本发明属于生物医药及生物分离相关的技术领域，涉及一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物、及分离方法。
背景技术：
外泌体是细胞多泡内体与质膜融合时释放产生的具有生物活性的微小囊泡，其直径约为30～150nm，是细胞间通讯的重要介质之一；在人健康的生理情况下，外泌体可以在细胞之间运送dna、蛋白质、mrna、mirna等多种生物活性物质，参与细胞通讯、细胞迁移、肿瘤细胞增长等多种过程，完成细胞间物质及信息的传递。文献研究发现，几乎所有类型的细胞均会分泌外泌体，并且在血液、唾液、尿液、脑脊液、积液和乳汁等体液中都能够提取到外泌体。
外泌体与肿瘤、慢性感染性疾病、自身免疫病等很多疾病相关，当机体发生病变时，细胞分泌的外泌体的成分、含量、性质等都可能发生改变；糖基化外泌体在包括肿瘤在内的多种疾病的发生、发展过程中均有着重要作用，外泌体的检测研究能有效监测疾病的发生、发展；由于外泌体在临床样本中含量比较低，外泌体的分离富集对外泌体的研究至关重要。
目前，外泌体分离方法很多，主要有：超速离心法或梯度密度离心法，免疫磁珠法等。其中：超速离心法或梯度密度离心法是基于外泌体与其他生物组份密度的微小差异进行分离，该方法需要特殊设备，样品需求量比较大，耗时长，且因为不同临床样本的特点不同，采用该方法的分离效果稳定性差，进一步地超速离心还容易造成囊泡损伤从而影响后续实验；免疫磁珠法的原理是外泌体表面的特异性蛋白如：cd9/cd63/cd81等与包被有对应抗体的免疫磁珠相结合，进行磁分离，但由于免疫磁珠体积较小，粒径为纳米级别且小于等于外泌体的直径，因此免疫磁珠与外泌体结合的空间位阻较大，外泌体结合不充分，分离效率不高。此外，免疫磁珠法中应用的洗脱液为酸性洗脱液，容易造成外泌体囊泡破裂、形态不完整，因此，也就无法准确分离出糖基化外泌体，并将其应用于疾病的发生、发展等过程中检测、监控及诊断。
因此，一种能快速、精准、自动化高效分离富集临床样本中的糖基化外泌体的组合物及方法的研究建立是必须的。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物，本发明还提供了一种含有该凝集素-磁性载体偶联复合物的糖基化外泌体分离组合物，以及使用该凝集素-磁性载体偶联复合物进行糖基化外泌体分离的方法及应用。本发明提供的凝集素-磁性载体偶联复合物可以精准分离临床样本中的糖基化外泌体，分离效率高，分离后的外泌体形态完整，无破裂或碎裂，可直接用于糖基化外泌体液体检测，或直接进行免疫学相关检测，或直接提取外泌体内相关核酸进行基因检测分析。本发明提供的糖基化外泌体分离的方法中，利用外泌体外表面丰富的糖链可以和凝集素结合的原理，采用有效地清洗及有效地洗脱方法可以分离糖基化外泌体，并且非常简便、快速、容易实现自动化，重复性好，分离后的外泌体形态完整，无破裂或碎裂，将其应用于疾病的发生、发展等过程中检测、监控及诊断。
本发明提供了一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物，包括：磁性载体；和偶联在磁性载体外侧的凝集素；其中：
所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(vva和/或vvl)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素、蜗牛凝集素(haa和/或hpa)中的任意一种或者两种及以上；
所述磁性载体包括：葡聚糖磁珠、琼脂糖磁珠、树脂或环氧树脂磁珠、聚苯乙烯磁珠中的任意一种或者两种及以上。
上述凝集素-磁性载体偶联复合物在某些实施方式中，所述磁性载体粒径分布范围为1μm-200μm，优选为10μm-200μm，更进一步优选为30μm-150μm。
上述凝集素-磁性载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素-磁性载体偶联复合物中，每1ml磁性载体上偶联有1-20mg，优选为5-15mg，进一步优选为10-15mg凝集素。上述磁性载体与凝集素偶联后，使用不含外泌体的牛血清白蛋白缓冲液反应处理，得到最终的凝集素-磁性载体偶联复合物。
上述凝集素-磁性载体偶联复合物在某些实施方式中，所述临床样本包括：血清、血浆、唾液、组织或细胞培养上清液、尿液、脑脊液、淋巴液中的任意一种。
上述凝集素-磁性载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(vva和/或vvl)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素中的任意一种或者两种及以上。
上述凝集素-磁性载体偶联复合物在某些实施方式中，所述糖基化外泌体包括：n-糖基化外泌体、o-糖基化外泌体、岩藻糖基化外泌体中的任意一种或两种及以上。
上述凝集素-磁性载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素-磁性载体偶联复合物保存在保存液中，所获得的凝集素-磁性载体偶联复合物保存液中的凝集素-磁性载体偶联复合物的保存浓度(体积比)为10％-60％，优选比例为30％-50％，进一步优选为40％-50％；凝集素-磁性载体偶联复合物保存液的体积是指凝集素-磁性偶联复合物分散在保存液中后，其与保存液的总体积。
