本发明属于基因工程和蛋白质工程
技术领域：
，涉及sirpa变体、融合蛋白、及其应用。
背景技术：
：cd47是一种广泛分布的细胞膜蛋白，作为先天免疫系统的关键“别吃我”信号，通过与抑制性免疫受体信号调节蛋白α(signalregulatoryproteinα，sirpα)结合，进而抑制吞噬作用。cd47因分布的广泛性，影响人体多种生理和病理功能，特别是在肿瘤的发生和发展方面得到了广泛关注。cd47属于免疫球蛋白超家族成员，分子量约52kda，是一种广泛表达的高度糖基化跨膜蛋白，在其n末端有1个igv样结构域，并具有5个跨膜区段和可选择性剪接高疏水性细胞质c末端。cd47分子具有4种亚型，cd47亚型2表达最广泛，主要分布在造血细胞、血管内皮细胞和上皮细胞，而亚型1分布在角质细胞，亚型3和4均分布在神经元细胞、肠粘膜细胞和睾丸细胞中。cd47分子的配体为血小板反应蛋白1(thrombospondin1，tsp1)和sirpα，cd47与巨噬细胞上sirpα结合导致胞内src2酪氨酸磷酸酶结构域激活并抑制吞噬细胞突触中肌球蛋白的积累，最终向巨噬细胞发出“别吃我”信号。cd47作为天然免疫重要的“免疫检查点”分子，发挥着重要的生理和病理功能。研究发现在造血干细胞迁移期间，cd47选择性表达上调以躲避吞噬作用，而cd47低表达可导致巨噬细胞清除衰老或受损细胞。据报道，为维持人体红细胞的正常功能，新生红细胞表面大量表达cd47分子以避免巨噬细胞的吞噬，而衰老红细胞表面cd47表达下调促进巨噬细胞清除衰老红细胞。此外，研究发现在人类斑块中发现坏死细胞(necroticcells，ncs)积累，并证明nc表面过表达cd47导致动脉粥样硬化病变中炎症增加和坏死形成，由此推测这是由于免疫系统清除功能缺陷以躲避巨噬细胞的吞噬。而病理功能方面，红细胞表面cd47下调可能导致溶血性贫血的发生。在肿瘤发生发展过程中，cd47表现出至关重要的作用，其在肿瘤细胞表面广泛表达，如卵巢癌、胃癌和小细胞肺癌[等，抑制巨噬细胞吞噬肿瘤效应，从而逃逸天然免疫系统的识别和杀伤，并在多种临床前模型中，已证实阻断cd47-sirpα相互作用能增强体外巨噬细胞吞噬肿瘤细胞能力和体内抗肿瘤免疫应答。近年来，cd47不仅在天然免疫中发挥作用，其也影响t细胞功能，借助异种移植瘤小鼠模型证实阻断cd47信号通路能促使t细胞介导的免疫原性肿瘤消除。基于在天然免疫和获得性免疫中cd47的重要功能，研究者们不断致力于cd47-sirpα信号通路相关作用机制及下游相关信号的研究，并逐渐明确其在多种疾病特别是肿瘤相关疾病的关键作用，所以靶向cd47分子药物成为最为热门的肿瘤药物研发靶点之一。越来越多数据表明，抗体或fc融合蛋白能阻断cd47-sirpα信号通路，激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，这种吞噬机制为靶向cd47分子的肿瘤免疫治疗药物开发提供了十分有力的理论基础。tti-621是sirpα类似物，属于重组fc融合蛋白类药物，由人sirpα的n末端免疫球蛋白样v结构域融合至人igg1fc区获得。该分子与cd47分子的亲和力比人sirpα的整个胞外区域的亲和力高至少5倍，且分子量较小(约80kda)，具有更好的组织渗透性和分布能力，此外，相较于cd47抗体药物，tti-621最大优势在于与人红细胞不结合，但是仍会与血小板及白细胞结合，这在一定程度上提高了该药物临床应用的安全性。从trilliumtherapeutic官网(https://trilliumtherapeutics.com/pipeline/#tti621)获知，tti-621正在开展2项i期临床试验，一项为tti-621单药(0.2mg/kg)或tti-621(0.1mg/kg)联合利妥昔单抗经静脉注射给药治疗复发或难治性血液系统恶性肿瘤，结果显示，其具有良好的客观反应性和耐受性，仅有18％的患者出现小于3级的血小板减少不良反应。另一项旨在评估tti-621对于复发或难治性蕈样肉芽肿和sézary综合征的治疗效果，考虑药物的安全性，研究者采用经皮注射的局部给药方式，结果显示，tti-621耐受性良好，91％(20/22)蕈样肉芽肿患者局部病变有明显好转，并显现出远端及全身治疗效应。tti-621的临床开发优势显而易见，虽存在轻微血小板毒性，但仍提示我们靶向cd47分子的药物值得期待，也为进一步临床开发提供了借鉴。技术实现要素：：本发明的目的之一在于提供一种sirpa变体及其融合蛋白。本发明的目的之二在于提供一种编码上述变体或融合蛋白的dna分子，重组载体或者宿主细胞。本发明的目的之三在于提供包含上述sirpa变体及其融合蛋白的药物组合物或试剂盒。本发明的目的之四在于提供sirpa变体及其融合蛋白的用途。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明提供了一种sirpa变体，所述sirpa变体的氨基酸序列为以下组中的任意一个：(1)如seqidno.1所示的氨基酸序列；(2)在seqidno.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。(3)与(1)或(2)限定的氨基酸序列至少具有99％同源性且具有相同功能的氨基酸序列。优选地，所述sirpa变体的氨基酸序列如seqidno.1所示。在seqidno.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸的个数不超过10个。本发明中的“人抗体fc段”是指“人免疫球蛋白重链恒定区”，可以来源于属于称为iga、igd、ige、igg及igm的各免疫球蛋白类别的抗体。此外，预期免疫球蛋白重链恒定区可以来源于本领域中称为igg1、igg2、igg3和igg4的任一igg抗体子类。优选地，本发明的人抗体fc段来自于人抗体igg1。优选地，本发明的所述人抗体fc段的氨基酸序列为以下组中的任意一个：(1)如seqidno.2所示的氨基酸序列；(2)在seqidno.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列；(3)与(1)或(2)限定的氨基酸列至少具有98％同源性且具有相同功能的氨基酸序列。更优选地，所述人抗体fc段的氨基酸序列如seqidno.2所示。本发明的上述融合蛋白sirpa变体-fc的氨基酸序列为以下组中的任意一个：(1)如seqidno.3所示的氨基酸序列；(2)在seqidno.