本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的融合蛋白、类病毒颗粒和疫苗及制备方法。
背景技术：
：口蹄疫(foot-and-mouthdisease，fmd)，是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽，常见的如猪、牛、羊等，偶见于人和其他动物。其临诊特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(oie)将其列为a类传染病之首。目前，有三分之二的oie成员国流行fmd，时刻威胁着无fmd国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。猪轮状病毒病是由轮状病毒感染引起的一种以腹泻为特征的传染性人畜共患病，轮状病毒(rotavirus，rv)在猪群中广泛存在，有明显的季节流行性，多发于7-14日龄的仔猪，发病率约50％-80％，死亡率约15％，临床上以萎顿、厌食、呕吐、腹泻和脱水、体重减轻为特征。轮状病毒病呈世界性分布并极难净化，引起严重经济损失。目前市场上口蹄疫疫苗以o/a二价灭活疫苗和o/a二价合成肽疫苗为主，轮状病毒则无商品化的疫苗。其中，在各种预防口蹄疫的疫苗中，用基因工程技术制备亚单位疫苗是近几十年较为成功的方向，类病毒颗粒疫苗(vlp)则是亚单位疫苗中免疫原性最强、效果最突出、具有广阔应用前景的基因工程疫苗。虽然制备口蹄疫类病毒颗粒有多条技术路线，然而口蹄疫病毒颗粒较差的热稳定性和酸稳定性限制了口蹄疫vlp疫苗在放大和生产等方面的应用。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的融合蛋白及其制备方法和其相关生物材料。本发明的第二目的在于提供融合蛋白或生物材料的应用。本发明的第三目的在于提供一种猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的类病毒颗粒及其制备方法。本发明的第四目的在于提供一种抗猪口蹄疫和猪轮状病毒病的类病毒颗粒疫苗。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的融合蛋白，其包括猪口蹄疫病毒的抗原表位和猪轮状病毒的vp6蛋白，且所述融合蛋白能够自行装配成类病毒颗粒。进一步地，所述抗原表位包括vp1蛋白抗原表位129-166aa和vp1蛋白抗原表位196-213aa；优选地，所述抗原表位选自o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位129-166aa和o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位196-213aa；所述o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位129-166aa的氨基酸序列为seqidno.1，所述o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位196-213aa的氨基酸序列为seqidno.2；优选地，所述vp6蛋白的氨基酸序列为seqidno.3；优选地，所述vp6蛋白的核苷酸序列为seqidno.4；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为seqidno.5；优选地，编码所述融合蛋白的核苷酸序列为seqidno.6。上述融合蛋白的制备方法，将猪口蹄疫病毒的抗原表位基因嵌合到猪轮状病毒的vp6蛋白基因中得到融合的基因重组片段，该重组片段经表达体系表达得到所述融合蛋白。进一步地，嵌合位点为猪轮状病毒的vp6蛋白表面的loop区；优选地，该基因重组片段的序列如seqidno.6所示；优选地，表达体系包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或者哺乳动物细胞，优选为酵母；优选地，重组片段通过不同表达载体导入表达体系的同一细胞中，表达得到融合蛋白。与上述融合蛋白相关的生物材料，所述生物材料为如下任一种：(a)核酸分子，编码本发明的融合蛋白；(b)表达盒，含有(a)中核酸分子；(c)重组载体，含有(a)中核酸分子或(b)中表达盒；(d)重组真核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体；(e)重组原核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体。上述融合蛋白或生物材料在制备类病毒颗粒或疫苗中的应用。一种猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的类病毒颗粒，包括载体和载体表面展示蛋白，载体包括猪轮状病毒的vp6蛋白，载体表面展示蛋白包括猪口蹄疫病毒的抗原表位。进一步地，所述抗原表位包括vp1蛋白抗原表位129-166aa和vp1蛋白抗原表位196-213aa；优选地，所述抗原表位选自o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位129-166aa，其氨基酸序列为seqidno.1，以及，o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位196-213aa，其氨基酸序列为seqidno.2；优选地，所述vp6蛋白的氨基酸序列为seqidno.3；优选地，所述vp6蛋白的核苷酸序列为seqidno.4。上述类病毒颗粒的制备方法，将编码本发明融合蛋白的重组片段在表达系统中表达，得到的融合蛋白自行装配成类病毒颗粒。进一步地，重组片段的核苷酸序列为seqidno.6；优选地，表达体系包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或者哺乳动物细胞，优选为酵母；优选地，重组片段通过不同表达载体导入表达体系的同一细胞中，表达且自行装配成类病毒颗粒；优选地，融合蛋白自行装配成类病毒颗粒的缓冲液包括40-60mm柠檬酸钠和250-350mm氯化钠，ph4.5-5。