本发明涉及石斛加工技术领域，具体涉及一种铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺。
背景技术：
铁皮石斛是兰科草本植物，生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上。主要分布于中国安徽、浙江、福建等地。铁皮石斛具有滋阴养胃、润肺止咳和清热明目之功效，是传统的珍稀名贵中药材之一，名列“九大仙草”之首，因具有抗肿瘤、抗衰老、抗声带疲劳、扩张血管和增强人体免疫力等作用，被称为救命仙草。
经现代药理学研究证明，铁皮石斛中含有的主要活性成分为石斛多糖、石斛碱、氨基酸、芪类及其衍生物、微量元素以及多种挥发性成分等。石斛多糖具有提高免疫力、抗肿瘤作用；可改善造血、凝血功能，对降低血糖也有一定功效；对治疗中枢神经系统、肝脏、肾脏、胃肠道病变有效；对烫伤、病毒、细菌感染也有显著疗效。石斛碱可用于预防和治疗关节炎，保护消化道粘膜急性或慢性损伤，特别用于防治急性的慢性消化道溃疡，此外还有报道石斛生物碱具有调节雌性激素分泌和促进卵泡发育、降低心率、抑菌、镇痛、改善记忆力减退等作用。
目前，石斛多糖和石斛碱可作为保健品或保健食品的添加成分，具有较高的经济价值，因此，大规模提取铁皮石斛中石斛多糖和石斛碱具有产业价值。现有石斛多糖提取方式主要有加热浸提法、酶解法、超声辅助提取法、微波辅助提取法等，石斛碱的提取方式也比较多，常规提取方法主要有浸渍法、渗漉法、回流法、微波辅助萃取、超声波提取法等方法，但是同时对石斛多糖和石斛碱提取的方法较少，石斛多糖和石斛碱提取时回相互干扰，且铁皮石斛中的蛋白质和色素也混杂在提取的石斛多糖和石斛碱中，影响产品的品质。
技术实现要素：
本发明目的是为了弥补已有技术缺陷，提供一种铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，实现对铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的分步提取，石斛多糖和石斛碱提取率高，得到的石斛多糖和石斛碱纯度高。
为实现上述目的，本发明通过以下方案予以实现：
本发明提供了一种铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，包括以下步骤：
(1)将石斛洗净后置于50-60℃恒温干燥箱中干燥4-5h，然后将石斛粉碎过50-60目筛；
(2)将石斛粉末放入萃取釜中，进行超临界co2萃取，再将萃取后的萃取液经过分离釜分离出co2，得到提取液a；
(3)将提取液a用水和氯仿混合的萃取液进行萃取，充分混合后于4-6℃静置10-12h，取氯仿层，将氯仿层溶液进行减压浓缩、干燥，得石斛碱；
(4)向经过步骤(2)萃取后的石斛渣中加入20-30倍质量的蒸馏水，超声处理10-20min，水浴处理2-5h，然后置于离心机中离心分离，收集上清液，将上清液蒸发浓缩得到提取液b；
(5)向提取液b中加入3-4倍体积的无水乙醇，充分混合后于4-6℃静置沉淀8-10h，醇沉液抽滤后保留沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀溶于相同质量的蒸馏水中，调节ph值，然后向溶液加入蛋白酶进行酶解处理，再向酶解处理后的溶液中加入3-4倍体积的三氯乙酸溶液，充分混合后后于4-6℃静置沉淀8-10h，过滤收集滤液；
(7)向步骤(6)所得滤液中加入活性炭，静置1-2h过滤收集滤液，将滤液进行冷冻，使滤液冻结成干块，使用冷冻干燥机对冷冻后的滤液干块干燥后得到石斛多糖。
优选地，步骤(2)中超临界co2萃取的萃取条件为：萃取温度45-55℃，萃取压力20-25mpa，萃取时间为5-8min。
优选地，步骤(2)中分离釜的温度为35-36℃，压力为15-18mpa，时间为3-5min。
优选地，步骤(3)中萃取液水和氯仿的体积比为1：1-4。
优选地，步骤(4)中超声处理的频率为40-50khz，水浴处理温度为60-80℃。
优选地，步骤(4)中上清液蒸发浓缩8-10倍。