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列；(3)与(1)或(2)限定的氨基酸列至少具有98％同源性且具有相同功能的氨基酸序列。优选地，本发明的融合蛋白sirpa变体-fc的氨基酸序列如seqidno.3所示。因一个或多个保守氨基酸取代或因一个或多个非保守性氨基酸取代、缺失或插入而sirpa变体-fc序列，其中这些取代、缺失或插入不会废除该野生型序列的生物活性。保守取代通常包括一个氨基酸被具有类似特征的另一氨基酸取代，例如在以下各组内的取代：缬氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；及苯丙氨酸、酪氨酸。其它保守氨基酸取代是本领域中已知的并且包括在本文中。非保守性取代，如碱性氨基酸被疏水性氨基酸置换，也是本领域中众所周知的。对本发明的融合蛋白sirpa变体-fc进行增加蛋白质或肽稳定性的修饰也包括在本发明的保护范围之内；这样的修饰包括在蛋白质或肽序列中含有例如一个或多个非肽键(用以代替肽键)；这样的修饰还包括包含d-氨基酸或非天然存在或合成的氨基酸，例如β或γ氨基酸。可将本文所描述的sirpa变体或其融合蛋白在体外用于结合测定，诸如免疫测定。举例来说，在一些实施方案中，以液相形式利用本文所描述的sirpa变体或其融合蛋白使其结合至固相载体。在一些实施方案中，以各种方式对用于免疫测定的sirpa变体或其融合蛋白进行可检测标记。在一些实施方案中，使本文所描述的sirpa变体或其融合蛋白结合至各种载体并且用于检测特定抗原表达细胞的存在。载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙(nylon)、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及磁铁矿。载体的性质可为可溶性的或不溶性的。各种不同的标记和标记方法为已知的。标记的实例包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶态金属、化学发光化合物以及生物发光化合物。用于将标记结合至本文所公开的多肽的各种技术为可获得的。在一些实施方案中，使sirpa变体或其融合蛋白与低分子量半抗原偶联。然后通过第二反应特异性地检测这些半抗原。举例来说，在一些实施方案中，将半抗原生物素与亲和素一起使用，或用特异性抗半抗原抗体(例如分别抗二硝基酚抗体、抗吡哆醛抗体以及抗荧光素抗体)来检测半抗原二硝基酚、吡哆醛或荧光素。本发明提供了一种编码前面所述的sirpa变体或融合蛋白的dna分子。进一步，所述dna分子的核苷酸序列为以下组中的任意一个：(1)如seqidno.4所示的核苷酸序列或其简并序列；(2)在seqidno.4所示的核苷酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸所得的核苷酸序列；所述核苷酸序列seqidno.4所示的核苷酸序列或其简并序列编码功能相同或相似蛋白质；(3)在严格条件下与(1)限定的核苷酸序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列；(4)与(1)限定的核苷酸序列至少具有98％同源性且具有相同功能的核苷酸序列。本发明所述“严格条件”可为在6×ssc、0.5％sds溶液中，在65℃下与seqidno.4所示的核苷酸序列发生特异性杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。在严格条件下与seqidno.4限定的核苷酸序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列与seqidno.4所示的序列至少大约40％-50％同源，大约60％、65％或70％同源，甚至至少98％或更多同源。即序列同一性的范围分布在至少大约40％-50％、大约60％、65％或70％同源，甚至至少大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性。可通过多种方法来制备前面所述的dna分子。这些方法包括但不限于寡核苷酸介导(或定点)诱变和pcr诱变。在一些实施方案中，使用标准技术(例如基因合成)来获得前面所述的dna分子。在一些情况下，使用核苷酸合成仪或pcr技术合成dna分子。本发明提供了一种包含前面所述的dna分子的重组载体。如本文中所使用，术语“载体”应理解为意指包含了能够并入到宿主细胞中并与宿主细胞基因组重组并整合到宿主细胞基因组中，或作为游离体自主复制的核苷酸序列的任何核酸。此类载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒(cosmid)、rna载体、病毒载体等。在本发明中适用的载体包括但不限于：表达载体、克隆载体，例如适用于原核(如大肠杆菌等细菌)、低等真核细胞(如酵母)、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞中的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。可用于本发明的病毒载体包括但不限于腺病毒载体(adenoviralvectors)、腺相关病毒载体(adeno-associatedviralvectors)、反转录病毒载体(retroviralvectors)、单纯疱疹病毒载体(herpessimplexvirus-basedvectors)、慢病毒载体(lentiviralvectors)。载体可包括各种组分或元件。在一些实施方案中，载体组分包括但不限于转录和翻译调控序列，诸如启动子序列、核糖体结合位点、信号序列、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、3’和5’非翻译区(utr)以及增强子或激活子序列；复制起点；选择标记物基因；以及编码感兴趣的多肽的核酸序列以及转录终止序列。在一些实施方案中，表达载体包含与控制或调控序列、可选择标记物、任何融合配偶体、额外元件或其任何组合可操作连接的蛋白质。术语“可操作地连接”意味着将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中。通常，这些表达载体包括可操作地连接至编码fc变体的核酸的转录和翻译调控核酸，并且典型地适合于用于表达蛋白质的宿主细胞。可使用选择基因或标记物，诸如但不限于抗生素抗性基因或荧光蛋白基因来例如通过抗生素或荧光表达而选择含有表达载体的宿主细胞。各种选择基因为可获得的。