本发明另一方面还提供了一种糖基化外泌体分离组合物，所述糖基化外泌体分离组合物包括：上述凝集素-磁性载体偶联复合物，还包括用于清洗去除分离过程中非特异性结合的、未发生糖基化的外泌体及其他杂质的清洗液，和/或用于洗脱特异性结合在凝集素-磁性载体偶联复合物上的糖基化外泌体的洗脱液。这里的组合物并非是指其混合为一体，而是指其独立包装并同时存在于一个套装中。
上述糖基化外泌体分离组合物在某些实施方式中，所述清洗液为无金属盐离子的清洗缓冲液或纯化水，可选为无金属盐离子清洗缓冲液，进一步可选地为ph值7.6±0.2的无金属盐离子清洗缓冲液，用于清洗去除分离过程中非特异性结合的未发生糖基化的外泌体及其他杂质。
上述糖基化外泌体分离组合物在某些实施方式中，所述洗脱液为溶有糖的硼酸盐缓冲液，可选地为溶有甘露糖的硼酸盐缓冲液，即硼酸盐-甘露糖缓冲液，进一步可选地为ph值为6.5±0.2的硼酸盐-甘露糖缓冲液，该缓冲液十分接近生理ph，用于洗脱结合在凝集素-磁性载体偶联复合物上的糖基化外泌体，洗脱后的外泌体外观形态完整，无破损或裂解。
本发明另一方面还提供了一种糖基化外泌体分离方法，所述分离方法包括应用上述凝集素-磁性载体偶联复合物分离糖基化外泌体的分离步骤，所述分离步骤包括：
临床样本进行前处理；
取前处理后的样本与凝集素-磁性载体偶联复合物充分混匀孵育；
采用磁分离的手段分离结合有糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物，并用清洗液清洗结合有糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物；
用洗脱液洗脱清洗后的凝集素-磁性载体偶联复合物。洗脱上清液即为分离后的糖基化外泌体溶液，洗脱后的外泌体外观形态完整，无破损或裂解。
上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，前处理后的样本与凝集素-磁性载体偶联复合物混合的体积比为0.5-5：1，优选为0.5-3：1，进一步优选为1-2：1。
上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，清洗液清洗结合有糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物时，采用体积为凝集素-磁性载体偶联复合物1-3倍的清洗液清洗1-3次。
上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，洗脱液与凝集素-磁性载体偶联复合物的体积比为0.5-2：1，优选为0.5-1：1。
上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，样本前处理的方法包括以下步骤：
对血清、血浆、唾液、脑脊液或淋巴液样本，将样本经3000g以下速度离心10-15min以去除样本中的细胞碎片、沉淀物杂质，取离心后上清液备用；
对组织或细胞培养上清液、尿液的样本，将样本经3000g以下速度离心10-15min以去除样本中的细胞碎片、沉淀物杂质，然后将上清液通过超滤管进行10-1000倍浓缩后备用。
上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，所述清洗液为无金属盐离子的清洗缓冲液或纯化水，可选地为无金属盐离子的清洗缓冲液，进一步可选地为ph值7.6±0.2的无金属盐离子的清洗缓冲液。
上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，所述洗脱液为溶有糖的硼酸盐缓冲液，可选地为溶有甘露糖的硼酸盐缓冲液，即硼酸盐-甘露糖缓冲液，进一步可选地为ph值6.5±0.2的硼酸盐-甘露糖缓冲液。
上述可以在某些实施方式中，孵育的条件为：室温孵育1-30min，优选为5-20min，进一步优选为10-15min。
本发明还提供了一种使用上述方法分离的外泌体的应用，所述应用包括：糖基化外泌体液体检测、外泌体免疫学检测，或外泌体中核酸提取后的核苷酸片段检测分析。
有益效果：
1、本发明凝集素-磁性载体偶联复合物，分离得到的外泌体均为糖基化外泌体，其形态完整，无破损，可直接用于糖基化外泌体液体检测，外泌体免疫学检测，或核酸提取后的核苷酸序列检测分析等，还可以进一步通过配合相应的设备实现糖基化外泌体快速、精准、自动化分离。
2、本发明凝集素-磁性载体偶联复合物中，所使用的磁性载体的粒径为一般免疫磁珠粒径的10-1000倍，单个磁珠上具有更大表面积，减小了凝集素与磁珠偶联时的空间位阻，利于偶联更多的凝集素，相比之下，同样体积的一般免疫磁珠虽然具有更大的比表面积，但由于空间位阻较大，偶联上的凝集素反而更少，本发明的凝集素-磁性载体偶联复合物中，每1ml磁性载体上可以偶联1-20mg凝集素，而研究发现使用体积较小的免疫磁珠时，每1ml免疫磁珠偶联凝集素的数量为ng级别，偶联效率低；同时该粒径也远远大于外泌体本身的直径，可以减少凝集素和糖基化外泌体结合的空间位阻，有利于凝集素与糖基化外泌体结合，大幅提高外泌体的分离效率。
3、本发明凝集素-磁性载体偶联复合物，对于外泌体含量较少的临床样本，如尿液、组织或细胞培养上清液中的外泌体也有很好的效果；对于外泌体含量较多的临床样本，如血浆中的外泌体进行分离，分离所得糖基化外泌体的浓度可达1011-14个/ml。
