本发明属于医药领域，涉及防治老年痴呆的药物，具体涉及小分子多肽在制备防治老年痴呆药物中应用。
背景技术：
阿尔茨海默病(ad)是老年人中最普遍的神经退行性疾病之一，约占全世界痴呆病例的2/3。临床上，ad的特征在于一系列认知障碍，包括通常在早期发生的突出的情景记忆损伤。病理学上，ad脑中有两个标志物，即由过量产生的β-淀粉样蛋白(aβ)构成的老年斑和由异常过度磷酸化的tau蛋白组成的神经原纤维缠结(nft)。在过去的一个世纪中，人们致力于探索记忆缺陷的潜在机制，并且越来越多的证据表明大脑中过载的aβ可能是ad记忆障碍的主要原因。虽然众多研究发现了aβ介导突触毒性的潜在下游信号，但是aβ诱发情景性记忆障碍的详细机制尚不清楚。
情景记忆的一个关键特征是能够区分相似的经历，这种经历被定义为强烈依赖于海马网络的情境辨别，并且被认为是通过模式分离来促进的。模式分离是一种神经计算，其中两个相似的输入模式被制作的更为正交(不相似)作为输出模式。如前所述，模式分离是信息处理中必不可少的步骤，以避免存储信息之间的干扰。据报道，早期阿尔茨海默病患者模式分离损伤。同时，在12个月大的tg2576小鼠(一种众所周知的ad小鼠模型)中发现其海马的齿状回(dentategyrus,dg)-ca3网络的破坏，这对于消除信息的重叠模式至关重要。
.老年痴呆的一个主要原因是胆碱不足导致的记忆衰退。常用的减缓老年痴呆发作药物有：(1)酰胺类中枢兴奋药：增加大脑蛋白质和乙酰胆碱的合成，如吡拉西坦。(2)乙酰胆碱酯酶抑制剂：抑制胆碱酯酶活性，提高脑内乙酰胆碱的含量，如多奈哌齐。(3)钙拮抗剂：选择性扩张脑血管，改善记忆和认知功能。(4)其它类药物：如胞磷胆碱改善脑组织代谢，银杏叶提取物清楚氧自由基生成，改善脑功能。然而，目前尚没有特效治疗药物和方法，上述药物仅能轻度缓解中晚期老年性痴呆患者的症状或延缓其病程进展。因此研发新的针对老年性痴呆病理学特征的药物尤为重要。
tat细胞穿膜多肽(cellpenetratingpeptides)，是近年来发现的一种高效运输载体。tat能够穿透细胞膜、细胞核膜，携带多肽、蛋白质以及dna分子等通过受体转运方式进入胞质和胞核发挥相应的生物效应。目前研究显示hiv-tat，能够穿过所有组织细胞，且无明显的毒副作用。tat将与之相连的多肽在数分钟内带入细胞，并且跨越血脑屏障进入神经元内，被带入细胞的多肽则保留了它们原有的生物活性，从而发挥生物学作用。
技术实现要素：
本发明的任务是提供一种透脑性小分子多肽，使其具有治疗和预防老年痴呆的作用。
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的这种透脑性小分子多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。
seqidno.1：mygrkkrrqrrrahqdtqrrtsmggtqqqfve。
本发明将tat穿膜肽(ygrkkrrqrr)与sip-dc(rahqdtqrrtsmggtqqqfve)连接，得到具有生物活性的tat-sip-dc多肽(seqidno.1:mygrkkrrqrrrahqdtqrrtsmggtqqqfve)，利用tat的穿膜功能将sip-dc多肽输送进入血液穿过血脑屏障，并被大脑神经细胞摄取从而发挥其生物学功能。
本发明提供的这种透脑性小分子多肽tat-sip-dc(seqidno:1:mygrkkrrqrrrahqdtqrrtsmggtqqqfve)具有治疗或预防老年痴呆的作用，将其静脉注射，发现其可有效改善老年痴呆模型动物表现出的模式分离障碍，为进一步开发临床治疗老年痴呆的药物提供了分子靶点。