在一些实施方案中，对载体的组分或元件进行优化以使得表达载体与宿主细胞类型相容。在本公开中使用的表达载体包括但不限于使蛋白质能够在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母中以及体外系统中表达的那些表达载体。本发明还提供了包含前面所述的dna分子或重组载体的宿主细胞。进一步，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。哺乳动物细胞类型的实例包括但不限于人胚胎肾(hek)(例如hek293、hek293f)细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela、cos、pc3、vero、mc3t3、ns0、sp2/0、very、bhk、mdck、w138、bt483、hs578t、htb2、bt20、t47d、ns0(不内源地产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、crl7030以及hss78bst细胞。大肠杆菌菌株的实例包括但不限于大肠杆菌294(atcc-31,446)、大肠杆菌λ1776(atcc-31,537、大肠杆菌bl21(de3)(atcc-baa-1025)以及大肠杆菌rv308(atcc-31,608)。不同的宿主细胞具有用于蛋白质产物的翻译后加工和修饰(例如糖基化)的特征和特定机构。在一些实施方案中，选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的多肽的正确修饰和加工。在将载体引入宿主细胞中来产生蛋白质后，将宿主细胞在适当改良的常规营养培养基中培养以诱导启动子，选择转化体或扩增编码所需序列的基因。本发明还提供了前面所述的融合蛋白的制备方法：(1)构建前面所述的重组载体；(2)将重组载体导入宿主细胞表达；(3)分离纯化融合蛋白。进一步，能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种，可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包括(但不限于)哺乳动物细胞、细菌、酵母、昆虫细胞等。由于本发明优化融合蛋白的氨基酸序列中包含可糖基化的氨基酸，因此哺哺乳动物细胞是表达该蛋白的优选系统。可用于大规模表达蛋白质的哺乳动物细胞有多种，例如cho细胞、293细胞、ns0细胞、cos细胞、bhk细胞等，其它许多细胞也可以用于蛋白的表达，因此都包括在本发明所能使用的细胞之列。哺乳动物细胞以外的其他表达系统，例如细菌、酵母、昆虫细胞等也可以用于表达本发明的优化融合蛋白，它们也被包含本发明所能使用的宿主细胞之列。这些表达系统的蛋白质产量比哺乳动物细胞的较高，但是所表达的蛋白质缺乏糖基化或形成的糖链结构与哺乳动物细胞有所不同。含有编码上述融合蛋白基因的重组质粒可经转染进入宿主细胞，转染细胞的方法有多种，其中包括(但不限于)电穿孔法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等。在一些情况下，使用不含细胞的翻译系统使包含融合蛋白在体外表达。来源于原核(例如大肠杆菌)和真核(例如小麦胚芽、兔网织红细胞)细胞的体外翻译系统为可获得的，并且在一些实施方案中，基于感兴趣的蛋白质的表达水平和功能特性进行选择。举例来说，如本领域技术人员所了解，体外翻译是一些展示技术，例如核糖体展示所需要的。另外，在一些实施方案中，通过化学合成方法来产生sirpa变体或融合蛋白，所述化学合成方法诸如但不限于液相肽合成。由于融合蛋白含有免疫球蛋白fc，因此可以用蛋白a亲和层析法来纯化所表达的融合蛋白。此外，与其它蛋白纯化方法如离子交换层析等联合使用，可进一步纯化本发明的融合蛋白。本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括前面所述的sirpa变体、前面所述的融合蛋白、前面所述的dna分子、前面所述的重组载体、或前面所述的宿主细胞。进一步，本发明的所述药物组合物还包括还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，可接受的载体、赋形剂或稳定剂包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、hepes、tae以及其它有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如例如氯化六甲铵；氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(例如小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖以及免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸以及赖氨酸；单糖、二糖以及其他碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖以及山梨糖醇；螯合剂，诸如edta糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；甜味剂和其他调味剂；填料，诸如微晶纤维素、乳糖、玉米淀粉以及其他淀粉；结合剂；添加剂；着色剂；成盐反离子，诸如钠；金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)；非离子表面活性剂，诸如tweentm、pluronicstm以及聚乙二醇(peg)；或其任何组合。本发明的药物组合物可以通过多种手段施用，所述手段例如通过口服、舌下、口腔、肠胃外、经鼻、经局部、经直肠、经皮、经粘膜等。根据药物组合物的施用形式，可将药物组合物制备成相应的各种剂型，所述剂型包括但不限于片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂。在一些实施方案中，包含本文所描述的药物组合物呈水溶性形式，诸如以药学上可接受的盐形式存在，所述药学上可接受的盐意在包括酸加成盐与碱加成盐。术语“药学上可接受的酸加成盐”是指与诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸以及诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等有机酸形成的保留游离碱的生物有效性并且以其他方式不为不希望的那些盐。