4、本发明凝集素-磁性载体偶联复合物中，所采用的凝集素优选植物凝集素，包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(vva和/或vvl)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素，植物凝集素的大量获取更容易，原料更加丰富。
5、本发明糖基化外泌体分离组合物，所使用的是无金属盐离子的清洗缓冲液或纯化水，金属盐离子对凝集素与糖基化外泌体的亲和吸附具有解离作用，影响凝集素与糖基化外泌体的亲和吸附，且金属盐离子浓度越高，解离作用越强，从而影响外泌体的分离效果，甚至无法分离外泌体；无金属盐离子的清洗缓冲液或纯化水可以避免金属盐离子在清洗时候影响外泌体与磁珠表面的凝集素的结合，导致分离得到的外泌体减少或无法分离到外泌体。
6、本发明糖基化外泌体分离组合物，所使用的洗脱液是硼酸盐缓冲液，相比其他缓冲液，具有针对外泌体的更好的洗脱效果，洗脱效率高，使用少量的洗脱液即可完成洗脱，洗脱后的外泌体外观形态完整，无破损或裂解，同时由于使用量较少，相当于同时完成了浓缩外泌体的过程。
7、本发明糖基化外泌体分离方法，样品前处理的方法简单易行，通过简单的离心和/或浓缩，即可有效获得适用于本发明的样本，无需超高速离心处理样本，且可以通过配合相应的设备实现糖基化外泌体快速、精准、自动化分离，可以最大程度地保护样本中的糖基化外泌体。
附图说明
图1：凝集素-磁性载体偶联复合物分离糖基化外泌体的原理示意图。
图2：4种不同样本(细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液)类型分离糖基化外泌体电镜观察图片。
图3：血浆样本分离后糖基化外泌体的nta分析图。
图4：4种不同样本(细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液)外泌体特异性膜蛋白cd9、cd63、cd81抗体westernblot检测结果图。
图5：4种不同样本(细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液)外泌体特异性非膜蛋白alix和tsg101抗体的westernblot检测结果图。
图6：4种不同样本(细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液)外泌体calnexin抗体的westernblot检测结果图。
图7：5种不同清洗缓冲液清洗结合有糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物后，洗脱分离得到的糖基化外泌体溶液的外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81抗体的westernblot检测结果图。
图8：3种不同洗脱液分离得到的糖基化外泌体溶液的电镜检测结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明，现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施案例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。除非特殊说明，以下所用到的各种试剂均为商品化试剂，其中所用的化学试剂不低于分析纯。
实施案例1凝集素-磁性载体偶联复合物制备
凝集素-磁性载体偶联复合物包括：磁性载体；和偶联在磁性载体外侧的凝集素，其是通过凝集素和磁性载体在特定条件下偶联制备而成，主要用于分离临床样本中的糖基化外泌体，分离后得到的糖基化外泌体形态完整。其中：
凝集素主要选用：木菠萝凝集素(jacalin)、花生凝集素(pna)、豌豆凝集素(vva和/或vvl)、刀豆凝集素(cona)、小扁豆凝集素(lca)、麦胚素(wga)、大豆凝集素(sba)、芸豆凝集素(pvl)、蜗牛凝集素(haa和/或hpa)中的任意一种，或者两种及两种以上凝集素联合使用，主要原因为：不同凝集素之间的组合可以实现各种类型糖基化外泌体的分离，如：lca、aal对岩藻糖基化外泌体的分离；cona、pvl、sba、wga、aal等凝集素对n-糖基化外泌体的分离；haa、hpa、vva、pna、jacalin等凝集素对o-糖基化外泌体的分离；单一凝集素主要用于分离与凝集素对应的特定糖基化外泌体，两种及两种以上凝集素联合使用可以用于分离多种不同糖基化的外泌体，或者两种或两种以上凝集素联合使用可以针对特定糖基化外泌体进行协同增效地分离。
为更进一步说明本发明，以下实施案例主要采用小扁豆凝集素(lca)(购自于美国sigma公司)对本发明进行更进一步说明。
