本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备。
背景技术：
禽白血病(avianleucosis)是由反转录病毒科(retroviridae)禽白血病/肉瘤病毒群(avianleukosis/sarcomavirus,alv)引起的以造血细胞恶性增生为主的多种肿瘤性疾病的总称。根据alv病毒粒子特点，病毒粒子中有30-35％脂类，且主要是以脂质膜形式存在于病毒外层。自1908年首次报道并分离到alv以来，已在世界上许多国家流行和发生，给养殖业造成巨大的经济损失。目前，仍没有合适的药物和疫苗来预防和治疗alv的发生和流行，主要通过检疫净化、淘汰阳性鸡，建立无alv的种禽群等手段来预防。因此，迫切需要寻找天然无毒的新型药物来治疗或抵抗alv。
褐藻多糖是从大型褐藻中提取获得，来源广泛，储存量大，近年来研究者证实其具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血等多种生物活性。有研究表明，褐藻多糖具有抗禽白血病病毒效果，但其抗病毒效果并不理想，且仅在禽白血病病毒吸附宿主细胞阶段起作用，在病毒繁殖阶段没有抗病毒效果。因此，提高其抗病毒活性将具有重大的研究意义与应用价值。
技术实现要素：
本发明针对以上问题，提供了一种褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法及应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法，将褐藻多糖经溶剂溶解，加入催化剂4-二甲氨基吡啶，随后逐滴加入脂肪酰氯，产物经纯化后溶于蒸馏水，透析得褐藻多糖衍生物，将衍生物经溶剂溶解后透析、冻干，即得到褐藻多糖衍生物纳米胶束；其中，褐藻多糖与溶剂的质量体积比为1:4-1:8，优选为1:5-1:7；褐藻多糖糖单元与4-二甲氨基吡啶和脂肪酰氯摩尔比均为1:2:1-1:2:4，优选为1:2:2-1:2:3。
所述脂肪酰氯为月桂酰氯、肉豆蔻酰氯或棕榈酰氯，优选为肉豆蔻酰氯或棕榈酰氯。
所述体系内滴加月桂酰氯、肉豆蔻酰氯或棕榈酰氯后在80-90℃、氮气保护下搅拌反应12h-24h。
所述溶剂为甲酰胺或二甲基亚砜，优选为甲酰胺。
所述体系中滴加脂肪酰氯后产物用乙醇醇沉，收集产物经水反复洗涤，洗涤后溶于蒸馏水，经500-1000da透析袋透析48h-72h，而后于-70℃下冷冻干燥，即得褐藻多糖衍生物。将所得衍生物经溶剂溶解后，装入500-1000da透析袋，在蒸馏水中透析48h-72h，而后于-70℃下冻干得褐藻多糖衍生物纳米胶束。
所述褐藻多糖是从大型褐藻中提取的粗多糖，再通过降解获得平均分子量为2kda-20kda褐藻多糖，优选为8kda-12kda；其中，褐藻为大型海洋褐藻为海带、裙带菜、马尾藻或羊栖菜。
所述褐藻多糖衍生物纳米胶束平均粒径为150-250nm，zeta电位为-35mv至-45mv，外观呈光滑球型，分散且均一。
所述方法获得褐藻多糖衍生物纳米胶束在作为抗病毒制剂中的应用。
所述病毒为禽白血病病毒；如a亚群、b亚群和j亚群禽白血病病毒。
优选，所述方法获得褐藻多糖衍生物纳米胶束在制备抗禽白血病病毒吸附宿主细胞阶段或繁殖阶段的抗病毒制剂中的应用。
本发明的优点
1.本发明涉及的褐藻多糖来自天然大型褐藻，资源丰富，天然无毒，利用其获得褐藻多糖衍生物，而后通过透析法自组装制得制备纳米胶束，所制备的胶束呈光滑球型，粒径均一，zeta电位低分散性好，细胞毒性低。
2.本发明针对褐藻多糖中的岩藻糖糖环上羟基空间位阻大、难以反应的特点，以惰性有机试剂甲酰胺作为溶剂，以高催化效率的4-二甲氨基吡啶作催化剂，将长链脂肪酰氯与褐藻多糖反应，进而获得褐藻多糖长链脂肪酸衍生物纳米胶束，通过胶束亲脂性部分与病毒脂质膜间的相互作用而起到一定的抗病毒效果。