术语“药学上可接受的碱加成盐”包括衍生自无机碱的那些碱加成盐，诸如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。特别优选的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐以及镁盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺以及叔胺；取代胺，包括天然存在的取代胺；环胺；以及碱性离子交换树脂，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺以及乙醇胺的盐。要用于体内施用的制剂优选是无菌的。这可通过经无菌过滤膜过滤或其他方法来完成。在一些实施方案中，以可注射制剂的形式胃肠外施用本公开的药物组合物。在一些实施方案中，使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介物来配制用于注射的药物组合物。药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水、生理盐水以及细胞培养基(例如杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(dmem)、α-改良伊格尔培养基(α-mem)以及f-12培养基)。各种配制方法为可获得的。在一些实施方案中，将本文所描述的融合蛋白配制成免疫脂质体。脂质体为包含各种类型的脂质、磷脂或表面活性剂的小囊泡，适用于将治疗剂递送给哺乳动物。可通过本领域已知的各种方法来制备融合蛋白的脂质体。在一些实施方案中，将脂质体的组分排列成双层形式，类似于生物膜的脂质排列。在一些实施方案中，通过在包含磷脂酰胆碱、胆固醇以及peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂质组合物存在的情况下的逆相蒸发方法来产生脂质体。在一些实施方案中，使脂质体通过限定孔径的过滤器挤出以产生具有所期望的直径的脂质体。在一些实施方案中，脂质体内任选含有化学治疗剂或其他治疗活性剂。在一些实施方案中，将本文所描述的融合蛋白和其他治疗活性剂包埋在通过包括但不限于凝聚技术、界面聚合的方法制备的微胶囊(例如使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒以及纳米胶囊)以及粗乳液中。在一些实施方案中，制备持续释放制剂。合适的持续释放制剂的实例包括固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品(例如膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯、l-谷氨酸和γ乙基-l-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(诸如luprondepottm，其为由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、聚d-(-)-3-羟基丁酸以及prolease(可从alkermes商购获得，其为由合并至聚dl-丙交酯-共-乙交酯(plg)的基质中的所需生物活性分子组成的基于微球的递送系统)。一些持续释放制剂使得分子的释放能够历时几个月，例如一个月至六个月，而其他制剂在更短的时间段(例如数天至数周)内释放本公开的药物组合物。供治疗的受试者包括人，非人哺乳动物，例如伴侣动物，诸如狗、猫、马等；实验室哺乳动物，诸如兔、小鼠、大鼠等等。应了解，用于任何特定受试者的具体剂量水平和剂量频率可以变化，并且将取决于多种因素，包括所用药物组合物的活性；该药物组合物的代谢稳定性和作用时间长度；受试者的物种、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的模式和时间；排泄速率和清除率；药物组合；及特定病状的严重程度。本发明的药物组合物可以单独使用，或与其他治疗剂组合使用。举例来说，其他治疗剂包括免疫肿瘤学抗体，免疫肿瘤学抗体包括但不限于：西妥昔单抗、耐昔妥珠单抗、派姆单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、medi0680、med16469、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、medi6383、rg7888、伊匹单抗、曲美木单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、enoblituzumab、凡地吐单抗、万利鲁单抗、莫加珠单抗、sar650984、达雷木单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-艾美坦辛、帕妥珠单抗、埃罗妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、奥滨尤妥珠单抗、rg7155、fpa008、帕尼单抗、本妥昔单抗-维度汀、msb0010718c、贝利木单抗、贝伐珠单抗、地诺单抗、帕尼单抗、雷莫芦单抗、耐昔妥珠单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿维鲁单抗、阿特珠单抗、度伐鲁单抗、medi0680、匹地利珠单抗或bms-93659、抗her2抗体、抗cd20抗体、抗cd19抗体、抗cs1抗体、抗cd38抗体、抗egfr抗体、抗pd1抗体、抗rankl抗体、抗ox40抗体、抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗cd274抗体、抗ctla-4抗体、抗cd137抗体、抗4-1bb抗体、抗b7-h3抗体、抗fzd7抗体、抗cd27抗体、抗ccr4抗体、抗cd38抗体、抗csf1r抗体、抗csf抗体、抗cd30抗体、抗baff抗体、抗vegf抗体或抗vegfr2抗体。本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的sirpa变体、前面所述的融合蛋白、前面所述的dna分子、前面所述的重组载体、或前面所述的宿主细胞。进一步，所述试剂盒包括前面所述的sirpa变体、前面所述的融合蛋白、前面所述的dna分子、前面所述的重组载体、或前面所述的宿主细胞的使用说明书。任选地，所述试剂盒还包括至少一种额外试剂。