优选地，步骤(6)中使用5wt％的氢氧化钠溶液调节溶液ph，ph调节至8-9。
优选地，步骤(6)中蛋白酶酶活性为150-200u/mg，加入蛋白酶的量为0.08-0.1g/l，酶解温度为36-38℃，酶解时间为30-60min。
优选地，步骤(6)中三氯乙酸溶液浓度为5wt％。
优选地，步骤(7)中加入活性炭质量占滤液总质量的1-2％。
本发明的有益效果是：
本发明采用超临界co2萃取提取铁皮石斛中的石斛碱，用的co2作为流体可循环使用，无溶剂残留，且co2可提供惰性环境，有效避免产物氧化，不会使石斛碱有效组分变性，有效的保证了提取得到的生物碱的品质和活性；本发明采用加热浸渍与微波辅助提取铁皮石斛中的石斛多糖，浸渍经蒸发浓缩后再经过醇沉得到石斛多糖粗品，可以减少醇沉过程中的无水乙醇用量，减产生产成本；本发明醇沉得到的石斛多糖粗品经过蛋白酶处理和活性炭吸附可以除去石斛多糖中的蛋白质和色素，提高了石斛多糖的纯度，且工艺方法简单使用，生产成本低。本发明铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，实现对铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的分步提取，石斛多糖和石斛碱提取率高，得到的石斛多糖和石斛碱纯度高，提高了铁皮石斛的经济价值。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所用铁皮石斛为两年生铁皮石斛，经测定该铁皮石斛总石斛多糖含量为26.84％，总石斛碱含量为0.027％。
实施例1
一种铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，包括以下步骤：
(1)将100kg石斛洗净后置于50℃恒温干燥箱中干燥5h，然后将石斛粉碎过60目筛；
(2)将石斛粉末放入萃取釜中，进行超临界co2萃取，萃取温度50℃，萃取压力22mpa，萃取时间为5min，再将萃取后的萃取液经过分离釜分离出co2，分离釜的温度为35℃，压力为116mpa，时间为3min，得到提取液a；
(3)将提取液a用水和氯仿按体积比1：4混合的萃取液进行萃取，充分混合后于6℃静置12h，取氯仿层，将氯仿层溶液进行减压浓缩、干燥，得石斛碱0.0241kg；
(4)向经过步骤(2)萃取后的石斛渣中加入20倍质量的蒸馏水，40khz超声处理15min，65℃水浴处3h，然后置于离心机中离心分离，收集上清液，将上清液蒸发浓缩8倍得到提取液b；
(5)向提取液b中加入3倍体积的无水乙醇，充分混合后于6℃静置沉淀10h，醇沉液抽滤后保留沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀溶于相同质量的蒸馏水中，5wt％的氢氧化钠溶液调节溶液ph至8-9，然后向溶液加入酶活性为180u/mg蛋白酶进行酶解处理，加入蛋白酶的量为0.1g/l，酶解温度为37℃，酶解时间为30min，再向酶解处理后的溶液中加入4倍体积的5wt％三氯乙酸溶液，充分混合后后于6℃静置沉淀10h，过滤收集滤液；
(7)向步骤(6)所得滤液中加入占滤液总质量的1％活性炭，静置1h过滤收集滤液，将滤液进行冷冻，使滤液冻结成干块，使用冷冻干燥机对冷冻后的滤液干块干燥后得到石斛多糖24.96kg。
石斛碱提取率为88.9％，石斛多糖提取率为93％。
实施例2
一种铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，包括以下步骤：
(1)将100kg石斛洗净后置于55℃恒温干燥箱中干燥4h，然后将石斛粉碎过55目筛；
(2)将石斛粉末放入萃取釜中，进行超临界co2萃取，萃取温度45℃，萃取压力25mpa，萃取时间为8min，再将萃取后的萃取液经过分离釜分离出co2，分离釜的温度为36℃，压力为18mpa，时间为5min，得到提取液a；
(3)将提取液a用水和氯仿按体积比1：2混合的萃取液进行萃取，充分混合后于4℃静置10h，取氯仿层，将氯仿层溶液进行减压浓缩、干燥，得石斛碱0.0236kg；