磁性载体主要是指具有磁性分离作用的，表面经高分子材料包埋的复合磁珠，主要包括：葡聚糖磁珠、琼脂糖磁珠、树脂或环氧树脂磁珠、聚苯乙烯磁珠等复合磁珠中的任意一种，或者两种及以上的磁性载体混合物，所述磁性载体粒径分布范围为1μm-200μm，优选为10μm-200μm，更进一步优选为30μm-150μm；在磁性载体的生产中，同一批次生产磁性载体的粒径也不是均一的，因此磁性载体的粒径描述通常既可以采用平均粒径的方式，也可以采用本发明中粒径分布范围的方式，对于采用粒径分布范围的方式的描述可以认为其具体分布符合或基本符合在此分布范围内的正态分布。本发明实施例中凝集素-磁性载体偶联复合物中，所使用的磁性载体的粒径为一般免疫磁珠粒径的10-1000倍，单个磁珠上具有更大表面积，减小了凝集素与磁珠偶联时的空间位阻，利于偶联更多的凝集素，相比之下，同样总体积的一般免疫磁珠虽然具有更大的比表面积，但由于空间位阻较大，偶联上的凝集素反而更少，本发明的凝集素-磁性载体偶联复合物中，每1ml磁性载体上可以偶联1-20mg凝集素，而研究发现使用体积较小的免疫磁珠时，每1ml免疫磁珠偶联凝集素的数量为ng级别，偶联效率低；同时该粒径也远远大于外泌体本身的直径，可以减少凝集素和糖基化外泌体结合的空间位阻，有利于凝集素与糖基化外泌体结合，大幅提高外泌体的分离效率。
上述磁性载体通过表面覆盖的高分子材料与凝集素偶联结合，形成凝集素-磁性载体偶联复合物，不同磁性载体通过调节浸泡、偶联、清洗、保存等步骤后，均能达到与凝集素偶联结合的效果，当然针对不同凝集素的最适高分子材料可能是不同的；在凝集素-磁性载体偶联复合物制备过程中磁性载体(ml)与凝集素(mg)的比例为1:1-1:20，优选为1:5-1:15，进一步优选为1:10-1:15。
制备后的凝集素-磁性载体偶联复合物于保存液中进行保存，凝集素-磁性载体偶联复合物在凝集素-磁性载体偶联复合物保存液中的保存浓度(体积比)为10％-60％，优选比例为30％-50％，进一步优选为40％-50％。
为更进一步说明本发明，以下实施案例均采用粒径分布范围30μm-150μm的琼脂糖磁珠进行说明，上述琼脂糖磁珠为商品化的活化nhs琼脂糖磁珠(购自enrichingbiotechnology)，所购置的商品化琼脂糖磁珠浓度为10％(体积比)。
凝集素-磁性载体偶联复合物，即lca-琼脂糖磁珠偶联复合物的制备过程详情如下：
(1)将商业化的琼脂糖磁珠混匀，取50ml琼脂糖磁珠加入到200ml的容器中，磁性分离去除上清，得到琼脂糖磁珠5ml。
(2)加入100ml无水乙醇，混合均匀磁性分离去除上清，该步骤重复1-3次，以达到清洗琼脂糖磁珠的目的。
(3)取0.1-1mph6-7的mes缓冲液(含0.1-0.5mnacl)50ml，加入小扁豆凝集素和步骤(2)所得琼脂糖磁珠，混匀备用；其中琼脂糖磁珠体积(ml)与小扁豆凝集素(lca，mg)的比例为1:1-1:20(即每1ml琼脂糖磁珠要加入1-20mg小扁豆凝集素)；为更好的说明本发明，本实施案例中mes缓冲液的浓度为0.1m、ph为6.5、含0.1m的nacl，琼脂糖磁珠体积(ml)与小扁豆凝集素(lca，mg)的比例为1:10，即在50ml0.lmmes缓冲液中加入5ml琼脂糖磁珠和50mglca。
(4)将步骤(3)的溶液室温震荡反应0.5-5h，磁性分离去除上清，弃去的上清中基本检测不到凝集素的存在。为更好的说明本发明，本实施案例中室温震荡3h。
(5)加入不含外泌体的牛血清白蛋白缓冲液封闭处理，即加入不含外泌体的200ml0.1-1mph6-7的mes-b缓冲液(含0.1-0.5mnacl、0.1-1％bsa溶液)，室温震荡反应0.5-5h，磁性分离去除上清。为更好的说明本发明，本实施案例中加入200ml0.5mph6.5的mes-b缓冲液(含0.3mnacl、0.5％bsa溶液)，室温震荡反应3h。
(6)加入10-200mm的tris缓冲液，室温震荡混匀，磁性分离去除上清，该步骤重复1-5次。为更好的说明本发明，本实施案例中加入100mm的tris缓冲液。
(7)将步骤(6)中收集的lca-琼脂糖磁珠重新悬浮于tris缓冲液中，配置成10％-60％的lca-琼脂糖磁珠溶液备用，优选配置成30％-50％的lca-琼脂糖磁珠溶液，本实施案例中加入5mltris缓冲液，配置成体积比为50％的lca-琼脂糖磁珠溶液。
实施案例2糖基化外泌体分离组合物制备
本发明提供了一种糖基化外泌体分离组合物，具体包括：凝集素-磁性载体偶联复合物，用于清洗去除分离过程中非特异性结合的、未发生糖基化的外泌体及其他杂质的清洗液，和/或用于洗脱特异性结合在凝集素-磁性载体偶联复合物上的糖基化外泌体的洗脱液，分别独立包装，同时存在于一个套装或试剂盒中。
在本实施案例中，上述凝集素-磁性载体偶联复合物为实施案例1中所得的体积比为50％的lca-琼脂糖磁珠溶液。
上述清洗液为无金属盐离子清洗缓冲液或纯化水，可选为无金属盐离子清洗缓冲液，如：主要成分包括10-200mm无金属盐离子的tris-hcl缓冲液、ph值为7.6±0.2，用于清洗去除分离过程中非特异性结合的未发生糖基化的外泌体及其他杂质。在本实施案例中，清洗液为100mm无金属盐离子的tris-hcl缓冲液、ph值为7.6±0.2。
上述洗脱液为溶有糖的硼酸盐缓冲液，可以是溶有甘露糖的硼酸盐缓冲液，如：主要成分包括10-20mm的硼酸盐缓冲液和溶于其中的100-500mm的甘露糖、ph值6.5±0.2，用于洗脱结合在凝集素-磁性载体偶联复合物上的糖基化外泌体，洗脱后的外泌体外观形态完整，无破损或裂解。在本实施案例中，清洗液为15mm的硼酸盐缓冲液和溶于其中的300mm的甘露糖、ph值6.5±0.2。
实施案例3糖基化外泌体分离组合物的使用方法