基于申请人最近的研究与tat技术，申请人合成了一个由与β-连环蛋白(β-catenin)竞争性结合到死亡相关蛋白激酶1(death-associatedproteinkinase1,dapk1)的氨基酸序列组成的膜渗透性小分子多肽tat-sip-dc，通过运用到在体的老年痴呆转基因动物模型上，有效发挥其阻断β-catenin与dapk1结合的生物学作用，从而减弱β-catenin的磷酸化以及在突触前聚集，恢复突触前功能，从而改善老年痴呆模型动物表现出的模式分离(patternseparation)障碍，为进一步开发临床治疗老年痴呆的药物提供了分子靶点。
本专利申请发明人在研究中发现，老年痴呆模型动物中β-catenin和dapk1相互结合，介导β-catenin的磷酸化和聚集，从而损伤海马的苔藓纤维(mossyfiber,mf)-ca3的突触前功能，引起模式分离障碍。阻断β-catenin和dapk1的结合，能有效改善上述症状。针对这一发现，申请人将tat穿膜肽(ygrkkrrqrr)与sip-dc(rahqdtqrrtsmggtqqqfve)连接，得到具有生物活性的tat-sip-dc多肽，通过在体静脉注射方式，使tat-sip-dc多肽进入血液穿过血脑屏障并被大脑神经细胞摄取发挥其生物学功能。
本发明涉及的氨基酸序列包括：
(1)一种透脑性小分子多肽tat-sip-dc，其序列如下：
mygrkkrrqrrrahqdtqrrtsmggtqqqfve。
(2)tat-sip-dc的对照为tat-scramble，其序列为：
mygrkkrrqrrathrqrqsfqgetqdqmvgtr。
tat-sip-dc多肽和对照tat-scramble由强耀生物科技有限公司从序列c端到n端合成纯化得到。
本发明进行的实验研究包括：
(1)tat-sip-dc在老年痴呆动物模型的应用研究
app/ps1转基因鼠是公认的老年痴呆动物模型。模式分离实验、长时程增强、苔藓纤维结(mossyfiberbouton,mfb)染色检测转基因小鼠早期复杂海马相关的记忆能力。对5月龄app/ps1转基因小鼠静脉单次注射10μg/mg的tat-sip-dc溶液，每三天注射一次，连续注射1个月后，动物进行模式分离实验，电生理实验，或者进行处死，取脑组织。结果显示其可有效改善老年痴呆模型动物app/ps1小鼠表现出的模式分离障碍，长时程增强(longtimepotentiation,ltp)抑制，mfb损伤和β-catenin的积累/磷酸化。进一步证明，tat-sip-dc对老年痴呆模型具有确切的治疗作用。
(2)tat-sip-dc在老年痴呆细胞模型的应用研究
在n2a细胞和小鼠原代海马神经元上，给予aβ寡聚体(5μm，24h)处理作为老年痴呆细胞模型。免疫印迹检测β-catenin积累/磷酸化的变化，全细胞膜片钳检测突触前功能。
实验资料：
本发明通过给5月龄app/ps1小鼠注射tat-sip-dc多肽，以及离体老年痴呆细胞模型给予sip-dc处理，发现其可以改善老年痴呆模型动物中β-catenin的磷酸化和聚集，mf-ca3的突触前功能，以及模式分离障碍。
具体操作步骤如下：
1.实验对象
雄性app/ps1小鼠(购买自jax实验室)，spf级，体重25～32克，20只，常规环境饲养。实验分组：①正常组(野生型对照小鼠)；②模型组(app/ps1小鼠注射tat-scramble)；③治疗组(app/ps1小鼠注射tat-sip-dc)；④对照组(野生型小鼠注射tat-sip-dc)；每组10只。
n2a细胞和小鼠原代海马神经元，通过给予aβ寡聚体处理作为老年痴呆细胞模型，在此模型上给予sip-dc处理作为治疗组。
2.实验动物模型制备
①正常组：5月龄野生型对照小鼠，不处理。
②模型组：5月龄app/ps1小鼠，通过尾静脉单次注射给予tat-scramble多肽，剂量为10μg/mg。
③治疗组：5月龄app/ps1小鼠，通过尾静脉单次注射给予tat-sip-dc多肽，剂量为10μg/mg。
④对照组：5月龄野生型对照小鼠，通过尾静脉单次注射给予tat-sip-dc多肽，剂量为10μg/mg。
3.研究方法
