d后，观察植株发病症状并通过qrt-pcr确定水稻的发病情况。
实例5接种rbsdv后水稻抗性分析
rt-pcr检测水稻带毒率
以rbsdv的基因组s10设计病毒特异性检测引物，序列如下：
rb-s10-f:aacaaccgaccaacaatcac(seqidno:13)
rb-s10-r:gagcaggaacttcacgacag(seqidno:14)
10μlpcr体系，pcr扩增条件为：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃10min终延伸，4℃保存。根据水稻的发病症状及rt-pcr检测结果判断水稻是否携带rbsdv。
如图2所示，osarf17两个过表达转基因株系(oe17-2-5和oe17-3-2)发病率为40％和39％,而对照发病率为51％。以上结果表明，过表达osarf17后显著降低转基因的发病率。
注：发病率＝发病株数/总株数*100％
qrt-pcr检测病毒含量
水稻移栽30d后，与对照zh11相比较，osarf17两个过表达转基因株系(oe17-2-5和oe17-3-2)未出现明显的矮缩症状，而对照表现出明显的矮缩，如图3所示。发病的水稻植株混池取样，每个样品3个生物学重复，进一步通过qrt-pcr检测病毒s4、s6、s10基因表达量，如图4所示，转基因株系病毒s4、s6、s10基因的表达量显著性低于对照分别约为0.4、0.5、0.6倍。上述结果表明转基因植株对rbsdv侵染的抗性受osarf17基因的影响，水稻中过表达osarf17后可以显著的增强水稻对rbsdv侵染的抗性。
qrt-pcr检测引物如下：
qrt-s4-f:atttgcgttttgcaatttcc(seqidno:15)
qrt-s4-r:gctctacgacgaccaaatcc(seqidno:16)
qrt-s6-f:agcgtgttgaaaacgagatc(seqidno:17)
qrt-s6-r:cgctttgcaaattcaacaag(seqidno:18)
qrt-s10-f:aacaaccgaccaacaatcac
qrt-s10-r:gagcaggaacttcacgacag
综合以上实验数据可知：
本发明通过将植物重要激素生长素途径转录因子osarf17过表达获得稳定遗传的转基因植株，通过实验证实：osarf17基因过表达能够提高水稻对黑条矮缩病毒的抗性，丰富了抗水稻黑条矮缩病毒病的种质资源；此外，本发明将植物激素途径与抗病结合起来，开拓了水稻病毒病致病机理的研究方向；最后，本发明可以为水稻基因工程抗病育种提供新的基因源和新种质，对提高水稻农业作物产量起到极大的促进作用。
sequencelisting
<110>宁波大学
<120>水稻转录因子osarf17基因及其在抗黑条矮缩病毒植物育种中的应用
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gctcatgctgcttcaacaaatagccggtttacaattttttataacccaagagcaagccct840
tcagagtttgttatcccactttctaaatatgttaaggctgtatatcatacccgtatatct900
gtgggcatgcgtttcaggatgctttttgagacagaagagtcaagtgtacggagatacatg960
ggcacgataacaggaattagtgatcttgatgctgctcgttggccaaactcacattggcgt1020
tctgtaaaggttggctgggatgaatcaactgccggagagaggcagccaagggtgtcgctt1080
tgggagattgagcccttgacaactttcccaatgtacccatctccttttccactcagactg1140
aagcgtccatggccaacaggcttgccttcattacatggtggtaaggatgacgacttgact1200
tcttctctcatgtggctccgagacagcgcaaatcctggtttccaatcattgaatttcggg1260
ggtctcggtatgaatccttggatgcagccaaggtttgatgcttccttacttggtctgcaa1320
cctgacatgtatcaaacgatagctgcgactgctttccaggacccaacaaagcaggtctct1380
cccacgatattgcagttccagcagccgcagaacataggtggcagagctaatacacttctg1440
ccaagtcagattttgcagcaagtgcagcctcagtttcagcagcagcaatacctccaaaac1500
atcaacgagaccacaatccaagggcatgctcagtctgagttccttcagcagcagctccaa1560
cgctgccagtcgtttactgagcagaagccacagctgcaaacccagcaacaacagcaagaa1620
tcacagcaacaac1633
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
atgaggctttcgtcgtcgt19
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
gaattcaactgagccgacag20
<210>5
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
gttccagattacgctggatccatgaggctttcgtcgtcgt40
<210>6
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
atcggggaaattcgagctcttagaattcaactgagccgac40
<210>7
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>7
atgaggctttcgtcgtcgt19
<210>8
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>8