一种抗猪口蹄疫和猪轮状病毒病的类病毒颗粒疫苗，包括药学上或兽学上可接受的辅料和本发明的类病毒颗粒；优选地，辅料包括用于注射制剂的辅料和用于口服制剂的辅料；优选地，用于注射制剂的辅料包括佐剂；优选地，佐剂包括铝盐佐剂、水包油乳剂、油包水乳剂、水包油包水佐剂或脂质体，优选为isa206佐剂。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的融合蛋白包括猪口蹄疫病毒的抗原表位和猪轮状病毒的vp6蛋白，且该融合蛋白能够自行装配成类病毒颗粒。本发明以猪轮状病毒的vp6蛋白为载体，嵌合上猪口蹄疫病毒的抗原表位后获得融合蛋白，该融合蛋白可以自行装配成类病毒颗粒，使猪口蹄疫病毒的抗原表位能够展示到该类病毒颗粒的表面，得到的类病毒颗粒对猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒均具有很好的免疫原性。由该类病毒颗粒制备得到的疫苗为二联疫苗，使得动物同时获得猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的免疫原性，免疫效果好，扩大了疾病防控范围，节省了劳力，提高了工作效率。此外，该类病毒颗粒疫苗克服了现有技术中口蹄疫类病毒颗粒疫苗的缺陷，同时填补了现有技术中无商品化轮状病毒疫苗的空白，适合工业化生产和推广使用。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1中融合蛋白sds-page检测结果；图2为本发明实施例1中融合蛋白westernblot检测结果；图3为本发明实施例2中类病毒颗粒的电镜检测结果。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。本发明保护猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的融合蛋白，其包括猪口蹄疫病毒的抗原表位和猪轮状病毒的vp6蛋白，且融合蛋白能够自行装配成类病毒颗粒。本发明基于抗猪口蹄疫病毒疫苗和抗猪轮状病毒疫苗的现状，创造性地将猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒二者各自的疫苗主要靶标结合，以猪轮状病毒的vp6蛋白为载体，嵌合上猪口蹄疫病毒的抗原表位后获得融合蛋白，该融合蛋白可以自行装配成类病毒颗粒，使猪口蹄疫病毒的抗原表位能够展示到该类病毒颗粒的表面，得到的类病毒颗粒对猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒均具有很好的免疫原性。需要说明的是，该融合蛋白组合成为类病毒颗粒，且该类病毒颗粒具有猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒两种免疫原性的原因至少为：猪口蹄疫病毒的抗原表位片段比较不会阻碍猪轮状病毒的vp6蛋白的折叠，或猪轮状病毒的vp6蛋白片段比较不会阻碍猪口蹄疫病毒的抗原表位片段的折叠，或以上两个原因都存在。在优选的实施方式中，抗原表位包括vp1蛋白的g-h环(129-166aa)和vp1蛋白抗原表位196-213aa。进一步优选自o型口蹄疫病毒的vp1蛋白g-h环(129-166aa)，其氨基酸序列为seqidno.1，以及，o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位196-213aa，其氨基酸序列为seqidno.2。ysgtskysasqnrrgdlgplaarlaaqlpasfnfgai(seqidno.1)。sqdrhkqkiiapakq(seqidno.2)。在优选的实施方式中，vp6蛋白的氨基酸序列为seqidno.3，编码vp6蛋白的核苷酸序列优选为seqidno.4。mevlyslsktlkdardkivegtlysnvsdliqqfnqmivtmngndfqtggignlpirnwtfdfgllgttllnldanyvenarttieyfidfidnvcmdeiaresqrngiapqsealrklsgikfkrinfdnssdyienwnlqnrrqrtgfvfhkpnilpysasftlnrsqpahdnlmgtmwinagseiqvagfdyscafnapaniqqfehvvplrralttatitllpdaerfgfprvinsaggtttwyfnpvilrpsnvevefllngqiintyqarfgtiiarnfdtirlsfqlvrppnmtpavanlfpqappfifhatvgltlrtesavcesvladasetllanvtavrqeyaipvgpvfppgmnwtelvtnyspsrednlqrvftvasirsmlik(seqidno.3)。atggaagttttgtactctttgtctaagactttgaaggacgctagagacaagatcgttgaaggtactttgtactctaacgtttctgacttgatccaacaattcaaccaaatgatcgttactatgaacggtaacgacttccaaactggtggtatcggtaacttgccaatcagaaactggactttcgacttcggtttgttgggtactactttgttgaacttggacgctaactacgttgaaaacgctagaactactatcgaatacttcatcgacttcatcgacaacgtttgtatggacgaaatcgctagagaatctcaaagaaacggtatcgctccacaatctgaagctttgagaaagttgtctggtatcaagttcaagagaatcaacttcgacaactcttctgactacatcgaaaactggaacttgcaaaacagaagacaaagaactggtttcgttttccacaagccaaacatcttgccatactctgcttctttcactttgaacagatctcaaccagctcacgacaacttgatgggtactatgtggatcaacgctggttctgaaatccaagttgctggtttcgactactcttgtgctttcaacgctccagctaacatccaacaattcgaacacgttgttccattgagaagagctttgactactgctactatcactttgttgccagacgctgaaagattcggtttcccaagagttatcaactctgctggtggtactactacttggtacttcaacccagttatcttgagaccatctaacgttgaagttgaattcttgttgaacggtcaaatcatcaacacttaccaagctagattcggtactatcatcgctagaaacttcgacactatcagattgtctttccaattggttagaccaccaaacatgactccagctgttgctaacttgttcccacaagctccaccattcatcttccacgctactgttggtttgactttgagaactgaatctgctgtttgtgaatctgttttggctgacgcttctgaaactttgttggctaacgttactgctgttagacaagaatacgctatcccagttggtccagttttcccaccaggtatgaactggactgaattggttactaactactctccatctagagaagacaacttgcaaagagttttcactgttgcttctatcagatctatgttgatcaag(seqidno.4)。经特定的抗原表位选择使得本发明中的融合蛋白更易自行装配成类病毒颗粒，且具有猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的免疫原性。在更优选的实施方式中，融合蛋白的氨基酸序列为seqidno.5所示。mevlyslsktlkdardkivegtlysnvsdliqqfnqmivtmngndfqtggignlpirnwtfdfgllgttllnldanyvenarttieyfidfidnvcmdeiaresqrngiapqsealrklsgikfkrinfdnssdyienwnlqnrrqrtgfvfhkpnilpysasftlnsqdrhkqkiiapakqgtmwinagseiqvagfdyscafnapaniqqfehvvplrralttatitllpdaerfgfprvinsaggtttwyfnpvilrpsnvevefllngqiintyqarfgtiiarnfdtirlsfqlysgtskysasqnrrgdlgplaarlaaqlpasfnfgaihatvgltlrtesavcesvladasetllanvtavrqeyaipvgpvfppgmnwtelvtnyspsrednlqrvftvasirsmlik(seqidno.5)。编码融合蛋白的核苷酸序列优选为如下：atggaagttttgtactctttgtctaagactttgaaggacgctagagacaagatcgttgaaggtactttgtactctaacgtttctgacttgatccaacaattcaaccaaatgatcgttactatgaacggtaacgacttccaaactggtggtatcggtaacttgccaatcagaaactggactttcgacttcggtttgttgggtactactttgttgaacttggacgctaactacgttgaaaacgctagaactactatcgaatacttcatcgacttcatcgacaacgtttgtatggacgaaatcgctagagaatctcaaagaaacggtatcgctccacaatctgaagctttgagaaagttgtctggtatcaagttcaagagaatcaacttcgacaactcttctgactacatcgaaaactggaacttgcaaaacagaagacaaagaactggtttcgttttccacaagccaaacatcttgccatactctgcttctttcactttgaactctcaagacagacacaagcaaaagatcatcgctccagctaagcaaggtactatgtggatcaacgctggttctgaaatccaagttgctggtttcgactactcttgtgctttcaacgctccagctaacatccaacaattcgaacacgttgttccattgagaagagctttgactactgctactatcactttgttgccagacgctgaaagattcggtttcccaagagttatcaactctgctggtggtactactacttggtacttcaacccagttatcttgagaccatctaacgttgaagttgaattcttgttgaacggtcaaatcatcaacacttaccaagctagattcggtactatcatcgctagaaacttcgacactatcagattgtctttccaattgtactctggtacttctaagtactctgcttctcaaaacagaagaggtgacttgggtccattggctgctagattggctgctcaattgccagcttctttcaacttcggtgctatccacgctactgttggtttgactttgagaactgaatctgctgtttgtgaatctgttttggctgacgcttctgaaactttgttggctaacgttactgctgttagacaagaatacgctatcccagttggtccagttttcccaccaggtatgaactggactgaattggttactaactactctccatctagagaagacaacttgcaaagagttttcactgttgcttctatcagatctatgttgatcaag(seqidno.6)。本发明还保护该融合蛋白的制备方法，具体地，将猪口蹄疫病毒的抗原表位基因嵌合到猪轮状病毒的vp6蛋白基因中得到重组片段，该重组片段经表达体系表达得到该融合蛋白。该方法保证猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的抗原活性，得到的融合蛋白又能够组装成类病毒颗粒。嵌合位点优选为猪轮状病毒的vp6蛋白表面的loop区。