①多肽干扰结合：在有多肽和无多肽两种情况下，通过免疫共沉淀检测dapk1和β-catenin的结合情况；
②小鼠早期复杂海马相关记忆：模式分离的训练及检测；
③小鼠电生理：长时程增强电生理记录；
④mfb形态：免疫荧光统计；
⑤β-catenin的稳定性：免疫印迹检测其聚集和磷酸化；
⑥突触前功能：全细胞膜片钳检测微型兴奋性突触后电流(mepsc)；
⑦dapk1活性：免疫印迹检测其本身和其底物的表达。
4.实验结果
一种小分子多肽sip-dc的人工合成色谱图。见图1。
(1)免疫共沉淀验证多肽有效性结果：见图2。用dapk1抗体进行免疫共沉淀，没有加入多肽时，与dapk1结合的β-catenin未发生改变；加入多肽后，与dapk1结合的β-catenin明显减少。用β-catenin抗体进行免疫共沉淀，进一步证明tat-sip-dc可以干扰dapk1和；β-catenin的结合。同时，也证实我们合成的多肽是有效的。
(2)模式分离的训练及检测结果：见图3。在训练阶段和初始测试阶段，各组小鼠的僵直表现并无差异。在鉴别阶段，与正常组相比较，模型组的鉴别率显著下降；与模型组相比较，给予sip-dc的治疗组其鉴别率明显得到了恢复。
(3)电生理记录结果：见图4。med64记录系统测量mf-ca3途径中的ltp，与正常组相比较，模型组的ltp受到抑制；与模型组相比较，给予sip-dc的治疗组其ltp抑制得到了显著改善。
(4)海马mfb形态的统计结果：见图5。与正常组比较，模型组的mfb密度显着降低，主要bouton区域减小，突触前丝状伪足数量减少；与模型组相比较，给予sip-dc的治疗组其mfb的密度，大小和复杂性的损伤得到改善。
(5)在体β-catenin稳定性的免疫印迹结果：见图6。与正常组比较，模型组的β-catenin积累/磷酸化明显增加；与模型组相比较，给予sip-dc的治疗组β-catenin积累/磷酸化显著降低。
(6)离体β-catenin稳定性的免疫印迹结果：见图7。与control组相比较，aβ处理组β-catenin积累/ps552位点的磷酸化明显增加，给予sip-dc后得到改善。
(7)全细胞膜片钳检测结果：见图8。与control组相比较，aβ处理组mepsc频率明显下降，给予sip-dc后这种突触前损伤得到恢复。
(8)dapk1活性的免疫印迹结果：见图9。与模型组相比较，给予sip-dc的治疗组中dapk1本身及其底物p-mlc未发生改变，说明sip-dc处理并未改变dapk1活性。
5.结论及用法建议：
以上结果显示，aβ可能通过促进β-catenin积累/磷酸化而损害mf-ca3突触前功能，sip-dc处理可以通过干扰dapk1和β-catenin的结合，改善ad小鼠中的模式分离缺陷，ltp抑制，mfb损伤，以及β-catenin的积累/磷酸化。
我们的研究表明，多肽sip-dc通过长期阻断dapk1与β-catenin相互作用，降低了β-catenin的磷酸化和积累，挽救了mf-ca3环路的功能，并改善了ad小鼠模式分离的能力。我们的研究首次为ad早期特征性认知缺陷提供了一种新的表观遗传机制。本发明的突出优点还包括：
(1)本发明提供的透脑性小分子多肽tat-sip-dc容易诱导表达纯度，完全可溶，适合静脉注射，无毒副作用。
(2)本发明公开的tat-sip-dc多肽，tat可以携带sip-dc蛋白多肽经血液穿过血脑屏障被神经元摄取，可以转化应用于神经系统疾病如老年痴呆，使其具有实际操作的可行性。
附图说明
图1为一种小分子多肽tat-sip-dc的人工合成色谱图。
图2为多肽tat-sip-dc干扰dapk1和β-catenin结合的免疫共沉淀结果图。
图3为tat-sip-dc改善app/ps1小鼠模式分离的结果统计图。图3(a)为第1-3天训练阶段僵直百分比的统计图，图3(b)为第4-5天初始测试阶段僵直百分比的统计图，图3(c)为第6-17天鉴别阶段鉴别率的统计图。