本发明还提供了一种糖基化外泌体分离方法，主要包括使用实施案例2中糖基化外泌体分离组合物的主要实验步骤，分离原理示意图详见图1“凝集素-磁性载体偶联复合物分离糖基化外泌体的原理示意图”。
本发明的详细实验步骤包括：
1、实验前准备
自备器材或设备：磁力架，用于手动分离糖基化外泌体；或使用本集团公司及旗下子公司的全自动琼脂糖磁珠分离仪器，主要用于糖基化外泌体全自动分离，达到节约人力的目的。全自动琼脂糖磁珠分离糖基化外泌体只是对手工方式的自动化实现，并能达到等同或优于手工分离的功能，本实施案例采用磁力架手工分离进行进一步说明。
2、试验流程
(1)临床样本前处理：根据不同临床样本的特性调整样本前处理的方法。
对所述血清、血浆、唾液、脑脊液、淋巴液样本而言，将样本经3000g离心10-15min，去除样本中的细胞碎片、沉淀物等杂质，将离心后上清液转移至新的磁分离容器如：离心管备用；
对所述组织或细胞培养上清液、尿液的样本而言，将样本经3000g离心10-15min，去除样本中的细胞碎片、沉淀物等杂质，然后将上清液通过超滤管进行10-1000倍浓缩，将浓缩后的上清液转移至新的磁分离容器如：离心管备用。
(2)取步骤(1)中经过前处理的样本50-500ul，可选50-300ul，进一步可选为100-200ul，更进一步可选为100ul，与100ul凝集素-磁性载体偶联复合物充分混匀并孵育，其中上述经过前处理的样本以及凝集素-磁性载体偶联复合物保存液的体积是为了体现混合时二者的比例，并不代表二者的固定体积，本领域技术人员当然可以按比例扩大或缩小具体混匀时的体积，当然，加入磁分离容器的具体体积要和磁分离容器本身的体积相适应；凝集素-磁性载体偶联复合物保存液中凝集素-磁性载体偶联复合物的保存浓度(体积比)为10％-60％，优选比例为30％-50％，进一步优选为40％-50％；孵育的条件为室温孵育1-30min，优选为5-20min，进一步优选为10-15min；选用不同的比例及室温孵育时间，分离效果略有差异，基本均能达到相同的分离效果。为更进一步说明本发明，本实施案例采用的主要步骤为：将200ullca-琼脂糖磁珠保存液(包括100ullca-琼脂糖磁珠)置于1.5ml离心管中，吸取100ul经过前处理的样本加入到上述离心管中，充分混匀，室温均匀摇动孵育10-15min。
(3)使用磁力架分离结合有外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物，用体积为凝集素-磁性载体偶联复合物1-3倍的ph值7.6±0.2的无金属盐离子清洗缓冲液清洗1-3次，用于清洗去除分离过程中非特异性结合的未发生糖基化的外泌体及其他杂质。在本实施案例中，详细步骤为：将步骤(2)的离心管放置到磁力架上，静置1min后吸弃上清，此时糖基化外泌体吸附在lca-琼脂糖磁珠复合物上，针对100ullca-琼脂糖磁珠加入200ulph值7.6±0.2的无金属盐离子清洗缓冲液，其主要成分包括100mm无金属盐离子的tris-hcl缓冲液，充分抽吸混匀后，放置磁力架上静置1min后吸弃上清，反复洗涤3次；
(4)用ph值6.5±0.2的硼酸盐-甘露糖缓冲液为洗脱液洗脱清洗后的凝集素-磁性载体偶联复合物，其主要成分包括10-20mm的硼酸盐缓冲液和溶于其中的100-500mm的甘露糖，针对100ullca-琼脂糖磁珠的洗脱液体积为50-200ul，优选为50-100ul；洗脱上清液即为分离后的糖基化外泌体溶液，洗脱后的外泌体外观形态完整，无破损或裂解。在本实施案例中，详细步骤为：在步骤(3)中加入100ul糖基化外泌体洗脱液，洗脱液包括15mm的硼酸盐缓冲液和溶于其中的300mm的甘露糖，吹吸混匀后，放在磁力加上静置不低于1min，吸取上清液放置于新离心管中，直接用于检测或于-80±5℃保存备用，吸上清时注意不要吸到磁珠及杂质；洗脱分离后糖基化外泌体形态完整，可直接用于糖基化外泌体液体检测，外泌体免疫学检测，或核酸提取后基因检测分析等。
实施案例4
本实施案例主要对糖基化外泌体的分离样本作进一步说明，可用于本发明的待分离样本主要为：血清、血浆、唾液、组织或细胞培养上清液、尿液、脑脊液、淋巴液的任意一种；针对常规1.5ml离心管，加入所述血清、血浆、唾液、脑脊液、淋巴液、组织或细胞培养上清液、尿液的经过前处理的样本体积50-500ul，优选为50-300ul，进一步优选为100-200ul；在样本前处理过程中，血清、血浆、唾液、脑脊液、淋巴液样本只经过离心，因此对50-500ul，可选为50-300ul，进一步可选为100-200ul的样本进行前处理即可获得所需体积的经过前处理的样本；而所述组织或细胞培养上清液、尿液的样本在样本前处理过程中，除了离心步骤之外，还需要进行10-1000倍浓缩，所以为了获得足够的经过前处理的样本，需要对1-50ml，可选为10-50ml，进一步可选为30-50ml的所述组织或细胞培养上清液、尿液的样本进行前处理才能获得所需体积的经过前处理的样本。
不同的样本分离体积对分离效果略有影响，但基本均能达到糖基化外泌体的分离效果，为更进一步说明本发明，在本实施案例中，依据实施案例3的分离步骤，均选择100ul经过前处理的血清、血浆、唾液、脑脊液、淋巴液样本进行说明；组织或细胞培养上清液、尿液的样本分离体积均选择为50ml，浓缩后体积优选为100ul进行说明。