(4)向经过步骤(2)萃取后的石斛渣中加入230倍质量的蒸馏水，50khz超声处理10min，70℃水浴处理5h，然后置于离心机中离心分离，收集上清液，将上清液蒸发浓缩10倍得到提取液b；
(5)向提取液b中加入3倍体积的无水乙醇，充分混合后于4℃静置沉淀8h，醇沉液抽滤后保留沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀溶于相同质量的蒸馏水中，5wt％的氢氧化钠溶液调节溶液ph至8-9，然后向溶液加入酶活性为200u/mg蛋白酶进行酶解处理，加入蛋白酶的量为0.08g/l，酶解温度为36℃，酶解时间为30min，再向酶解处理后的溶液中加入4倍体积的5wt％三氯乙酸溶液，充分混合后后于4℃静置沉淀8h，过滤收集滤液；
(7)向步骤(6)所得滤液中加入占滤液总质量的2％活性炭，静置2h过滤收集滤液，将滤液进行冷冻，使滤液冻结成干块，使用冷冻干燥机对冷冻后的滤液干块干燥后得到石斛多糖24.56kg。
石斛碱提取率为87.4％，石斛多糖提取率为91.5％。
实施例3
一种铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，包括以下步骤：
(1)将100kg石斛洗净后置于50℃恒温干燥箱中干燥5h，然后将石斛粉碎过50目筛；
(2)将石斛粉末放入萃取釜中，进行超临界co2萃取，萃取温度55℃，萃取压力20mpa，萃取时间为5min，再将萃取后的萃取液经过分离釜分离出co2，分离釜的温度为35℃，压力为15mpa，时间为3min，得到提取液a；
(3)将提取液a用水和氯仿按体积比1：3混合的萃取液进行萃取，充分混合后于6℃静置12h，取氯仿层，将氯仿层溶液进行减压浓缩、干燥，得石斛碱0.0237kg；
(4)向经过步骤(2)萃取后的石斛渣中加入25倍质量的蒸馏水，45khz超声处理10min，80℃水浴处理3h，然后置于离心机中离心分离，收集上清液，将上清液蒸发浓缩10倍得到提取液b；
(5)向提取液b中加入4倍体积的无水乙醇，充分混合后于6℃静置沉淀10h，醇沉液抽滤后保留沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀溶于相同质量的蒸馏水中，5wt％的氢氧化钠溶液调节溶液ph至8-9，然后向溶液加入酶活性为150u/mg蛋白酶进行酶解处理，加入蛋白酶的量为0.09g/l，酶解温度为37℃，酶解时间为50min，再向酶解处理后的溶液中加入4倍体积的5wt％三氯乙酸溶液，充分混合后后于6℃静置沉淀10h，过滤收集滤液；
(7)向步骤(6)所得滤液中加入占滤液总质量的1％活性炭，静置1-2h过滤收集滤液，将滤液进行冷冻，使滤液冻结成干块，使用冷冻干燥机对冷冻后的滤液干块干燥后得到石斛多糖24.69kg。
石斛碱提取率为87.8％，石斛多糖提取率为92％。
实施例4
一种铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，包括以下步骤：
(1)将100kg石斛洗净后置于50℃恒温干燥箱中干燥4h，然后将石斛粉碎过60目筛；
(2)将石斛粉末放入萃取釜中，进行超临界co2萃取，萃取温度55℃，萃取压力25mpa，萃取时间为8min，再将萃取后的萃取液经过分离釜分离出co2，分离釜的温度为36℃，压力为15mpa，时间为3min，得到提取液a；
(3)将提取液a用水和氯仿按体积比1：4混合的萃取液进行萃取，充分混合后于4℃静置10h，取氯仿层，将氯仿层溶液进行减压浓缩、干燥，得石斛碱0.0239kg；
(4)向经过步骤(2)萃取后的石斛渣中加入20倍质量的蒸馏水，50khz超声处理20min，75℃水浴处理2h，然后置于离心机中离心分离，收集上清液，将上清液蒸发浓缩8倍得到提取液b；