将猪口蹄疫病毒的抗原表位基因嵌合在猪轮状病毒的vp6基因表面的loop区，既不会影响二种病毒的抗原活性，也不会相互影响蛋白片段的折叠，能够顺利组装成类病毒颗粒。重组片段优选为seqidno.6所示的核苷酸序列。在优选的实施方式中，重组片段在表达体系中可以表达得到融合蛋白，该表达体系可以为大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或者哺乳动物细胞等等。优选为酵母，利用酵母细胞作为表达体系，可以显著提高目的蛋白的表达量，降低生产成本。此外，为了更进一步的提高表达体系的蛋白表达量，可以通过多次电转的方式实现，具体地，在第一次筛选得到高表达细胞的基础上，再次整合进含有目的重组片段的其他表达载体，提高目标蛋白的表达量。与本发明融合蛋白相关的生物材料，为如下任一种：(a)核酸分子，编码本发明的融合蛋白；(b)表达盒，含有(a)中核酸分子；(c)重组载体，含有(a)中核酸分子或(b)中表达盒；(d)重组真核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体；(e)重组原核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体。本发明还保护融合蛋白或生物材料在制备类病毒颗粒或疫苗中的应用。本发明还保护猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的类病毒颗粒，其包括载体和载体表面展示蛋白，载体包括猪轮状病毒的vp6蛋白，载体表面展示蛋白包括猪口蹄疫病毒的抗原表位。该类病毒颗粒使得抗原高度集中，且口蹄疫抗原表位具有一定的空间结构，具有较好的免疫效果。在优选的实施方式中，抗原表位包括vp1蛋白抗原表位129-166aa和vp1蛋白抗原表位196-213aa。优选自o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位129-166aa，其氨基酸序列为seqidno.1，以及，o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位196-213aa，其氨基酸序列为seqidno.2。在优选的实施方式中，vp6蛋白的氨基酸序列为seqidno.3；编码vp6蛋白的核苷酸序列为seqidno.4。本发明还保护类病毒颗粒的制备方法，将编码本发明融合蛋白的重组片段在表达系统中表达，得到的融合蛋白自行装配成类病毒颗粒。在优选的实施方式中，重组片段的核苷酸序列为seqidno.6；表达体系例如为大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或者哺乳动物细胞。此外，融合蛋白在如下缓冲液中可以自行装配成类病毒颗粒：40-60mm柠檬酸钠和250-350mm氯化钠，ph4.5-5；优选为50mm柠檬酸钠，300mmnacl，ph4.85；融合蛋白自行装配的温度优选为2-8℃，进一步优选为4℃。本发明最后保护抗猪口蹄疫和猪轮状病毒病的类病毒颗粒疫苗，其包括药学上或兽学上可接受的辅料和本发明类病毒颗粒。由该类病毒颗粒制备得到的疫苗为二联疫苗，使得动物同时获得猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的免疫原性，免疫效果好，扩大了疾病防控范围，节省了劳力，提高了工作效率。此外，该类病毒颗粒疫苗克服了现有技术中口蹄疫类病毒颗粒疫苗的缺陷，同时填补了现有技术中无商品化轮状病毒疫苗的空白，适合工业化生产和推广使用。在优选的实施方式中，辅料包括用于注射制剂的辅料和用于口服制剂的辅料。其中，用于注射制剂的辅料包括佐剂，佐剂可以为铝盐佐剂、水包油乳剂、油包水乳剂、水包油包水佐剂或脂质体，优选为isa206佐剂。下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。实施例1通过毕赤酵母表达系统表达融合蛋白通过结构生物学的手段，对猪轮状病毒vp6蛋白结构进行分析，找出适合猪口蹄疫病毒vp1蛋白抗原位点整合和替代的氨基酸序列进行替换，替换后的序列命名为vp6-vp1融合蛋白，具体序列如seqidno.5所示；对替换后的vp6-vp1融合蛋白进行毕赤酵母表达系统密码子优化，并通过基因工程的手段，合成编码vp6-vp1融合蛋白基因(seqidno.6所示的重组片段)，将目的基因通过bstbi和xbai插入到ppiczαa载体中，经酶切鉴定和测序，筛选出阳性重组载体，并转化到e.colidh5α感受态细胞中进行扩增，大量提取质粒，命名为ppiczαa-rvp6-fmdvp1。将ppiczαa-rvp6-fmdvp1质粒利用pmei限制性内切酶进行线性化酶切后，回收线性表达质粒，对其纯度和浓度进行测定。制备毕赤酵母x33菌株电转化感受态细胞，并将线性化的ppiczαa-rvp6-fmdvp1载体与感受态细胞混合放置后电转，电转后的菌液直接涂高浓度zeocin抗生素平板进行筛选；将平板上长出的单克隆菌株摇菌培养扩增表达，经发酵后的菌体进行破碎和sds-page检测和westernblot检测，检测结果呈阳性的菌株即为可表达vp6-vp1融合蛋白的毕赤酵母x33工程菌。sds-page检测结果如图1所示，westernblot检测结果如图2所示，其中，c为对照组，1为实验组。取所述工程菌于bmgy培养基中，30℃培养24h进行活化；取活化的培养菌液按1：400的比例接种于bmgy培养基中进行发酵，30℃培养24h后换到bmmy培养基中继续诱导表达，每24h补加一次甲醇使甲醇终浓度为0.5％，诱导表达72h后收菌。实施例2vp6-vp1融合蛋白的纯化和vlp的组装向上述的菌体中按照质量体积比为1：10的比例加入buffera(20mmhepes，300mmnacl，ph7.3)，利用高压破碎法将菌体破碎；将所述的破碎后的细胞于4℃，12000rpm离心60min，离心上清先用30％硫酸铵在4℃条件下沉淀1h后，沉淀再次用buffera重悬进行粗纯。将上述的纯化后的目的蛋白利用凝胶过滤层析进行二次纯化，收集目的蛋白，将目的蛋白换至bufferb(50mm柠檬酸钠，300mmnacl，ph4.85)中后4℃放置进行组装，用电镜检测其颗粒大小和均一度，结果如图3所示。