3体外细胞实验证明，本发明所得褐藻多糖衍生物纳米胶束能够显著抑制禽白血病病毒的增殖能力，具有明显的抗病毒效果，可作为一种新型抗病毒制剂应用到畜禽养殖中，具有很高的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的褐藻多糖红外光谱图，其红外特征吸收峰(cm-1)：3356，2931，1608，1417，1219，1028，823。
图2为本发明实施例提供的褐藻多糖月桂酸衍生物红外光谱图，其红外特征吸收峰(cm-1)：3362，2925，2855，1614，1419，1219，1030，822。
图3为本发明实施例提供的褐藻多糖肉豆蔻酸衍生物红外光谱图，其红外特征吸收峰(cm-1)：3370，2925，2855，1620，1417，1216，1030，822。
图4为本发明实施例提供的褐藻多糖棕榈酸衍生物红外光谱图，其红外特征吸收峰(cm-1)：3353，2918，2850，1613，1421，1219，1031，821。
图5为本发明实施例提供的褐藻多糖月桂酸衍生物纳米胶束扫描电镜观察图。
图6为本发明实施例提供的褐藻多糖肉豆蔻酸衍生物纳米胶束扫描电镜观察图。
图7为本发明实施例提供的褐藻多糖棕榈酸衍生物纳米胶束扫描电镜观察图。
图8为本发明实施例提供的褐藻多糖衍生物纳米胶束体外抗alv病毒p27抗原表达量图。其中“*”表示和对照间存在显著差异(p<0.05，以下同)。
图9为本发明实施例提供的褐藻多糖衍生物纳米胶束体外抗alv病毒alv基因相对表达量图。
图10本发明实施例提供的褐藻多糖衍生物纳米胶束对alv预防作用图。
图11本发明实施例提供的褐藻多糖衍生物纳米胶束对alv吸附抑制作用图。
图12本发明实施例提供的褐藻多糖衍生物纳米胶束对alv治疗作用图。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1褐藻多糖的提取：
将羊栖菜洗净、50℃烘干至恒重，破碎，以料液比1：10(质量(g)体积比(ml))，将褐藻粉末与95％乙醇混合(100g粉末加1l95％乙醇)，80℃恒温水浴冷凝回流2h，抽滤分离上清，沉淀重复回流一次，充分脱脂脱色素。沉淀干燥以后以料液比1：30(质量(g)体积比(ml))加入蒸馏水，于80℃水浴中浸提4小时；分别用100目，200目和300目筛绢将滤渣滤出，滤液加入cacl2至0.2m老化10min以上，离心去除沉淀，滤液透析除盐后用减压浓缩设备浓缩为原体积的1/10，而后加入浓缩液3倍体积的无水乙醇醇沉24小时，12000rpm离心，沉淀冻干，即得褐藻粗多糖。
将褐藻粗多糖溶于水，配成2％的水溶液，加入30％的过氧化氢溶液使过氧化氢终浓度为1.5％，调节ph值至4，在90℃的条件下水浴加热，搅拌降解90min，反应后待溶液冷却至室温，中和至中性，经透析、浓缩、冷冻干燥可得平均分子量在9kda的褐藻多糖，记为sfp。
实施例2褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备：
将0.5g上述获得褐藻多糖溶于30ml甲酰胺，加入0.83g4-二甲氨基吡啶后，逐滴加入1.38ml月桂酰氯(大约15min之内滴加完毕)，在90℃下氮气保护反应12h。产物中加入其3倍体积的无水乙醇醇沉，12000rpm离心5min，沉淀用无水乙醇洗涤两遍后溶于水，用500-1000da透析袋透析48h，进而去除未完全反应的溶剂和盐等，而后在-70℃下冻干，既得褐藻多糖月桂酸衍生物，记为sfp-c12。红外光谱表明，sfp-c12的红外谱图(图2)与sfp的红外谱图(图1)相比，出现了2855cm-1的-ch2-吸收峰，且1614cm-1的-c＝o吸收峰变宽，为月桂酸中的亚甲基峰与羰基峰，证明衍生物合成成功。