(5)向提取液b中加入3倍体积的无水乙醇，充分混合后于4℃静置沉淀8h，醇沉液抽滤后保留沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀溶于相同质量的蒸馏水中，5wt％的氢氧化钠溶液调节溶液ph至8-9，然后向溶液加入酶活性为150u/mg蛋白酶进行酶解处理，加入蛋白酶的量为0.08g/l，酶解温度为37℃，酶解时间为60min，再向酶解处理后的溶液中加入3倍体积的5wt％三氯乙酸溶液，充分混合后后于6℃静置沉淀8h，过滤收集滤液；
(7)向步骤(6)所得滤液中加入占滤液总质量的1％活性炭，静置1-2h过滤收集滤液，将滤液进行冷冻，使滤液冻结成干块，使用冷冻干燥机对冷冻后的滤液干块干燥后得到石斛多糖24.9kg。
石斛碱提取率为88.5％，石斛多糖提取率为92.8％。
实施例5
一种铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，包括以下步骤：
(1)将100kg石斛洗净后置于60℃恒温干燥箱中干燥5h，然后将石斛粉碎过50目筛；
(2)将石斛粉末放入萃取釜中，进行超临界co2萃取，萃取温度50℃，萃取压力24mpa，萃取时间为5-8min，再将萃取后的萃取液经过分离釜分离出co2，分离釜的温度为36℃，压力为15mpa，时间为5min，得到提取液a；
(3)将提取液a用水和氯仿按体积比1：2混合的萃取液进行萃取，充分混合后于4℃静置10h，取氯仿层，将氯仿层溶液进行减压浓缩、干燥，得石斛碱0.0238kg；
(4)向经过步骤(2)萃取后的石斛渣中加入20倍质量的蒸馏水，50khz超声处理10min，60℃水浴处理2h，然后置于离心机中离心分离，收集上清液，将上清液蒸发浓缩8倍得到提取液b；
(5)向提取液b中加入3倍体积的无水乙醇，充分混合后于4℃静置沉淀10h，醇沉液抽滤后保留沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀溶于相同质量的蒸馏水中，5wt％的氢氧化钠溶液调节溶液ph至8-9，然后向溶液加入酶活性为180u/mg蛋白酶进行酶解处理，加入蛋白酶的量为0.08g/l，酶解温度为37℃，酶解时间为40min，再向酶解处理后的溶液中加入4倍体积的5wt％三氯乙酸溶液，充分混合后后于4℃静置沉淀10h，过滤收集滤液；
(7)向步骤(6)所得滤液中加入占滤液总质量的2％活性炭，静置1-2h过滤收集滤液，将滤液进行冷冻，使滤液冻结成干块，使用冷冻干燥机对冷冻后的滤液干块干燥后得到石斛多糖24.32kg。
石斛碱提取率为88.1％，石斛多糖提取率为90.6％。
实施例6
一种铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，包括以下步骤：
(1)将100kg石斛洗净后置于55℃恒温干燥箱中干燥5h，然后将石斛粉碎过60目筛；
(2)将石斛粉末放入萃取釜中，进行超临界co2萃取，萃取温度55℃，萃取压力25mpa，萃取时间为8min，再将萃取后的萃取液经过分离釜分离出co2，分离釜的温度为36℃，压力为15mpa，时间为3min，得到提取液a；
(3)将提取液a用水和氯仿按体积比1：1混合的萃取液进行萃取，充分混合后于4℃静置10h，取氯仿层，将氯仿层溶液进行减压浓缩、干燥，得石斛碱0.0236kg；
(4)向经过步骤(2)萃取后的石斛渣中加入20倍质量的蒸馏水，45khz超声处理15min，80℃水浴处理2h，然后置于离心机中离心分离，收集上清液，将上清液蒸发浓缩8倍得到提取液b；
(5)向提取液b中加入4倍体积的无水乙醇，充分混合后于4℃静置沉淀10h，醇沉液抽滤后保留沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀溶于相同质量的蒸馏水中，5wt％的氢氧化钠溶液调节溶液ph至8-9，然后向溶液加入酶活性为200u/mg蛋白酶进行酶解处理，加入蛋白酶的量为0.1g/l，酶解温度为38℃，酶解时间为60min，再向酶解处理后的溶液中加入4倍体积的5wt％三氯乙酸溶液，充分混合后后于4℃静置沉淀8h，过滤收集滤液；
