本发明属于保健食品领域，具体涉及一种具有降血糖功效的亮菌菌丝体多糖及其制备方法和用途。
背景技术：
：近年来，人口老龄化、劳动强度下降以及饮食结构的改变，糖尿病患病人数迅速上升。据估计，目前全球糖尿病患者约有2.46亿，我国糖尿病患者约有9200万人，糖尿病已成为继高血压之后的世界第2大慢性病。目前糖尿病主要通过服药治疗和调节生活方式来控制，例如注射胰岛素及服用治疗药物等。但长期用药会导致药物不良反应，严重时还会危及生命。因此，寻找一种高效、低毒且能降低血糖的天然产物已成为大健康和保健食品领域的研究热点。随着功能食品的发展，食用菌被人们广泛关注。研究报道，自然界中的许多食用菌(蘑菇)如灵芝、灰树花、云芝、凤尾菇等都具有抗糖尿病作用，其中真菌多糖发挥关键作用。亮菌armillariellatabescens(scop.ex.fr)sing，又称假蜜环菌，因菌丝体在培养基上初生时白色，在暗处发出浅蓝色荧光，因此而得名。亮菌为伞菌目、白蘑科、杯伞属，是一种珍贵的食药用真菌，其作为传统药物，已被广泛用于治疗急慢性肝炎、阑尾炎、胆道感染、中耳炎和胆囊炎等。亮菌含有多种活性成分，如亮菌甲素、亮菌乙素和亮菌多糖等。亮菌多糖作为重要的活性组分，发现其具有抗肿瘤和免疫调节的作用。而在本发明发现的亮菌菌丝体多糖具有显著的降低血糖和改善胰岛素抵抗的活性，迄今尚未见相关文献报道。技术实现要素：本发明旨在提供一种具有降血糖功效的亮菌菌丝体多糖及其制备方法和用途。本发明研究发现亮菌菌丝体多糖具有显著的降低血糖和血脂活性，尤其是在改善胰岛素抵抗方面作用显著，具有很重要的学术价值和开发前景。本发明具有降血糖功效的亮菌菌丝体多糖，其总糖含量为86％以上，单糖组成及摩尔比为甘露糖:阿拉伯糖:岩藻糖＝1.58:1:2.74。本发明具有降血糖功效的亮菌菌丝体多糖的制备方法，包括如下步骤：步骤1：将3-5g亮菌armillariellatabescens(scop.ex.fr)sing菌种(该菌种为市购获得，购自合肥诚志生物制药有限公司)接种于300-500ml葡萄糖-土豆液体培养基(将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后，用四层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加水至1000ml，121℃灭菌20min制得葡萄糖-土豆培养基)，26℃静置培养20天，得亮菌菌丝体；步骤2：将步骤1获得的亮菌菌丝体(5000g)按照1:3-5的液料比(g/ml)加入蒸馏水，粉碎，然后80℃浸提2～3h，重复浸提2～3次，过60目筛，合并提取液；步骤3：将步骤2所得提取液浓缩至原体积的1/200-250，加入4倍体积的95vt％乙醇至乙醇终浓度为75vt％，4℃静置12h，4500rpm/min离心，收集沉淀物；步骤4：将步骤3得到的沉淀物加蒸馏水溶解，然后加入等体积的sevag试剂(正丁醇:三氯甲烷v/v＝1:4)，磁力搅拌2h后，离心取上清液；重复至蛋白质完全去除，将多糖溶液浓缩，透析(透析袋截留分子量3500)去除小分子，旋蒸浓缩至浓稠状液体，真空冷冻干燥后即可获得亮菌菌丝体多糖。本发明亮菌菌丝体多糖的用途，是在制备具有降血糖、降血脂功效的食品、保健品或药品中应用。本发明亮菌菌丝体多糖的用途，是在制备用于治疗2型糖尿病的药物中的应用，具有显著的降低血糖血脂和改善胰岛素抵抗的活性。本发明以高糖高脂饮食联合链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠为研究对象，通过动物实验证明亮菌菌丝体多糖的降血糖降血脂作用。本发明亮菌菌丝体多糖对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的指数为：模型组为(12.33±2.15)，二甲双胍(阳性对照)组为(6.26±1.00)，亮菌菌丝体多糖组为(6.77±1.05)。附图说明图1是标准单糖组成高效液相色谱图(*-溶剂峰，1-甘露糖，2-鼠李糖，3-葡萄糖，4-半乳糖，5-阿拉伯糖，6-岩藻糖)。图2是亮菌菌丝体多糖单糖组成高效液相色谱图(*-溶剂峰，1-甘露糖，5-阿拉伯糖，6-岩藻糖)。图3是亮菌菌丝体多糖对2型糖尿病小鼠糖耐量的影响(n＝8，x±s)。