取10mg上述制备获得褐藻多糖月桂酸衍生物溶于10ml甲酰胺配成1mg/ml溶液，用500-1000da透析袋在水中透析48h，使衍生物在溶剂的作用下通过自组装作用获得纳米胶束，而后在-70℃下冻干，即得褐藻多糖月桂酸衍生物纳米胶束，记为sfp-c12m，其观形貌使用扫描电镜观察，结果见图5。sfp-c12m外观呈球形，形状均一，证明胶束制备成功。
实施例3褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备
将0.5g上述获得褐藻多糖溶于30ml甲酰胺，加入0.83g4-二甲氨基吡啶后，逐滴加入1.58ml肉豆蔻酰氯，在90℃下氮气保护反应12h。产物中加入其3倍体积无水乙醇醇沉，12000rpm离心5min，沉淀用无水乙醇洗涤两遍后溶于水，用500-1000da透析袋透析48h后在-70℃下冻干，既得褐藻多糖肉豆蔻酸衍生物，记为sfp-c14。红外光谱表明，sfp-c14的红外谱图(图3)与sfp的红外谱图(图1)相比，出现了2855cm-1的-ch2-吸收峰，且1620cm-1的-c＝o吸收峰变宽，为肉豆蔻酸中的亚甲基峰与羰基峰，证明衍生物合成成功。
取10mg上述制备获得褐藻多糖肉豆蔻酸衍生物溶于10ml甲酰胺配成1mg/ml溶液，用500-1000da透析袋在水中透析48h后在-70℃下冻干，既得褐藻多糖肉豆蔻酸衍生物纳米胶束，记为sfp-c14m，其外观形貌使用扫描电镜观察，结果见图6。sfp-c14m外观呈球形，形状均一，证明胶束制备成功。
实施例4褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备
将0.5g上述制备获得褐藻多糖溶于30ml甲酰胺，加入0.83g4-二甲氨基吡啶后，逐滴加入1.67ml棕榈酰氯，在90℃下氮气保护反应12h。产物中加入其3体积倍无水乙醇醇沉，12000rpm离心5min，沉淀用无水乙醇洗涤两遍后溶于水，用500-1000da透析袋透析48h后在-70℃下冻干，既得褐藻多糖棕榈酸衍生物，记为sfp-c16。红外光谱表明，sfp-c14的红外谱图(图4)与sfp的红外谱图(图1)相比，出现了2850cm-1的-ch2-吸收峰，且1613cm-1的-c＝o吸收峰变宽，为棕榈酸中的亚甲基峰与羰基峰，证明衍生物合成成功。
取10mg上述制备获得褐藻多糖棕榈酸衍生物溶于10ml甲酰胺配成1mg/ml溶液，用500-1000da透析袋在水中透析48h后在-70℃下冻干，既得褐藻多糖棕榈酸衍生物纳米胶束，记为sfp-c16m，其外观形貌使用扫描电镜观察，结果见图7。sfp-c16m外观呈球形，形状均一，证明胶束制备成功。
对上述实施例2-4获得褐藻多糖衍生物纳米胶束的粒径、zeta电位和多分散系数使用粒度分析仪检测，结果见表1。三种纳米胶束粒径在200nm左右，多分散系数低，粒度均匀，胶束电位低，分散性好。
表1褐藻多糖衍生物纳米胶束粒径、多分散系数及zeta电位
实施例5体外抗禽白血病病毒实验：
试剂配制说明：
细胞生长液：10ml胎牛血清加入90mldmem培养基。
细胞维持液：2ml胎牛血清加入98mldmem培养基。
cellcountingkit-8(cck-8)：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐。
1)细胞毒实验
鸡胚成纤维细胞(df-1)平铺于96孔板上，在细胞生长液中生长至单层后，弃掉培养液，用pbs洗三遍，每孔加入用细胞维持液配制的、浓度分别为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/ml的各样品溶液(即，各样品溶液为sfp-c12、sfp-c14、sfp-c16、sfp-c12m、sfp-c14m、sfp-c16m)100μl，每个浓度三个重复，同时设置细胞对照组(单层细胞加入100μl细胞维持液)和空白对照组(空白孔中加入100μl细胞维持液)，维持24h。24h后将其中培养基弃掉，用pbs清洗3遍，加入100μl细胞维持液，以及10μlcck-8溶液，静置3h，在450nm波长下检测吸光度。细胞活性(a)用以下公式计算：a＝(a样品-a空白)/(a细胞-a空白)(参见表2)。