(7)向步骤(6)所得滤液中加入占滤液总质量的1％活性炭，静置1-2h过滤收集滤液，将滤液进行冷冻，使滤液冻结成干块，使用冷冻干燥机对冷冻后的滤液干块干燥后得到石斛多糖24.8kg。
石斛碱提取率为87.4％，石斛多糖提取率为92.4％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
1.一种铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将石斛洗净后置于50-60℃恒温干燥箱中干燥4-5h，然后将石斛粉碎过50-60目筛；
(2)将石斛粉末放入萃取釜中，进行超临界co2萃取，再将萃取后的萃取液经过分离釜分离出co2，得到提取液a；
(3)将提取液a用水和氯仿混合的萃取液进行萃取，充分混合后于4-6℃静置10-12h，取氯仿层，将氯仿层溶液进行减压浓缩、干燥，得石斛碱；
(4)向经过步骤(2)萃取后的石斛渣中加入20-30倍质量的蒸馏水，超声处理10-20min，水浴处理2-5h，然后置于离心机中离心分离，收集上清液，将上清液蒸发浓缩得到提取液b；
(5)向提取液b中加入3-4倍体积的无水乙醇，充分混合后于4-6℃静置沉淀8-10h，醇沉液抽滤后保留沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀溶于相同质量的蒸馏水中，调节ph值，然后向溶液加入蛋白酶进行酶解处理，再向酶解处理后的溶液中加入3-4倍体积的三氯乙酸溶液，充分混合后后于4-6℃静置沉淀8-10h，过滤收集滤液；
(7)向步骤(6)所得滤液中加入活性炭，静置1-2h过滤收集滤液，将滤液进行冷冻，使滤液冻结成干块，使用冷冻干燥机对冷冻后的滤液干块干燥后得到石斛多糖。
2.根据权利要求1所述的铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，其特征在于，所述步骤(2)中超临界co2萃取的萃取条件为：萃取温度45-55℃，萃取压力20-25mpa，萃取时间为5-8min。
3.根据权利要求1所述的铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，其特征在于，所述步骤(2)中分离釜的温度为35-36℃，压力为15-18mpa，时间为3-5min。
4.根据权利要求1所述的铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，其特征在于，所述步骤(3)中萃取液水和氯仿的体积比为1：1-4。
5.根据权利要求1所述的铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，其特征在于，所述步骤(4)中超声处理的频率为40-50khz，水浴处理温度为60-80℃。
6.根据权利要求1所述的铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，其特征在于，所述步骤(4)中上清液蒸发浓缩8-10倍。
7.根据权利要求1所述的铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，其特征在于，所述步骤(6)中使用5wt％的氢氧化钠溶液调节溶液ph，ph调节至8-9。
8.根据权利要求1所述的铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，其特征在于，所述步骤(6)中蛋白酶酶活性为150-200u/mg，加入蛋白酶的量为0.08-0.1g/l，酶解温度为36-38℃，酶解时间为30-60min。
9.根据权利要求1所述的铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，其特征在于，所述步骤(6)中三氯乙酸溶液浓度为5wt％。
10.根据权利要求1所述的铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的提取工艺，其特征在于，所述步骤(7)中加入活性炭质量占滤液总质量的1-2％。
技术总结