作为非限制性实例，化学治疗剂或抗肿瘤抗体可用作至少一种额外的药剂。在一些实施方案中，试剂盒包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上提供或与试剂盒一起提供或以其他方式伴随试剂盒的任何书写或记录的材料。本发明还提供了前面所述的sirpa变体、前面所述的融合蛋白、前面所述的dna分子、前面所述的重组载体、或前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物的应用，所述应用包括以下任一项所述的应用：(1)在制备前面所述的试剂盒中的应用；(2)在制备抑制sirpa与cd47相互作用的药物中的应用；(3)在制备增强巨噬细胞吞噬功能的药物中的应用；(4)在制备消除调节性t细胞的药物中的应用；(5)在制备治疗sirpa或cd47活性相关的疾病的药物中的应用。进一步，所述sirpa或cd47活性相关的疾病包括癌症、免疫性疾病；更进一步，所述癌症选自实体瘤癌症、血液学癌症、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、支气管癌、肝癌、卵巢癌、结肠和直肠癌、胃癌、胃部癌症、胆囊癌、胃肠道基质瘤癌症、甲状腺癌、头颈癌、口咽癌、食管癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、默克尔细胞癌、病毒诱导的癌症、成神经细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、神经胶质瘤、脑肿瘤、癌瘤。更进一步，所述免疫性疾病包括自体免疫疾病、炎症疾病。优选地，所述自体免疫疾病或所述炎性疾病选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、抗体介导的炎症或自体免疫疾病、移植物抗宿主病、败血症、糖尿病、银屑病、动脉粥样硬化、舍格伦综合征、进行性系统性硬化症、硬皮病、急性冠状动脉综合征、缺血再灌注、克罗恩氏病、子宫内膜异位症、肾小球性肾炎、重症肌无力、特发性肺纤维化、哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ards)、血管炎、炎性自体免疫性肌炎。如本文中所用，术语“治疗”是指出于获得效果的目的施用药剂或执行程序。在一些实施方案中，就完全或部分预防疾病或其症状而言，效果是预防性的。在一些实施方案中，就影响疾病或疾病症状的部分或完全治愈而言，效果是治疗性的。本发明中作为对照的sirpa蛋白是截取sirpa(ncbireferencesequence:np_001035111.1)胞外段的一部分，其氨基酸序列如seqidno:4所示。本发明的优点和有益效果如下：相比tti-621，本发明的融合蛋白增强巨噬细胞吞噬能力的效果更显著，且具有更好的血液安全性。附图说明图1显示利用sds-page检测本发明的融合蛋白的电泳图；图2显示利用elisa法检测本发明的融合蛋白的结合活性图；图3显示利用fortebio生物膜层干涉技术检测本发明的的融合蛋白与cd47-his抗原的结合动力学和亲合力结果图；图4显示利用elisa法检测本发明的融合蛋白对野生型sirpa与cd47相互作用的抑制结果图；图5显示利用促巨噬细胞吞噬活性实验检测本发明的融合蛋白对巨噬细胞吞噬活性的影响图；图6显示利用血凝实验检测本发明的融合蛋白对血液凝集反应的影响图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室指南(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1融合蛋白的表达、纯化和鉴定1、sirpa变体-fc重组质粒的构建sirpα变体dna片段的制备：基因序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；利用pcr手段引入酶切位点(nheⅰ-hf和xhoⅰ)和保护碱基(ccgt)；借助qiagen胶回收试剂盒回收目的pcr片段，即为sirpα变体的dna片段。酶切条件：37℃，16h，酶切体系如下：连接条件：16℃，4h，连接体系如下：转化：连接产物经42℃热击90s转化至top10感受态细胞中，涂板，倒置于37℃孵育箱培养16h；挑取经鉴定正确的单克隆菌落进行培养和扩增。sirpa变体-fc重组质粒提取：挑取经鉴定正确的单克隆菌落进行培养和扩增，利用质粒提取试剂盒获取目的重组载体。2、sirpα变体-fc融合蛋白(编号：106)的表达细胞复苏与培养：将冻存的293t细胞取出，迅速将其放至37℃恒温水浴锅中解冻，将解冻后的细胞重悬于10mldmem完全培养基(取10％进口胎牛血清混合于90％dmem培养基中)中，1200rpm，离心4min，将管底细胞弹匀，用dmem完全培养基重悬，于37℃恒温细胞培养箱中培养。转染与表达：传代培养至第三代的293t细胞以适当的密度接种至15cm的细胞培养皿中，当细胞密度达到60％时，更换新鲜培养基，将sirpα变体-fc质粒(编号：106)转染至293t细胞。待细胞密度达到100％时，更换无血清蛋白表达培养基(90％293tge(cat.cm-1156-11)与10％cdfeedx(cat.cf1116-12)混合；上述产品均购买于北京百普赛斯生物科技有限公司)，37℃培养72h，上清即为sirpα变体-fc重组质粒的表达产物。3、sirpα变体-fc融合蛋白(编号：106)纯化收集：将上述表达产物离心3500rpm，30min，用0.45μm滤膜过滤，以除去细胞及细胞碎片；纯化与保存：借助aktaprimeplus纯化仪，采用蛋白a亲和层析法进行纯化，并用tris调节纯化产物ph至6.5-7.0，将收取的纯化产物用50kd的超滤管超滤，pbs置换2次后，用bca蛋白定量试剂盒测定浓度并分装保存于-80℃。sds-page：4μgsirpα变体-fc融合蛋白(编号：106)，4-20％梯度蛋白预制胶，200v，0.5h，使用estainl1蛋白染色仪(南京金斯瑞生物科技有限公司)染色，蛋白胶扫描图像并保存，结果如图1所示，图中1泳道代表蛋白marker，2泳道代表sirpα变体-fc融合蛋白。