具体实施方式以下通过具体的实施例描述本发明的制备，降糖降脂及改善胰岛素抵抗的活性，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。实施例1：亮菌菌丝体多糖的制备1、将3-5g亮菌菌种接种于300-500ml葡萄糖-土豆液体培养基，26℃静置培养20天，得亮菌菌丝体。2、将亮菌菌丝体按照1:5的液料比加入蒸馏水，用闪式提取仪粉碎10min，然后80℃浸提3h，重复浸提3次，过60目筛，合并提取液；3、将所得提取液浓缩至原先体积的1/250，加入4倍体积的95％乙醇至乙醇终浓度为75％，4℃静置12h，4500rpm/min下离心，收集沉淀；4、将步骤3得到的沉淀加蒸馏水溶解，然后加入等体积的sevag试剂(正丁醇:三氯甲烷＝1:4)，磁力搅拌2h后，离心取上清液；重复至蛋白质完全去除，将多糖溶液浓缩，透析去除小分子，旋蒸浓缩至浓稠状液体，真空冷冻干燥后即可获得亮菌菌丝体多糖。实施例2：亮菌菌丝体多糖的总糖和单糖组成测定1、亮菌菌丝体多糖的总糖含量利用苯酚-硫酸法测定。精确吸取2ml亮菌菌丝体多糖溶液(50μg/ml)和葡萄糖标准溶液，加1ml6％苯酚和5ml浓硫酸，设置三组平行，490nm处测定吸光值，根据标准曲线的公式，计算得出亮菌菌丝体多糖的总糖含量。2、亮菌菌丝体多糖的单糖组成分析采用酸水解-柱前pmp衍生化方法处理样品，高效液相色谱法分析测定。精确称取亮菌菌丝体多糖(10mg)溶于5ml的2mol/l的三氟乙酸中，充氮气封管，在110℃烘箱中水解6h。旋转蒸发仪除去水分，加适量的去离子水，再旋转蒸干，如此反复几次至溶液ph显示中性为止。加入1ml蒸馏水，备用。标准单糖和已水解的样品溶液中加入50μl，0.5mol/lpmp甲醇溶液和50μl，0.3mol/lnaoh溶液，在70℃的水浴锅中反应30min进行pmp柱前衍生化，然后用50μl，0.3mol/lhcl中和至中性。所得产物使用高效液相色谱检测，选用dad检测器。hplc柱温为30℃，色谱柱为zorboxeclipsexdb-c18柱(4.6mm×250mm，5μm)，在波长为245nm条件下检测。检测流动相选用两种，流动相a为乙腈，流动相b为0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液。时间梯度洗脱0-50min，初始设置为流动相a：流动相b＝17％：83％，最终洗脱到比例为流动相a：流动相b＝20％：80％，进样量为10μl。实施例3：亮菌菌丝体多糖的降血糖活性测定以制备的亮菌菌丝体多糖为原料，利用2型糖尿病小鼠模型，对亮菌菌丝体多糖的降糖功效实验评价。1、糖尿病小鼠模型制备选取32只spf级雄性c57bl/6j小鼠，体重22±2g，随机分为4组，每组8只，分为空白组、模型组、阳性组，亮菌多糖组。空白组给予正常饲料，其余三组给予高糖高脂饮食(hfd)喂养。喂养4周后hfd小鼠禁食12h，分4次小剂量腹腔注射链脲佐菌素(stz)50mg/kg，建立2型糖尿病模型；造模72h后尾静脉采血测定空腹血糖，连续3天空腹血糖≥11.1mmol/l且出现多饮、多食、多尿者为模型复制成功，继续高糖高脂饮食3周，为2型糖尿病小鼠。从第9周起，空白组和模型组每天灌胃等体积生理盐水，阳性组每天灌胃200mg/kg二甲双胍，亮菌多糖组每天灌胃400mg/kg亮菌菌丝体多糖，每天1次，共灌胃4个星期。每周测定1次小鼠体重和空腹血糖，末次灌胃后各组小鼠禁食12h以上，测定口服葡萄糖耐量，采血制备血清标本。所有实验数据采用spss17.0软件进行方差分析。2、实验结果(1)由表1可见，与正常饮食组对比，4周的hfd喂养能明显增加小鼠的体重。stz注射后，模型组、阳性组和亮菌多糖组小鼠的体重均明显下降，表现出糖尿病的明显特征。从第9周开始分别给予生理盐水、二甲双胍和亮菌菌丝体多糖灌胃处理，结果显示模型组的体重仍持续下降；而阳性组和亮菌多糖组，体重虽出现下降，但有所缓解，说明亮菌菌丝体多糖有明显减轻糖尿病小鼠消瘦症状的作用。