依据细胞培养上清液、血清、血浆、脑脊液、尿液、积液、乳汁、唾液、淋巴液等待分离样本的样本特异性，分别选取细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液等4种样本类型做进一步说明，将其他样本类型替换后，也能达到相同的分离效果。依据实施案例3的步骤，分别分离100ul的不同来源的经过前处理的细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液的糖基化外泌体，分别得到4种不同样本来源的糖基化外泌体分离溶液备用。
实施案例5
本实施案例主要对实施案例4中分离得到的糖基化外泌体进行透射电镜检测，用于观察糖基化外泌体的形态及粒径大小，主要步骤为：
吸取约5ul实施案例4中分离得到的糖基化外泌体样本，滴在铜网上，静置4-5min，用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液(0.5％的醋酸铀水溶液，ph4.5)，在铜网上反应1min，用滤纸吸干，重复清洗2次，晾干后，进行tecnaispirit(120kvtem)透射电镜观测。透射电镜观察实施案例4中的四种不同样本分离的糖基化外泌体，外泌体形态完整、无破损，粒径均在30-150nm之间，详见图2中4种不同样本类型分离糖基化外泌体电镜观察图片。
实施案例6：
本实施案例主要对实施案例4中分离得到的糖基化外泌体使用nanosightns300系统对外泌体粒度和粒径进行纳米颗粒跟踪分析(nta)，nta分析主要是在溶液状态(原位测试)下的测试，其高精度的粒度数量分布测试，可以分辨出相对粒径差异在1：1.5倍左右的颗粒，能够让外泌体颗粒在更接近其原始状态下进行测量，保证了测量数据的真实性和有效性，提供可靠的外泌体浓度数据，有效弥补目前电镜直接观察和测量外泌体时，由于一次所能观察到的范围有限，所获得的粒径分布数据往往不具代表性的缺陷，并能有效降低电镜观察的干燥、固定以及冷冻等不同方式的前处理带来的外泌体损伤。
基于实施案例5中糖基化外泌体电镜观察4种不同样本类型结果的一致性，在本实施案例中选取血浆样本分离的糖基化外泌体进行nta检测，详细步骤为：将约10ul样本稀释到1ml，采用nanosight注射泵上样，nanosightns300系统自动分析，糖基化外泌体较为均一，平均粒径均在30-150nm之间，粒度均在1011-1014个/ml；详见图3：血浆样本分离后糖基化外泌体的nta分析图。
实施案例7
本实施案例主要对实施案例4分离得到的糖基化外泌体进行外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81抗体、外泌体特异性非膜蛋白alix和tsg101抗体、外泌体calnexin抗体进行westernblot检测和鉴定，主要检测步骤如下：
(1)样本准备：取30ul外泌体清洗液，加入等体积5×sds-page上样缓冲液，100℃处理10分钟，备用；
(2)sds电泳：配置凝胶(15％分离胶、5％浓缩胶)，加入1×电泳缓冲液，加样本10μl/孔，设置60v，120min的电泳条件；
(3)转膜：将合适大小pvdf膜，放置到转移缓冲液，浸泡10min，将凝胶与pvdf膜以及海绵垫紧密贴合，防止出现气泡，用半干转膜仪将蛋白转至pvdf膜上(恒压40v，恒流200ma，转膜20分钟)
(4)封闭：5％脱脂奶粉封闭液封闭1小时，tbst清洗3次，每次5分钟；
(5)孵育：分别加入一抗(anti-cd9、anti-cd81、anti-cd63、anti-tsg101、anti-alix、anti-calnexin单抗，浓度1mg/ml，1:400稀释)孵育1小时，tbst清洗3次，每次5分钟；加入二抗(羊抗鼠hrp1mg/ml，1:5000稀释)孵育1小时，tbst清洗3次，每次5分钟；
(6)显示：使用beyoeclmoon(极超敏ecl化学发光试剂盒)显色后进行检测。
实施案例4分离得到的4种糖基化外泌体的westernblot检测结果分别为：
(1)外泌体特异性膜蛋白cd9、cd63、cd81抗体westernblot检测均为阳性，说明检测到外泌体特异性膜蛋白，洗脱液中含有外泌体；详见图4：外泌体特异性膜蛋白cd9、cd63、cd81抗体westernblot检测结果图；
(2)外泌体特异性非膜蛋白alix和tsg101抗体的westernblot检测均为阳性，说明检测到外泌体特异性非膜蛋白，洗脱液中含有外泌体；详见图5：外泌体特异性非膜蛋白alix和tsg101抗体的westernblot检测结果图；
(3)外泌体样本中calnexin抗体的westernblot检测均为阴性，说明本方法分离的外泌体纯度较高。calnexin蛋白存在于细胞内质网上，是内质网标记蛋白，不存在于外泌体中，是外泌体分离中有效区分是否存在细胞碎片和/或细胞的特异性蛋白。详见图6：外泌体样本中calnexin抗体的westernblot检测结果图。本实施例分离样本得到糖基化外泌体的calnexin抗体的westernblot检测均为阴性，说明分离后的糖基化外泌体样本中没有细胞碎片存在。
实施案例8
本实施案例主要是针对不同清洗液，尤其是包含金属盐离子的常见清洗液、和不包含金属盐离子的常见清洗液、和纯化水的对糖基化外泌体分离过程中的清洗效果及分离效果做进一步对比验证，以确定本发明中所选择清洗液的适宜性。