图4为tat-sip-dc改善app/ps1小鼠长时程增强的结果图。
图5为tat-sip-dc改善app/ps1小鼠mfb损伤的结果统计图。图a为mfb密度的统计图，图b为mfb中心bouton区域大小的统计图，图c为突触前伪足数量的统计图。
图6为tat-sip-dc改善app/ps1小鼠β-catenin聚集和磷酸化的免疫印迹结果图。图a为蛋白免疫印迹结果图，图b为结果统计图。
图7为多肽tat-sip-dc改善aβ所诱导的β-catenin聚集和磷酸化的免疫印迹结果图。图a为蛋白免疫印迹结果图，图b为结果统计图。
图8为tat-sip-dc改善aβ所诱导的mepsc频率下降的结果图。
图9为tat-sip-dc不影响dapk1活性的免疫印迹结果图。图a为蛋白免疫印迹结果图，图b为结果统计图。
各附图中，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001与正常组比较；##p<0.01，###p<0.001与模型组比较；ns表示无显著性差异。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
tat-sip-dc的人工合成
tat-sip-dc的序列如seqidno.1所示，由上海强耀生物科技有限公司人工合成，合成报告如下所示，色谱如图1所示。
tat-sip-dc人工合成hplc报告
合成的tat-sip-dc多肽的纯度为97.14％，每支1mg，为白色粉末状，完全可溶于水，密封避光保存于-20℃。使用前，用注射用生理盐水按指定浓度进行稀释配置，现配现用。
实施例2
多肽tat-sip-dc干扰dapk1和β-catenin结合。见图2。
多肽由上海强耀公司合成。用dapk1抗体进行免疫共沉淀，结果显示，没有给予多肽时，dapk1和β-catenin的结合未发生改变；多肽存在的情况下，干扰了dapk1和β-catenin的结合。用β-catenin抗体进行免疫共沉淀，进一步证实了tat-sip-dc可以干扰dapk1和β-catenin的结合。同时，也证明了我们合成的多肽是有效的。
实施例3
tat-sip-dc在老年痴呆动物模型的应用
(1)tat-sip-dc改善app/ps1小鼠的模式分离障碍。见图3。
模式分离是一种更复杂的海马相关记忆，在早期ad患者中通过既定模式受损。情景恐惧室包括一个震动发生器(anilab，它可以提供0.1到1.0ma的电击)并且与计算机相联。隔音箱配有灯和小风扇(用于通风和背景声音)。此外，还有电压表和声强计来检测刺激的强度。我们所用a室和b室的区别在于，a室底部放有苯甲醛的100％酒精溶液(0.25％浓度)，b室侧壁向内成60°夹角，且a室用无味的5％氢氧化钠溶液擦拭，b室用刺鼻的1％乙酸溶液擦拭。第1-3天为训练阶段，各组小鼠均在a室接受相同的条件训练，即192s之后，接受一次足底电击(2s；0.65ma)，并在足底电击终止后1分钟从室中取出；第4天和第5天为初始测试阶段，每只小鼠分别置于a室和b室进行测试(8min；无电击)，每8s记录一次；第6天至第17天(其在上述第二次测试后的第二天开始)为鉴别阶段，每天将小鼠置于a室和b室，顺序遵循baababbabaab设计，使得在第7天，第8天，第10天，第13天，第15天和第16天，所有动物首先置于a室，然后置于b室。其余的天数中，两室顺序颠倒。整个阶段，所有动物只在a室接受单次足底电击，b室没有。每天对每室中首次的192s，每8s记录一次。记录依赖于僵直行为，即除呼吸以外的不动性，将记录得分转换为僵直率，鉴别阶段的鉴别率为：a室/(a室 b室)。
我们发现所有小鼠完成了训练阶段从第1天到第3天所需的任务，并且完成了从第4天到第5天的初始测试阶段。在从第6天到第17天任务的鉴别阶段，对照小鼠很快学会区分场景；然而，ad小鼠在获得鉴别任务期间表现出短暂但非常显着的缺陷。ad小鼠的这种缺陷表现为在无电击室b中僵直反应增加。相反，ad小鼠对存在电击的场景都没有表现出僵直缺陷(室a)。到第17天(鉴别任务的第12天)，ad小鼠还不能区分两个场景。证明其在鉴别任务中显示出明显的损伤。我们还发现sip-dc处理显着提高了ad小鼠的鉴别率，但在野生型小鼠中没有。