表2细胞相对活性表
由表2结果表明所有褐藻多糖衍生物及其纳米胶束在0.5mg/ml时的细胞活性均大于95％，因此在0.5mg/ml以下浓度均为安全浓度。
2)alvp27抗原检测
鸡胚成纤维细胞(df-1)平铺于96孔板上，在细胞生长液中生长至单层后，弃掉培养液，用pbs清洗三遍，接种100μlalv病毒液，同时加入100μl用细胞维持液配制的各样品溶液(即，各样品溶液为sfp、sfp-c12、sfp-c14、sfp-c16、sfp-c12m、sfp-c14m、sfp-c16m)，使样品溶液与病毒液混合后的终浓度为0.5mg/ml，置于37℃下孵育2h后弃掉混合液，用pbs洗三遍，再加入浓度为0.5mg/ml的样品溶液100微升，每个样品三个重复，同时设置细胞对照、病毒对照组，维持48h后采用idexx禽白血病p27抗原elisa检测试剂盒检测上清中的p27抗原表达量，检测波长650nm，最后按照公式s/p＝(a样品-a阴性对照)/(a阳性对照-a阴性对照)计算s/p值，阴性对照和阳性对照为试剂盒中自带对照样品，并规定当s/p值大于0.2时判定为阳性。结果如图8显示，所有样品均对alv有非常明显的抑制作用。病毒对照s/p值达到0.258，抗原水平较高，所有样品处理组结果均在0.2以下，显示为阴性，且显著低于病毒对照组。
3)荧光定量pcr测病毒相对表达量
df-1细胞接种于12孔板上生长至单层后接种100μlalv病毒，同时加入100μl用细胞维持液配成的各种样品溶液(即，各样品溶液为sfp、sfp-c12、sfp-c14、sfp-c16、sfp-c12m、sfp-c14m、sfp-c16m)，使混合液中的样品终浓度为200液中的样品，在37℃下孵育2h，弃掉混合液，用pbs清洗三遍，加入100遍，维持液配制的200遍，加入用的各样品溶液，在37℃、5％co2培养箱维持48h，细胞用pbs清洗三遍后提取rna，经反转录后通过荧光定量pcr检测alv表达量(参见图9)。结果表明，病毒对照alv基因相对表达量到达15417.52，sfp处理组的alv基因相对表达量为5780.108，sfp-c12、sfp-c14和sfp-c16的结果均低于5000，显著低于病毒对照，同时，sfp-c14m和sfp-c16m处理组的alv病毒表达量分别为2858.225和2416.192，低于sfp-c14(4368.369)和sfp-c16(4399.448)，具有较好的抗病毒效果。上述实验结果表明，褐藻多糖衍生物及其纳米胶束可以从rna水平抑制alv的相对表达量，同时纳米胶束明显优于褐藻多糖衍生物，并且纳米胶束中sfp-c16m的效果最好。
4)作用机理检测
将df-1细胞接种于96孔板上，在37℃、5％co2条件下长成单层后，选取测定上述抗病毒效果最好的sfp-c16m对病毒的预防作用、阻止病毒吸附作用以及治疗作用，同时sfp作为对照。
预防作用：将sfp和sfp-c16m溶于细胞维持液中配成0.2mg/ml，分别加100μl到长成单层的df-1细胞上，37℃作用2h，弃掉药液，用pbs清洗三遍，接种100μlalv病毒液，37℃孵育2h，弃掉病毒液，用pbs清洗三遍，加入100μl细胞维持液在37℃、5％co2培养箱维持24h，同时设置细胞对照组和病毒对照组，用idexx禽白血病p27抗原elisa检测试剂盒检测上清中的p27抗原表达量(参见图10)。由图可知，sfp和sfp-c16m对病毒没有抑制作用，先给药后接毒的方式不能实现其抗病毒效果。