将实施案例2和3中的糖基化外泌体分离组合物中的无金属盐离子缓冲液清洗(tris-hcl)替换为纯化水、以及常见的含金属盐离子的清洗液。常见的含金属盐离子的清洗液包括：磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液)、tris-triton-nacl缓冲液、tbst缓冲液，由于常见含金属盐离子的清洗液大都含有表面活性剂，如tween-20、tritonx-100等，表面活性剂会对外泌体囊泡的外膜造成破坏，因此，本实施案例在配置常见的含金属盐离子的清洗液时均不含表面活性剂成分。
在本实施案例中常见的含金属盐离子的清洗液为：磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液)、无tritonx-100的tris-triton-nacl缓冲液、无tween-20的tbst缓冲液。
上述pbs缓冲液的组成成分为：磷酸二氢钾(kh2po4)：0.24g/l，磷酸氢二钠(na2hpo4)：1.44g/l，氯化钠(nacl)：8g/l，氯化钾(kcl)：0.2g/l，ph值为7.4±0.2。
上述无tritonx-100的tris-triton-nacl缓冲液组成成分为：50mmtris-hcl、0.6mnacl，ph值为7.6±0.2。
上述无tween-20的tbst缓冲液组成成分为：10mmtris-hcl、0.15mnacl、ph值为7.6±0.2。
本实施案例中的5种清洗缓冲液分别为tris-hcl缓冲液、纯化水、pbs缓冲液、无tritonx-100的tris-triton-nacl缓冲液、无tween-20的tbst缓冲液，按照上述顺序依次标记为1号清洗液、2号清洗液、3号清洗液、4号清洗液、5号清洗液。应用本实施案例中的5种清洗缓冲液分别分离血浆样本中的糖基化外泌体，进行对比验证分析，除清洗液不同，其他组成及步骤均相同，详细过程参考实施案例1-4、以及实施案例7中的外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81抗体的westernblot检测和鉴定步骤。
本实施案例中5种不同清洗缓冲液清洗结合有糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物后，再洗脱分离得到的糖基化外泌体溶液的外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81抗体的westernblot检测结果详见图7。
本实施案例结果显示，不含金属盐离子缓冲液(1号清洗液和2号清洗液)对结合有糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物进行清洗后，再对其进行洗脱所得洗脱液的westernblot检测结果显示：外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81显示均为阳性，提示均能有效分离得到糖基化外泌体；而无表面活性剂的常见含有金属盐离子的常见清洗缓冲液(3号、4号、5号清洗液)对结合有糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物进行清洗后，再对其进行洗脱所得洗脱液的westernblot检测结果显示：外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81显示均为阴性，说明溶液中金属盐离子的存在影响糖基化外泌体的分离效果，其对本发明中的糖基化外泌体具有明显的解离作用。
实施案例9
本实施案例主要针对不同的常见蛋白质洗脱液和本发明的硼酸盐-甘露糖缓冲液对糖基化外泌体的分离效果做进一步对比验证，以确定本发明中所选择洗脱液的适宜性。
将实施案例2和3中的糖基化外泌体分离组合物中的硼酸盐-甘露糖缓冲液替换为常用的蛋白质洗脱液和糖蛋白洗脱液，具体为蛋白质抗体洗脱缓冲液strippingbuffer和糖蛋白洗脱液glycoproteinelutingsolution(美国vectorlabs公司)。
上述strippingbuffer组成成分为：62.5mmol/ltris·hcl、2％sds、100mmol/lβ-2-巯基乙醇，ph6.8±0.2。
应用本实施案例中的3种洗脱液分别分离血浆样本中的糖基化外泌体，进行对比验证分析，除洗脱液不同，其他组成及步骤均相同，详细过程参考实施案例1-5，观察3种洗脱液分别分离血浆样本中的糖基化外泌体在电镜下的外泌体形态及完整性。
本实施案例中3种不同洗脱液分离得到的糖基化外泌体溶液的外泌体电镜检测结果详见图8。
本实施案例结果显示，本发明的洗脱液能有效分离样本中的糖基化外泌体，且外泌体形态完整、无破损，粒径均在30-150nm之间；strippingbuffer作为洗脱液未观察到外泌体，可能为strippingbuffer作为洗脱液在洗脱的过程中对外泌体的外膜造成破坏，无法得到完整的外泌体；而糖蛋白洗脱液glycoproteinelutingsolution观察不到典型的外泌体囊泡，仅能观察到疑似外泌体囊泡，但外泌体形态不完整，说明在分离过程中对外泌体造成一定的破坏，不利于后续的检测分析。