表1小鼠体重的变化(g)(n＝8，)组别0周4周8周12周空白组21.89±0.7125.10±0.8527.69±0.6429.18±0.67模型组22.00±0.8929.14±0.92**28.18±0.8525.88±0.81**阳性组22.34±0.8329.63±0.9127.36±0.8927.78±0.94##亮菌多糖组22.68±0.8830.26±0.9528.54±1.0428.24±0.88##注：与空白组相比，**p<0.01，极显著；与模型组比，##p<0.01，极显著(2)由表2可见，实验期间空白组小鼠空腹血糖值一直稳定在4～6mmol/l之间，stz注射之后，小鼠空腹血糖明显增加。经过4周干预治疗后，与模型组相比，阳性组和亮菌多糖组血糖值有明显的下降(p<0.01)。表22型糖尿小鼠空腹血糖值变化(mmol/l)(n＝8，)组别9周10周11周12周空白组4.68±1.064.95±0.984.61±1.114.84±0.94模型组18.88±1.52**19.71±1.77**20.36±1.67**20.86±1.85**阳性组19.63±1.5719.09±1.7317.94±1.46##16.46±1.47##亮菌多糖组18.74±1.5819.21±1.7618.40±1.76#17.66±1.53##注：与空白组相比，**p<0.01，极显著；与模型组比，##p<0.01，极显著；#p<0.05，显著(3)糖耐量是机体对于葡萄糖的耐受能力。与空白组比较，模型组小鼠口服葡萄糖耐量出现异常，30min时血糖升高以致达到检测上限，且在120min内下降缓慢。与模型组比较，阳性组和亮菌多糖组30min时达到峰值，随后缓慢下降，总体下降趋势明显(图3)。结果表明：亮菌菌丝体多糖对2型糖尿病小鼠口服糖耐量损伤有一定的改善作用。(4)由表3可见，与空白组比较，模型组小鼠血清中胰岛素(ins)和胰岛素抵抗指数(homa-ir)显著上升(p<0.01)，说明糖尿病小鼠胰岛素抵抗现象明显。与模型组相比，阳性组和亮菌多糖组均不同程度的降低糖尿病小鼠的胰岛素抵抗(p<0.01)。表3亮菌菌丝体多糖对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响(n＝8，)组别ins(miu/l)homa-ir空白组5.84±1.321.24±0.49模型组12.57±1.70**12.33±2.15**阳性组9.02±1.43##6.26±1.00##亮菌多糖组8.85±1.27##6.77±1.05##注：与空白组相比，**p<0.01，极显著；与模型组比，##p<0.01，极显著(5)血清中总甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)含量是高血脂症的重要检测指标。表4结果显示，与空白组比较，模型组小鼠tg、tc、ldl-c等指标均显著增加(p<0.01)，hdl-c显著下降(p<0.01)；与模型组比较，阳性组和亮菌多糖组小鼠tg、tc和ldl-c均明显下降(p<0.05或p<0.01)，hdl-c明显升高(p<0.01)。结果表明：hfd联合stz可以引起小鼠的血脂出现明显异常，亮菌菌丝体多糖对2型糖尿病小鼠的血脂水平有明显改善作用。表4亮菌菌丝体多糖对2型糖尿病小鼠血脂的影响(n＝8，)注：与空白组相比，**p<0.01，极显著；与模型组比，##p<0.01，极显著；#p<0.05，显著以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种具有降血糖功效的亮菌菌丝体多糖，其特征在于：
所述亮菌菌丝体多糖的总糖含量为86％以上，单糖组成及摩尔比为甘露糖:阿拉伯糖:岩藻糖＝1.58:1:2.74。
2.一种权利要求1所述的亮菌菌丝体多糖的用途，其特征在于：是在制备用于治疗2型糖尿病的药物中的应用，具有显著的降低血糖血脂和改善胰岛素抵抗的活性。
技术总结本发明公开了一种具有降血糖功效的亮菌菌丝体多糖，其中亮菌菌丝体多糖的总糖含量为86％以上，单糖组成及摩尔比为甘露糖:阿拉伯糖:岩藻糖＝1.58:1:2.74。本发明亮菌菌丝体多糖具有降低2型糖尿病小鼠的血糖和血脂的活性，尤其是在改善胰岛素抵抗方面作用显著，可作为新型天然的降血糖活性物质，广泛应用于保健食品和医药领域。
技术研发人员：陈彦;杨锐;王亚;李杨丹
受保护的技术使用者：安徽大学
技术研发日：2020.01.21
技术公布日：2020.06.09