(2)tat-sip-dc改善app/ps1小鼠ltp的抑制。见图4。
海马苔藓纤维(mf)突触在dg-ca3网络中的门控信息传递中发挥关键作用，并且是模式分离和空间记忆建立的核心。我们首先使用med64记录系统测量mf-ca3途径中的长时程增强(ltp)，在功能上评估mf-ca3投射的改变。
将小鼠断头处死，并将脑组织立即浸入冰冷的人造脑脊髓液(125mmnacl,2.0mmkcl，2.5mmcacl2,1.2mmmgso4,1.2mmkh2po4,26mmnahco3和11mm葡萄糖)中，持续通入95％o2和5％co2，用振动切片机(leica)切300μm的旁矢状切片。将切片在含氧人造脑脊髓液中于32℃预孵育1.5小时，然后转移到用人造脑脊液不断灌注的记录槽中。平面多电极记录设置(med64；alphamedsciences,tokyo,japan)用于记录场兴奋性突触后电位(fepsp)。将刺激电极和记录电极分别放在海马dg和ca3区域。刺激dg区诱发场电位。选择合适的刺激和记录电极位置。通过提供10-至100-μa的电刺激产生输入-输出关系(i/o曲线)，并测量峰值fepsp的幅度。选择诱发fepsp幅度最大值的40％当作刺激强度。在30分钟稳定基线后，使用一串高频刺激(100hz,1s)诱导ltp，记录120分钟。使用记录的最后5分钟的数据进行统计分析。
ad小鼠表现出mf-ca3投射中ltp的抑制，这曾在6个月ad小鼠中报道过。这里我们使用6月龄app/ps1小鼠，我们发现其mf-ca3通路的长时程增强受到抑制，当给以多肽tat-sip-dc之后，这种抑制作用得以改善。
(3)tat-sip-dc改善app/ps1小鼠mfb的损伤。见图5。
在形态学上，已知齿状回(dg)中的颗粒细胞向具有多种末端类型的ca3锥体神经元投射：大的苔藓纤维结(mfb)和从这些结发出的小的丝状伪足延伸.。我们分析了不同处理方式下mfbs和丝状伪足的形成，以评估mf-ca3投射在形态上的改变。
将小鼠麻醉后灌流取脑，经后固定脱水后，冰冻切片机(leica1950,wetzlar,germany)切片，脑片保存于pbs中备用。将脑片于室温下用bsa封闭30min以阻断非特异性位点，随后用一抗4℃孵育过夜，次日pbs清洗30min，换二抗室温孵育1h，最后用激光共聚焦显微镜(lsm780；carlzeiss)对海马区域进行扫面成像，对成像结果进行统计分析。
正如所料，野生型小鼠中形成了mfbs的特征形状，即由大的主要的结和几个突触前丝状伪足组成。ad小鼠中mfb密度显着降低，主要bouton区域减小，突触前丝状伪足数量减少。这些结果表明ad小鼠呈现出mfb的密度，大小和复杂性的损伤。sip-dc处理恢复了主要bouton区域的大小和突触前丝状伪足的数量。
(4)tat-sip-dc改善app/ps1小鼠中β-catenin聚集和磷酸化。见图6。
以前的研究表明，受其磷酸化调节的β-catenin的积累对于突触形成是至关重要的，ser552位点β-catenin的磷酸化增加了其稳定性并可能诱导其积累。
将小鼠颈椎脱臼处死，迅速取出脑组织，并于冰上0.05mtris缓冲盐溶液(tb，ph7.0)内快速分离双侧海马，制成10﹪的蛋白匀浆，1000rmp离心5分钟，取上清，测定蛋白浓度后备用。检测β-catenin蛋白水平及其磷酸化水平ps552-β-catenin，β-actin为内参。我们发现，ad小鼠表现出β-catenin的积累/磷酸化，sip-dc处理减少了β-catenin的积累/磷酸化
实施例4
tat-sip-dc在老年痴呆细胞模型的应用
(1)多肽tat-sip-dc改善aβ所诱导的β-catenin聚集和磷酸化。见图7。