实施例3疫苗的配制将如上所述融合蛋白使用pbs溶液稀释成不同的浓度，将稀释后的融合蛋白溶液与seppicisa206佐剂按抗原组分与佐剂1:1比例混合在一起，最终配制成25μg/头份、50μg/头份、100μg/头份、150μg/头份不同抗原梯度疫苗。以8000r/min的转速搅拌8-10min，在终止搅拌前加入0.01％(体积比)硫柳汞溶液，充分振荡混匀后，按照《中国兽药典》(现行版)附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于4℃备用。实施例4重组vlp疫苗安全性和抗体检测4.1方法4.1.1动物和免疫21日龄的新生仔猪经猪口蹄疫、猪水泡口炎病、猪水泡炎病毒抗体试剂盒检测均为阴性者，pcr检测猪轮状病毒为阴性。实施例3制备得到的疫苗。新生仔猪每组10只，分成5组，1组为生理盐水对照组，2-5组新生仔猪分别肌肉注射25μg/头份、50μg/头份、100μg/头份、150μg/头份疫苗。在免疫前取血。新生仔猪免疫完成后21天进行二次免疫。二免后14日每周取血，检测fmdv和轮状病毒抗体水平。在免疫前后观察每组猪的体重变化，观察是否有发热、厌食等现象。4.1.2血清抗体检测抗体检测方法分别按照中国农业科学院兰州兽医研究所生产的口蹄疫病毒o型抗体液相阻断elisa检测试剂盒和自制的猪轮状病毒检测方法进行。二免后两周，每周采集血液，分离血清进行抗体检测。4.1.3猪轮状病毒检测方法建立将分离到的猪轮状病毒用50mmph7.6的磷酸盐缓冲液稀释后包被于酶标板中，100μl/孔，4℃过夜。次日弃去包被液，用pbst洗涤3次，200μl/孔。加入2％牛血清白蛋白(bsa)作为封闭液，100μl/孔，37℃1h。弃去封闭液，洗涤3次后将阴性和阳性血清用1％牛血清白蛋白(bsa)分别按比例稀释后加入酶标板中，100μl/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤5次后加入用1％牛血清白蛋白(bsa)按1：2500稀释的hrp标记的羊抗猪igg，100μl/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤5次后加入tmb显色液，100μl/孔，37℃避光显色15min，然后加入2mol/lh2so4终止反应，100μl/孔。在酶标仪上读od450nm值。4.2结果:4.2.1fmd抗体检测50头免疫仔猪，二免后14日进行每周采血分离血清，用于检测fmdelisa抗体水平，检测结果见表1-3，检测统计结果见表4。表1二免14日o型口蹄疫抗体检测结果(单位：log10(效价))a组b组c组d组e组11.51.51.951.95021.651.51.81.8031.21.651.81.8041.51.22.12.1051.351.81.82.1061.651.651.82.25071.51.51.81.8081.051.81.82.1091.21.651.951.80101.21.51.81.80均值1.381.581.861.950表2二免21日o型口蹄疫抗体检测结果(单位：log10(效价))a组b组c组d组e组11.21.351.81.8021.351.651.82.1031.51.651.82.1041.651.82.11.95051.51.951.952.1061.51.82.12.1071.21.51.951.8081.21.81.951.95091.21.81.82.10101.351.651.82.10均值1.371.701.912.010表3二免28日o型口蹄疫抗体检测结果(单位：log10(效价))表4实验仔猪fmd抗体检测情况4.2.2轮状病毒抗体检测仔猪二免后14日，50μg/头剂量组所有仔猪抗体水平均转阳(s/n值>2.1)。100μg/头剂量组和150μg/头剂量组所有仔猪，二免后14日抗体水平持续升高，明显优于其他低剂量组。具体检测结果见表5。表5实验仔猪轮状病毒抗体检测情况上述结果可知，疫苗中抗原含量的增加，对应抗体效价相应的升高，说明抗原免疫仔猪后能够产生良好的免疫原性。4.2.3免后观察仔猪免疫后体重与对照组仔猪体重增长无明显差异,也无观察到发热、厌食等现象，表明本发明的疫苗安全，见表6。表6疫苗免疫后安全性试验临床观察情况尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。sequencelisting<110>天康生物(上海)有限公司天康生物股份有限公司<120>猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的融合蛋白、类病毒颗粒和疫苗及制备方法<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>37<212>prt<213>人工序列<400>1tyrserglythrserlystyrseralaserglnasnargargglyasp151015leuglyproleualaalaargleualaalaglnleuproalaserphe202530asnpheglyalaile35<210>2<211>15<212>prt<213>人工序列<400>2serglnasparghislysglnlysileilealaproalalysgln151015<210>3<211>397<212>prt<213>人工序列<400>3metgluvalleutyrserleuserlysthrleulysaspalaargasp151015lysilevalgluglythrleutyrserasnvalseraspleuilegln202530glnpheasnglnmetilevalthrmetasnglyasnasppheglnthr354045glyglyileglyasnleuproileargasntrpthrpheaspphegly505560leuleuglythrthrleuleuasnleuaspalaasntyrvalgluasn65707580alaargthrthrileglutyrpheileasppheileaspasnvalcys859095metaspgluilealaarggluserglnargasnglyilealaprogln100105110serglualaleuarglysleuserglyilelysphelysargileasn115120125pheaspasnserserasptyrilegluasntrpasnleuglnasnarg130135140argglnargthrglyphevalphehislysproasnileleuprotyr145150155160seralaserphethrleuasnargserglnproalahisaspasnleu165170175metglythrmettrpileasnalaglysergluileglnvalalagly180185190pheasptyrsercysalapheasnalaproalaasnileglnglnphe195200205gluhisvalvalproleuargargalaleuthrthralathrilethr210215220leuleuproaspalagluargpheglypheproargvalileasnser225230235240alaglyglythrthrthrtrptyrpheasnprovalileleuargpro245250255serasnvalgluvalglupheleuleuasnglyglnileileasnthr260265270tyrglnalaargpheglythrileilealaargasnpheaspthrile275280285argleuserpheglnleuvalargproproasnmetthrproalaval290295300alaasnleupheproglnalapropropheilephehisalathrval305310315320glyleuthrleuargthrgluseralavalcysgluservalleuala325330335aspalasergluthrleuleualaasnvalthralavalargglnglu340345350tyralaileprovalglyprovalpheproproglymetasntrpthr355360365gluleuvalthrasntyrserproserarggluaspasnleuglnarg370375380valphethrvalalaserileargsermetleuilelys385390395<210>4<211>1191<212>dna<213>人工序列<400>4atggaagttttgtactctttgtctaagactttgaaggacgctagagacaagatcgttgaa60ggtactttgtactctaacgtttctgacttgatccaacaattcaaccaaatgatcgttact120atgaacggtaacgacttccaaactggtggtatcggtaacttgccaatcagaaactggact180ttcgacttcggtttgttgggtactactttgttgaacttggacgctaactacgttgaaaac240gctagaactactatcgaatacttcatcgacttcatcgacaacgtttgtatggacgaaatc300gctagagaatctcaaagaaacggtatcgctccacaatctgaagctttgagaaagttgtct360ggtatcaagttcaagagaatcaacttcgacaactcttctgactacatcgaaaactggaac420ttgcaaaacagaagacaaagaactggtttcgttttccacaagccaaacatcttgccatac480tctgcttctttcactttgaacagatctcaaccagctcacgacaacttgatgggtactatg540tggatcaacgctggttctgaaatccaagttgctggtttcgactactcttgtgctttcaac600gctccagctaacatccaacaattcgaacacgttgttccattgagaagagctttgactact660gctactatcactttgttgccagacgctgaaagattcggtttcccaagagttatcaactct720gctggtggtactactacttggtacttcaacccagttatcttgagaccatctaacgttgaa780gttgaattcttgttgaacggtcaaatcatcaacacttaccaagctagattcggtactatc840atcgctagaaacttcgacactatcagattgtctttccaattggttagaccaccaaacatg900actccagctgttgctaacttgttcccacaagctccaccattcatcttccacgctactgtt960ggtttgactttgagaactgaatctgctgtttgtgaatctgttttggctgacgcttctgaa1020actttgttggctaacgttactgctgttagacaagaatacgctatcccagttggtccagtt1080ttcccaccaggtatgaactggactgaattggttactaactactctccatctagagaagac1140aacttgcaaagagttttcactgttgcttctatcagatctatgttgatcaag1191<210>5<211>417<212>prt<213>人工序列<400>5metgluvalleutyrserleuserlysthrleulysaspalaargasp151015lysilevalgluglythrleutyrserasnvalseraspleuilegln202530glnpheasnglnmetilevalthrmetasnglyasnasppheglnthr354045glyglyileglyasnleuproileargasntrpthrpheaspphegly505560leuleuglythrthrleuleuasnleuaspalaasntyrvalgluasn65707580alaargthrthrileglutyrpheileasppheileaspasnvalcys859095metaspgluilealaarggluserglnargasnglyilealaprogln100105110serglualaleuarglysleuserglyilelysphelysargileasn115120125pheaspasnserserasptyrilegluasntrpasnleuglnasnarg130135140argglnargthrglyphevalphehislysproasnileleuprotyr145150155160seralaserphethrleuasnserglnasparghislysglnlysile165170175ilealaproalalysglnglythrmettrpileasnalaglyserglu180185190ileglnvalalaglypheasptyrsercysalapheasnalaproala195200205asnileglnglnphegluhisvalvalproleuargargalaleuthr210215220thralathrilethrleuleuproaspalagluargpheglyphepro225230235240argvalileasnseralaglyglythrthrthrtrptyrpheasnpro245250255valileleuargproserasnvalgluvalglupheleuleuasngly260265270glnileileasnthrtyrglnalaargpheglythrileilealaarg275280285asnpheaspthrileargleuserpheglnleutyrserglythrser290295300lystyrseralaserglnasnargargglyaspleuglyproleuala305310315320alaargleualaalaglnleuproalaserpheasnpheglyalaile325330335hisalathrvalglyleuthrleuargthrgluseralavalcysglu340345350servalleualaaspalasergluthrleuleualaasnvalthrala355360365valargglnglutyralaileprovalglyprovalpheproprogly370375380metasntrpthrgluleuvalthrasntyrserproserarggluasp385390395400asnleuglnargvalphethrvalalaserileargsermetleuile405410415lys<210>6<211>1251<212>dna<213>人工序列<400>6atggaagttttgtactctttgtctaagactttgaaggacgctagagacaagatcgttgaa60ggtactttgtactctaacgtttctgacttgatccaacaattcaaccaaatgatcgttact120atgaacggtaacgacttccaaactggtggtatcggtaacttgccaatcagaaactggact180ttcgacttcggtttgttgggtactactttgttgaacttggacgctaactacgttgaaaac240gctagaactactatcgaatacttcatcgacttcatcgacaacgtttgtatggacgaaatc300gctagagaatctcaaagaaacggtatcgctccacaatctgaagctttgagaaagttgtct360ggtatcaagttcaagagaatcaacttcgacaactcttctgactacatcgaaaactggaac420ttgcaaaacagaagacaaagaactggtttcgttttccacaagccaaacatcttgccatac480tctgcttctttcactttgaactctcaagacagacacaagcaaaagatcatcgctccagct540aagcaaggtactatgtggatcaacgctggttctgaaatccaagttgctggtttcgactac600tcttgtgctttcaacgctccagctaacatccaacaattcgaacacgttgttccattgaga660agagctttgactactgctactatcactttgttgccagacgctgaaagattcggtttccca720agagttatcaactctgctggtggtactactacttggtacttcaacccagttatcttgaga780ccatctaacgttgaagttgaattcttgttgaacggtcaaatcatcaacacttaccaagct840agattcggtactatcatcgctagaaacttcgacactatcagattgtctttccaattgtac900tctggtacttctaagtactctgcttctcaaaacagaagaggtgacttgggtccattggct960gctagattggctgctcaattgccagcttctttcaacttcggtgctatccacgctactgtt1020ggtttgactttgagaactgaatctgctgtttgtgaatctgttttggctgacgcttctgaa1080actttgttggctaacgttactgctgttagacaagaatacgctatcccagttggtccagtt1140ttcccaccaggtatgaactggactgaattggttactaactactctccatctagagaagac1200aacttgcaaagagttttcactgttgcttctatcagatctatgttgatcaag1251当前第1页1 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技术特征：1.一种猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的融合蛋白，其特征在于，其包括猪口蹄疫病毒的抗原表位和猪轮状病毒的vp6蛋白，且所述融合蛋白能够自行装配成类病毒颗粒。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗原表位包括vp1蛋白抗原表位129-166aa和vp1蛋白抗原表位196-213aa；