gaattcaactgagccgac18
<210>9
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>9
gctttgggagattgagccct20
<210>10
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>10
tctcggagccacatgagaga20
<210>11
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>11
accacttcgaccgccactact21
<210>12
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>12
acgcctaagcctgctggtt19
<210>13
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>13
aacaaccgaccaacaatcac20
<210>14
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>14
gagcaggaacttcacgacag20
<210>15
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>15
atttgcgttttgcaatttcc20
<210>16
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>16
gctctacgacgaccaaatcc20
<210>17
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>17
agcgtgttgaaaacgagatc20
<210>18
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>18
cgctttgcaaattcaacaag20
1.一种水稻生长素转录因子osarf17基因,其核苷酸序列如seqidno.1所示。
2.一种水稻生长素转录因子osarf17蛋白,其氨基酸序列为seqidno.1所编码的氨基酸。
3.权利要求1所述水稻生长素转录因子osarf17在抗斐济病毒(fijivirus)禾本科粮食作物育种中的应用。
4.权利要求3所述的应用，所述斐济病毒属(fijivirus)优选玉米粗缩病毒(maizeroughdwarfvirus，mrdv)、水稻黑条矮缩病毒(riceblackstreakeddwarfvirus，rbsdv)；最优选水稻黑条矮缩病毒。
5.权利要求4所述的应用，所述禾本科粮食作物优选水稻，玉米，小麦，燕麦和大麦；更优选水稻，最优选淮稻5号、日本晴、武育粳3号。
6.一种转基因水稻的构建方法，其步骤包括：
1).克隆osarf17基因,将其构建到植物表达载体pcambia1300上，获得pcambia1300-osarf17重组表达载体；
2).将所述重组表达载体转染农杆菌，愈伤组织诱导培养，农杆菌转染愈伤组织、抗性愈伤组织的筛选培养、获得绿色植株；
3).对绿色植株进行培养，通过rt-pcr及qrt-pcr进行检测，获得表达量较高且稳定遗传的osarf17转基因植株。
7.权利要求6所述方法，所述克隆osarf17基因步骤为：根据osarf17的开放阅读框设计引物osarf17-f和osarf17-r，所用的引物序列如下：
osarf17-f：5’-atgaggctttcgtcgtcgt-3；
osarf17-r：5’-gaattcaactgagccgacag-3’；
pcr扩增体系：总体积50μl，包括10×pcrbuffer5μl，10μm上下游引物各1.5μl，2.5mmdntpmix5μl，cdna模板1μl，5u/μltaq酶1μl，ddh2o35μl；
pcr扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸3min，40个循环；72℃终延伸10min，4℃保存；
将pcr产物回收，连接到pmd18-t载体上，挑克隆，送测，获得正确pmd18-t-osarf17重组表达载体，测序确认克隆osarf17基因的正确性。
8.权利要求6-7任一项所述方法，所述重组表达载体转染农杆菌步骤为：
取所述重组表达载体加到eha105农杆菌感受态中，混匀，加入到清洗干净并且预冷的电极杯中，电击转化，加入无抗性的lb液体培养基，摇床震荡培养后,涂布在含卡纳霉素及利福平的平板上，28℃培养箱培养3d；所述lb液体培养基包括以下成分：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l。
9.权利要求6-8任一项所述方法，所述愈伤组织诱导培养步骤为：取成熟的水稻种子，脱壳，用75％的酒精浸泡,ddh2o清洗去除酒精；用30％的次氯酸钠溶液，浸泡半小时；用ddh2o清洗后再浸泡半小时，用镊子放入成熟胚诱导培养基中，放入28℃光照培养箱培养，将长出的愈伤组织转移到继代培养基中，28℃光照培养箱继代培养；所述成熟胚诱导培养基成分包括：n6培养基24.1g/l、2mg/l2,4-d、ph＝5.8；所述继代培养基包括：n6培养基24.1g/l、2mg/l2,4-d、50mg/l潮霉素、300mg/ml头孢霉素、ph＝5.8。
10.权利要求6-9任一项所述的方法，所述农杆菌转染愈伤组织步骤为：挑取农杆菌的单克隆接种到lb液体培养基，培养od600＝0.6左右；收集菌体用含aam的农杆菌悬浮培养液悬浮菌体，使od600＝0.1；将诱导好的愈伤组织放入aam农杆菌悬浮培养液中浸泡；将愈伤组织取出，放入共培养基中，光照培养箱培养。
11.权利要求6-10任一项所述的方法，所述抗性愈伤组织的筛选培养步骤为：将愈伤组织放在含有潮霉素b的培养基上经30-45d的筛选，将筛选后的愈伤组织放入生根培养基中，光照培养，产生带根的绿色植株，培养2周，通过筛选获得转基因植株；所述生根培养基包括：1/2ms39.45g/l、0.5mg/lnaa、50mg/l潮霉素、ph＝5.8。
技术总结