实施例2融合蛋白的结合力和亲和力检测1、利用elisa法检测sirpa变体-fc融合蛋白(编号：106)与cd47分子结合活性1.1实验步骤包被：cd47(1μg/ml)，100μl/孔，4℃，过夜，pbst洗3次；封闭：1.5％酪蛋白封闭液，37℃，1h，pbst洗3次；加样：15μg/ml，3倍稀释，12个梯度，100μl/孔，37℃，1h，pbst洗3次；加检测抗体：gah-igg-hrp，室温，45min，pbst洗3次；显色：tmb，100μl/孔，3min，终止：2nh2so4，100μl/孔；读数：酶联检测仪od450nm读取数值，保存数据；数据处理：graphpadprism81.2实验结果结果如图2所示，sirpa变体-fc融合蛋白(编号：106)与cd47的结合活性优于sirpα(序列如seqidno:4所示)和tti-621。2、使用fortebio生物膜层干涉技术测量sirpa变体-fc融合蛋白与cd47-his抗原的结合动力学和亲合力2.1实验步骤用anti-humaniggfccapture(ahc)芯片捕获高亲和力sirpa-fc，将待测分子用运行缓冲液(pbs 0.1％吐温20 0.02％bsa)稀释至10μg/ml，上样时间为90s；分析物cd47-his同样用运行缓冲液梯度稀释至相应的浓度(50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.125nm、1.56nm、0.78nm和0nm)，待测分子与分析物结合时间100s，解离时间600s；芯片用10mm甘氨酸hcl、ph＝1.7溶液5秒脉冲重复3次进行再生。测定数据拟合成1:1结合模型，来测定平衡解离常数kd。2.2实验结果结果如图3所示，平衡解离常数kd为1.341e-10。3、识别表位竞争(elisa)3.1实验步骤包被：cd47(1μg/ml)，100μl/孔，4℃，过夜，pbst洗3次；封闭：1.5％酪蛋白封闭液，1h，pbst洗3次；加sirpα-biotion(0.25μg/ml，自制生物素标记的野生型sirpα)，100μl/孔，1h，pbst洗3次；加sirpa变体-fc融合蛋白浓度依次为：40、7.7、1.48、0.28(μg/ml)，100μl/孔，37℃，1h，pbst洗3次；加检测抗体streptadinvin-hrp，室温，45min，pbst洗3次；显色：tmb，100μl/孔，3min，终止：2nh2so4，100μl/孔；读数：酶联检测仪读取od450值，保存数据；数据处理：graphpadprism83.2实验结果结果如图4所示，本发明的sirpa变体-fc融合蛋白对野生型sirpa与cd47相互作用的抑制率显著高于sirpα、tti-621；表明sirpα变体具有更强的阻断天然sirpa与cd47相互作用的活性。4、促巨噬细胞吞噬活性检测4.1实验原理：通过cd47抗体阻滞cd47-sirpa信号轴，进而抑制巨噬细胞接收“别吃我”信号，增加巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的效率，以期能利用流式细胞术结果来筛选具有优良促吞噬活性的融合蛋白。4.2实验材料与试剂：健康志愿者外周血单核细胞、m-csf、无胰酶消化液、1640培养基、sirpa变体-fc融合蛋白、sirpα、tti-621、raji细胞系、anti-humancd14(apc)、cfse、血清。4.3实验步骤：巨噬细胞的获取：含m-csf(50ng/ml)的1640完全培养基 10％fbs，37℃，5％co2孵育箱诱导单核细胞向巨噬细胞分化，每3天换液(半换)，第7-10天即可获得巨噬细胞；细胞准备：将诱导分化的巨噬细胞用消化液消化，用无血清1640培养基洗两次，计数；细胞密度7.7*105个/ml(共1ml)；将raji细胞1200rpm离心4min，加入2μlcfse，37℃标记15min，并加入40％血清终止，室温5min；稀释：用无血清1640培养基将sirpa变体-fc融合蛋白、sirpα、tti-621稀释至30μg/ml；制备细胞样品并标记：巨噬细胞与raji细胞(cfse)按1:10混匀并以每个100μl分装至1.5mlep管中，保证每个样品巨噬细胞数为2.5*104个；raji(cfse)细胞数为2.5*105个；在细胞样品中分别加入50μl稀释好的sirpa变体-fc融合蛋白、sirpα、tti-621，至终浓度为10μg/ml；37℃反应4h，加facs缓冲液清洗一次；加入anti-humancd14(apc)抗体，4℃，30min；facs缓冲液清洗两次；1％多聚甲醛固定；流式细胞术进行检测分析。4.4实验结果结果如表1和图5所示。组别阳性率(gate％)平均荧光强度(mean)巨噬细胞对照20csfe对照55.5406sirpα80.21089tti-62167.5581sirpa变体-fc融合蛋白87.51329上述实验结果表明，sirpa变体-fc融合蛋白(编号：106)对巨噬细胞吞噬raji细胞有促进作用，并且其促进作用优于sirpα和tti-621。5、血凝实验实验目的：通过血凝实验检测融合蛋白对血液凝集的影响实验材料：健康志愿者全血、阿氏液、pbs、圆底96孔板、融合蛋白实验步骤：红细胞悬液的制备：采集健康志愿者全血1:1放入阿氏液中，用pbs洗涤3-5次，用pbs配制成2％红细胞悬液备用；样品稀释：将sirpa变体-fc融合蛋白、tti-621、hu5f9用pbs稀释至终浓度从100μg/ml开始，倍比稀释12个梯度；将配置好的2％红细胞悬液100μl/孔，加入圆底96孔板，将100μl稀释好的样品加入红细胞悬液中；37℃，静置4h，观察是否出现溶血现象。实验结果：结果如图6所示，hu5f9对照组100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml均出现溶血现象，tti-621组100μg/ml出现溶血现象，pbs对照组未出现溶血现象，而sirpa变体-fc融合蛋白(编号：106)所有浓度梯度均未出现溶血现象。通过血凝实验可知，sirpa变体-fc融合蛋白对血液凝集反应未产生影响。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。