优选地，所述抗原表位选自o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位129-166aa和o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位196-213aa；
所述o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位129-166aa的氨基酸序列为seqidno.1，所述o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位196-213aa的氨基酸序列为seqidno.2；
优选地，所述vp6蛋白的氨基酸序列为seqidno.3；
优选地，所述vp6蛋白的核苷酸序列为seqidno.4；
优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为seqidno.5；
优选地，编码所述融合蛋白的核苷酸序列为seqidno.6。
3.权利要求1或2所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，将猪口蹄疫病毒的抗原表位基因嵌合到猪轮状病毒的vp6蛋白基因中得到融合的基因重组片段，该基因重组片段经表达体系表达得到所述融合蛋白；
优选地，嵌合位点为猪轮状病毒的vp6蛋白表面的loop区；
优选地，该基因重组片段的序列如seqidno.6所示；
优选地，表达体系包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或者哺乳动物细胞，优选为酵母；
优选地，重组片段通过不同表达载体导入表达体系的同一细胞中，表达得到融合蛋白。
4.与权利要求1或2所述融合蛋白相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为如下任一种：
(a)核酸分子，编码权利要求1或2所述的融合蛋白；
(b)表达盒，含有(a)中核酸分子；
(c)重组载体，含有(a)中核酸分子或(b)中表达盒；
(d)重组真核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体；
(e)重组原核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体。
5.权利要求1或2所述融合蛋白或权利要求4所述的生物材料在制备类病毒颗粒或疫苗中的应用。
6.一种猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的类病毒颗粒，其特征在于，包括载体和载体表面展示蛋白，载体包括猪轮状病毒的vp6蛋白，载体表面展示蛋白包括猪口蹄疫病毒的抗原表位。
7.根据权利要求6所述的类病毒颗粒，其特征在于，所述抗原表位包括vp1蛋白抗原表位129-166aa和vp1蛋白抗原表位196-213aa；
优选地，所述抗原表位选自o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位129-166aa，其氨基酸序列为seqidno.1，以及，o型口蹄疫病毒的vp1蛋白抗原表位196-213aa，其氨基酸序列为seqidno.2；
优选地，所述vp6蛋白的氨基酸序列为seqidno.3；
优选地，所述vp6蛋白的核苷酸序列为seqidno.4。
8.权利要求6或7所述类病毒颗粒的制备方法，其特征在于，将编码权利要求1或2所述的融合蛋白的重组片段在表达系统中表达，得到的融合蛋白自行装配成类病毒颗粒。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，重组片段的核苷酸序列为seqidno.6；
优选地，表达体系包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或者哺乳动物细胞，优选为酵母；
优选地，重组片段通过不同表达载体导入表达体系的同一细胞中，表达且自行装配成类病毒颗粒；
优选地，融合蛋白自行装配成类病毒颗粒的缓冲液包括40-60mm柠檬酸钠和250-350mm氯化钠，ph4.5-5。
10.一种抗猪口蹄疫和猪轮状病毒病的类病毒颗粒疫苗，其特征在于，包括药学上或兽学上可接受的辅料和权利要求6或7所述的类病毒颗粒；
优选地，辅料包括用于注射制剂的辅料和用于口服制剂的辅料；
优选地，用于注射制剂的辅料包括佐剂；
优选地，佐剂包括铝盐佐剂、水包油乳剂、油包水乳剂、水包油包水佐剂或脂质体，优选为isa206佐剂。
技术总结本发明涉及分子生物学领域，具体而言，提供了一种猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的融合蛋白、类病毒颗粒和疫苗及制备方法。本发明提供的融合蛋白包括猪口蹄疫病毒的抗原表位和猪轮状病毒的VP6蛋白，且该融合蛋白能够自行装配成类病毒颗粒。本发明以猪轮状病毒的VP6蛋白为载体，嵌合上猪口蹄疫病毒的抗原表位后获得融合蛋白，该融合蛋白可以自行装配成类病毒颗粒，使猪口蹄疫病毒的抗原表位能够展示到该类病毒颗粒的表面，得到的类病毒颗粒对猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒均具有很好的免疫原性。由该类病毒颗粒制备得到的疫苗为二联疫苗，使得动物同时获得猪口蹄疫病毒和猪轮状病毒的免疫原性，免疫效果好。
技术研发人员：贺笋;闫鹏先;张国庆;潘毅平;郭苗苗;肖升东;赵毅;李延涛
受保护的技术使用者：天康生物(上海)有限公司;天康生物股份有限公司
技术研发日：2020.03.10
技术公布日：2020.06.09