综上所述，应用本发明的内容对不同样本来源的糖基化外泌体的分离，均能达到同样的效果，且分离得到的外泌体均为糖基化外泌体，分离纯化后外泌体形态完整，无破损，可直接用于糖基化外泌体液体检测，外泌体免疫学检测，或核酸提取后基因检测分析等；还可以进一步通过后续纯化步骤获得纯度更高的外泌体溶液。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施案例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施案例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
1.一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物，其特征在于：包括：磁性载体；和偶联在磁性载体外侧的凝集素；其中：
所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(vva和/或vvl)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素、蜗牛凝集素(haa和/或hpa)中的任意一种或者两种及以上；
所述磁性载体包括：葡聚糖磁珠、琼脂糖磁珠、树脂或环氧树脂磁珠、聚苯乙烯磁珠中的任意一种或者两种及以上。
2.根据权利要求1所述凝集素-磁性载体偶联复合物，其特征在于，所述磁性载体粒径分布范围为1μm-200μm，优选为10μm-200μm，更进一步优选为30μm-150μm。
3.根据权利要求1所述凝集素-磁性载体偶联复合物，其特征在于，所述凝集素-磁性载体偶联复合物中，每1ml磁性载体上偶联有1-20mg，优选为5-15mg，进一步优选为10-15mg凝集素。
4.根据权利要求1所述凝集素-磁性载体偶联复合物，其特征在于，所述临床样本包括：血清、血浆、唾液、组织或细胞培养上清液、尿液、脑脊液、淋巴液中的任意一种。
5.根据权利要求1所述凝集素-磁性载体偶联复合物，其特征在于，所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(vva和/或vvl)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素中的任意一种或者两种及以上。
6.根据权利要求1所述凝集素-磁性载体偶联复合物，其特征在于，所述糖基化外泌体包括：n-糖基化外泌体、o-糖基化外泌体、岩藻糖基化外泌体中的任意一种或两种及以上。
7.一种糖基化外泌体分离组合物，其特征在于，所述糖基化外泌体分离组合物包括：权利要求1-6之一所述的凝集素-磁性载体偶联复合物，还包括：用于清洗去除分离过程中非特异性结合的、未发生糖基化的外泌体及其他杂质的清洗液，和/或用于洗脱特异性结合在凝集素-磁性载体偶联复合物上的糖基化外泌体的洗脱液。
8.根据权利要求7所述的糖基化外泌体分离组合物，其特征在于，所述清洗液为无金属盐离子的清洗缓冲液或纯化水，可选地为无金属盐离子的清洗缓冲液；
和/或，所述洗脱液为溶有糖的硼酸盐缓冲液，可选地为溶有甘露糖的硼酸盐缓冲液。
9.一种糖基化外泌体分离方法，其特征在于，所述分离方法包括应用权利要求1-6所述凝集素-磁性载体偶联复合物分离糖基化外泌体的分离步骤，所述分离步骤包括：
临床样本进行前处理；
取前处理后的样本与凝集素-磁性载体偶联复合物充分混匀孵育；
采用磁分离的手段分离结合有糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物，并用清洗液清洗结合有糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物；
用洗脱液洗脱清洗后的凝集素-磁性载体偶联复合物。
10.根据权利要求9所述的糖基化外泌体分离方法，其特征在于，前处理后的样本与凝集素-磁性载体偶联复合物混合的体积比为0.5-5：1，优选为0.5-3：1，进一步优选为1-2：1；
和/或，清洗液清洗结合有糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物时，采用体积为凝集素-磁性载体偶联复合物1-3倍的清洗液清洗1-3次；
和/或，洗脱液与凝集素-磁性载体偶联复合物的体积比为0.5-2：1，优选为0.5-1：1。
11.根据权利要求9所述的糖基化外泌体分离方法，其特征在于，临床样本前处理的方法包括以下步骤：
对血清、血浆、唾液、脑脊液或淋巴液样本，将样本经3000g以下速度离心10-15min以去除样本中的细胞碎片、沉淀物杂质，取离心后上清液备用；
对组织或细胞培养上清液、尿液的样本，将样本经3000g以下速度离心10-15min以去除样本中的细胞碎片、沉淀物杂质，然后将上清液通过超滤管进行10-1000倍浓缩后备用。
12.根据权利要求9所述的糖基化外泌体分离方法，其特征在于，所述清洗液为无金属盐离子的清洗缓冲液或纯化水，可选地为无金属盐离子的清洗缓冲液；
和/或，所述洗脱液为溶有糖的硼酸盐缓冲液，可选地为溶有甘露糖的硼酸盐缓冲液；
和/或，孵育的条件为：室温孵育1-30min，优选为5-20min，进一步优选为10-15min。
13.一种使用权利要求9-12之一所述的糖基化外泌体分离方法分离的外泌体的应用，其特征在于，所述应用包括：糖基化外泌体液体检测、外泌体免疫学检测，或外泌体中核酸提取后的核苷酸片段检测分析。
技术总结