阻止病毒吸附作用：分别将100μl用细胞维持液配制的sfp和sfp-c16m溶液加入到生长至单层的df-1细胞上，同时接种100μl病毒液，使药液与病毒液混合后终浓度达到0.2mg/ml，置于4℃下作用2h。之后弃掉混合液，用pbs清洗三遍，加入100μl细胞维持液在37℃、5％co2培养箱维持24h，同时设置细胞对照组和病毒对照组。用p27抗原elisa检测试剂盒检测p27抗原(参见图11)。结果表明，sfp和sfp-c16m能显著抑制alv对df-1细胞的吸附。
治疗作用：接种100μl病毒液于生长至单层的df-1细胞上，37℃孵育2h后弃掉毒液，用pbs清洗三次，分别加入用维持液配制的0.2mg/mlsfp和sfp-c16m溶液100μl，在37℃、5％co2培养箱维持24h，同时设置细胞对照组和病毒对照组。用p27抗原elisa检测试剂盒检测p27抗原(参见图12)。结果显示，sfp处理组与病毒对照组间没有显著差异，sfp-c16m处理组s/p值为0.235，显著低于病毒对照组(s/p值为0.309)，说明sfp-c16m在病毒繁殖阶段对alv也具有一定抑制效果。
由上述对病毒的预防作用、阻止病毒吸附作用以及治疗作用可见，相比于褐藻多糖仅在病毒吸附宿主细胞阶段起作用，褐藻多糖纳米胶束在病毒繁殖阶段也具有一定抑制效果，具有一定的治疗作用，这说明褐藻多糖纳米胶束出现了新的抗alv机制，同时褐藻多糖纳米胶束总体抗病毒效果显著优于褐藻多糖。
1.一种褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法，其特征在于：将褐藻多糖经溶剂溶解，加入催化剂4-二甲氨基吡啶，随后逐滴加入脂肪酰氯，产物经纯化后溶于蒸馏水，透析得褐藻多糖衍生物，将衍生物经溶剂溶解后透析、冻干，即得到褐藻多糖衍生物纳米胶束；其中，褐藻多糖与溶剂的质量体积比为1:4-1:8；褐藻多糖糖单元与4-二甲氨基吡啶和脂肪酰氯摩尔比均为1:2:1-1:2:4。
2.按权利要求1所述的褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述脂肪酰氯为月桂酰氯、肉豆蔻酰氯或棕榈酰氯。
3.按权利要求1或2所述的褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述体系内滴加月桂酰氯、肉豆蔻酰氯或棕榈酰氯后在80-90℃、氮气保护下搅拌反应12h-24h。
4.按权利要求1所述的褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述溶剂为甲酰胺或二甲亚砜。
5.按权利要求1所述的褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述体系中滴加脂肪酰氯后产物用乙醇醇沉，收集产物经水反复洗涤，洗涤后溶于蒸馏水，经500-1000da透析袋透析48h-72h，而后冷冻干燥，即得褐藻多糖衍生物；将所得衍生物经溶剂溶解后，装入500-1000da透析袋，在蒸馏水中透析48h-72h，而后冻干得褐藻多糖衍生物纳米胶束。
6.按权利要求1或5所述的褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述褐藻多糖是从大型褐藻中提取的粗多糖，再通过降解获得平均分子量为2kda-20kda褐藻多糖；其中，褐藻为大型海洋褐藻为海带、裙带菜、马尾藻或羊栖菜。
7.按权利要求1所述的褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述褐藻多糖衍生物纳米胶束平均粒径为150-250nm，zeta电位为-35mv至-45mv，外观呈光滑球型，分散且均一。
8.按权利要求1或7所述的褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述方法获得褐藻多糖衍生物纳米胶束在作为抗病毒制剂中的应用。
9.按权利要求8所述的褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述病毒为禽白血病病毒。
技术总结