首先制备aβ寡聚体：将aβ多肽(qiangyao，shanghai，china)溶于100％六氟异丙醇至1mm，通过真空除去六氟异丙醇。将肽重新悬浮于二甲基亚砜中至5mm，进一步用f12(不含酚红)培养基稀释至100μm，并在4℃温育24小时。将溶液以13,000rpm离心20分钟，收集上清液备用或储存在-20℃。在给予aβ处理24h后，收集细胞，1000rmp离心5分钟，取上清，测定蛋白浓度后备用。我们发现，给予aβ处理，导致β-catenin的聚集以及ps552位点的磷酸化增加；sip-dc可以减少aβ引起的β-catenin的积累和过度磷酸化。
(2)tat-sip-dc改善aβ所诱导的mepsc频率下降。见图8。
β-catenin的积累会降低突触囊泡释放速率，这对于突触前成熟是至关重要的。
全细胞记录移液管(3-5mω)中加入含有120mmch4so3,20mmcscl，4mmnacl10mmhepes，0.05mmegta，4mmmg2atp，0.2mmna3gtp，5mmqx-314和w290mosm的溶液。浴溶液含有124mmnacl，3mmkcl，26mmnahco3,1.2mmmgcl2·6h2o，1.25mmnah2po4·2h2o，10mmc6h12o6,2mmcacl2，ph7.4和305mosm。在1μm河豚毒素和10μm荷包牡丹碱存在下，以270mv记录mepsc。使用pclamp10(moleculardevicescorp.，sunnyvale，ca)将mepsc与基线噪音区分开。通过设置-6pa的适当阈值(噪声sd的2.5倍)自动测量微型突触后电流。使用累积概率图来比较来自假手术切片的神经元中mepsc的间隔和振幅。kolmogorov-smirnov双样本检验用于比较间隔和幅度的分布。使用整个3分钟标准采集周期分析数据。
通过全细胞膜片钳实验，我们发现给予aβ处理，mepsc频率下降，证明此时突触前功能受损；sip-dc减少aβ引起的下降的mepsc频率，从而改善这种损伤。
实施例5
tat-sip-dc不影响dapk1的活性。
样品制备同图6。
结果显示，对ad小鼠进行sip-dc处理，dapk1本身及其底物p-mlc未发生改变，即sip-dc处理并未改变dapk1活性，证明其发挥作用的途径不是通过改变dapk1，而只是干扰dapk1和β-catenin的结合。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120>一种透脑性多肽及其在制备防治老年痴呆药物中应用
<141>2018-11-30
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>32
<212>prt
<213>artificialsequence
<400>1
mettyrglyarglyslysargargglnargargargalahisglnasp
151015
thrglnargargthrsermetglyglythrglnglnglnphevalglu
202530
<210>2
<211>32
<212>prt
<213>artificialsequence
<400>2
mettyrglyarglyslysargargglnargargalathrhisarggln
151015
argglnserpheglnglygluthrglnaspglnmetvalglythrarg
202530
1.一种人工合成的多肽，其序列如seqidno:1所示。
2.权利要求1所述的多肽在制备治疗或预防老年痴呆药物中的应用。
3.权利要求1所述的多肽在制备改善老年痴呆早期认知损伤药物中的应用。
4.权利要求1所述的多肽在制备改善老年痴呆模式分别功能损伤药物中的应用。
5.权利要求1所述的多肽在制备改善老年痴呆突触功能药物中的应用。
技术总结