序列表<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院<120>sirpa变体、融合蛋白、及其应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>117<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gluleuglnvalileglnproasplysservalleuvalalaalagly151015gluthralathrleuargcysthralathrserleuleuproilegly202530proileglntrppheargglyalaglyproglyargvalleuiletyr354045asnglnargasnglyhispheproargvalthrthrilesergluser505560thrargarggluasnmetasppheserilelysileglnasnilethr65707580proalaaspalaglythrtyrtyrcysvallysphearglysglyser859095proaspaspvalgluphelysserglyalaglythrgluleuserval100105110argalalysproser115<210>2<211>233<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2leugluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocyspro151015alaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolys202530prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval354045valvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyr505560valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu65707580glntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhis859095glnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlys100105110alaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysglygln115120125proarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleu130135140thrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrpro145150155160seraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasn165170175tyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleu180185190tyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnval195200205phesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrgln210215220lysserleuserleuserproglylys225230<210>3<211>350<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gluleuglnvalileglnproasplysservalleuvalalaalagly151015gluthralathrleuargcysthralathrserleuleuproilegly202530proileglntrppheargglyalaglyproglyargvalleuiletyr354045asnglnargasnglyhispheproargvalthrthrilesergluser505560thrargarggluasnmetasppheserilelysileglnasnilethr65707580proalaaspalaglythrtyrtyrcysvallysphearglysglyser859095proaspaspvalgluphelysserglyalaglythrgluleuserval100105110argalalysproserleugluprolyssercysasplysthrhisthr115120125cysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalphe130135140leupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrpro145150155160gluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluval165170175lyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthr180185190lysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalserval195200205leuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscys210215220lysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileser225230235240lysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupropro245250255serargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuval260265270lysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasngly275280285glnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspserasp290295300glyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrp305310315320glnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhis325330335asnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys340345350<210>4<211>117<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gluleuglnvalileglnproasplysservalleuvalalaalagly151015gluthralathrleuargcysthralathrserleuileprovalgly202530proileglntrppheargglyalaglyproglyarggluleuiletyr354045asnglnlysgluglyhispheproargvalthrthrvalseraspleu505560thrlysargasnasnmetasppheserileargileglyasnilethr65707580proalaaspalaglythrtyrtyrcysvallysphearglysglyser859095proaspaspvalgluphelysserglyalaglythrgluleuserval100105110argalalysproser115当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种sirpa变体，其特征在于，所述sirpa变体的氨基酸序列为以下组中的任意一个：
(1)如seqidno.1所示的氨基酸序列；
(2)在seqidno.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的氨基酸序列至少具有99％同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括权利要求1所述的sirpa变体和人抗体fc段。
优选地，所述人抗体fc段的氨基酸序列为以下组中的任意一个：
(1)如seqidno.2所示的氨基酸序列；
(2)在seqidno.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的氨基酸序列至少具有98％同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为以下组中的任意一个：
(1)如seqidno.3所示的氨基酸序列；
(2)在seqidno.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的氨基酸序列至少具有98％或同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
4.编码权利要求1所述的sirpa变体，或权利要求2或3所述的融合蛋白的dna分子。
5.包含权利要求4所述的dna分子的重组载体。
6.包含权利要求4所述的dna分子或导入权利要求5所述的重组载体的宿主细胞。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的sirpa变体、权利要求2或3所述的融合蛋白、权利要求4所述的dna分子、权利要求5所述的重组载体、或权利要求6所述的宿主细胞；优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的sirpa变体、权利要求2或3所述的融合蛋白、权利要求4所述的dna分子、权利要求5所述的重组载体、或权利要求6所述的宿主细胞；优选地，所述试剂盒还包括权利要求1所述的sirpa变体、权利要求2或3所述的融合蛋白、权利要求4所述的dna分子、权利要求5所述的重组载体、或权利要求6所述的宿主细胞的使用说明书。
9.权利要求1所述的sirpa变体、权利要求2或3所述的融合蛋白、权利要求4所述的dna分子、权利要求5所述的重组载体、或权利要求6所述的宿主细胞、权利要求7所述的药物组合物的应用，其特征在于，所述应用包括以下任一项所述的应用：
(1)在制备权利要求8所述的试剂盒中的应用；
(2)在制备抑制sirpa与cd47相互作用的药物中的应用；
(3)在制备增强巨噬细胞吞噬功能的药物中的应用；
(4)在制备消除调节性t细胞的药物中的应用；
(5)在制备治疗sirpa或cd47活性相关的疾病的药物中的应用。
优选地，所述sirpa或cd47活性相关的疾病包括癌症、免疫性疾病；
更优选地，所述癌症选自实体瘤癌症、血液学癌症、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、支气管癌、肝癌、卵巢癌、结肠和直肠癌、胃癌、胃部癌症、胆囊癌、胃肠道基质瘤癌症、甲状腺癌、头颈癌、口咽癌、食管癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、默克尔细胞癌、病毒诱导的癌症、成神经细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、神经胶质瘤、脑肿瘤、癌瘤。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述免疫性疾病包括自体免疫疾病、炎症疾病；优选地，所述自体免疫疾病或所述炎性疾病选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、抗体介导的炎症或自体免疫疾病、移植物抗宿主病、败血症、糖尿病、银屑病、动脉粥样硬化、舍格伦综合征、进行性系统性硬化症、硬皮病、急性冠状动脉综合征、缺血再灌注、克罗恩氏病、子宫内膜异位症、肾小球性肾炎、重症肌无力、特发性肺纤维化、哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ards)、血管炎、炎性自体免疫性肌炎。
技术总结本发明公开了一种SIRPa变体、融合蛋白、及其应用。本发明的融合蛋白是将SIRPa变体同人抗体Fc片段连接制备而成。经实验证实，相比SIRPa、TTI‑621，本发明的融合蛋白与CD47结合能力更强，从而对野生型SIRPa与CD47之间的相互作用的抑制更显著，进而增强巨噬细胞的吞噬能力，有利于癌症及自身免疫性疾病治疗。本发明的融合蛋白作为治疗癌症的候选药物，极具开发潜力。
技术研发人员：罗龙龙;王志宏;乔春霞;王晶;李新颖;陈国江;胡乃静;周刘忠;肖鹤;冯健男;沈倍奋
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2020.02.18
技术公布日：2020.06.09
