本发明属于生物医学领域，涉及生物高分子水凝胶的制备及其在体内/外细胞培养中的应用，具体涉及一种用于细胞三维培养的葡聚糖-透明质酸水凝胶的制备方法及其应用。
背景技术：
目前，大部分的细胞培养研究都在二维表面进行，如微孔板、组织培养瓶、培养皿等，使用二维培养的特点是简单、高效、快捷、细胞存活率高。在二维培养体系中，贴壁细胞在固体培养板表面贴壁呈单层生长，以低于50％的表面积与培养板底面接触，而其余的表面积与液态培养基接触，仅有很少部分与其他细胞或基质接触；缺乏体内微环境下细胞-细胞间、细胞-细胞外基质间的动态相互作用，不能准确反映体内细胞真实的生长情况。
在体内，几乎所有的组织细胞都生活在细胞外基质(extracellularmatrix,ecm)中，这些ecm包括了许多复杂的三维纤维网络，可以提供复杂的生物及物理信号。但传统的二维细胞培养所提供的环境不同于体内细胞生长的环境，难以用其去模拟真实体内生理组织中细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。细胞三维培养技术很好地弥补了这些缺点，三维培养条件下的细胞几乎100％的表面积都与其他细胞或基质接触，所培养的细胞具有特征性的生物信号转导，可以影响细胞增殖、黏附、迁移和基因表达等功能。
根据最新研究，在二维培养和三维培养的不同条件下，许多细胞生物学行为将产生重大的变化，包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、基因表达和药物代谢方面。三维细胞培养所使用的基质，克服了传统二维培养的限制，这些基质往往都是多孔结构，可以支持细胞在体外以更接近体内真实环境下进行生长、繁殖和分化。
细胞三维培养方法通过使用生物材料构建类似体内组织支架或基质能够模拟体内细胞生长的微环境，建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，不但为细胞提供生长微环境所需的基质分泌及细胞功能活动等物质结构基础，又实现了细胞培养的直观性及条件可控性，有效补充了细胞二维培养方法的不足，更便于细胞在生理和病理状况下生长增殖、信号转导等分子机理研究。
细胞三维培养材料设计的最终目标是在体外的环境下充分模拟体内的细胞外基质环境。细胞外基质由组织细胞产生并分泌到组织液中的多种物质组成，其主要成分有连接蛋白(纤维连接蛋白)、纤维成分(如弹性蛋白、胶原和明胶)，以及种种填充分子(如糖胺聚糖)。这些特定的结构和成分可以提供与众不同的生化功能，如促进营养物质、信号分子以及细胞代谢所废物的运输，并可提供维持体内结构的机械性能。细胞外基质和细胞之间的作用往往是是相互的且处在动态环境下，细胞外基质可以促进细胞向特定的方向进行分化，细胞也会反过来影响细胞外基质中的环境，通过合成和降解细胞外基质的主要成分来改变细胞所处的生存环境。
三维细胞培养基质结构需具备一定的尺度结构，这一点对于模仿真实的生物体内环境非常重要，因为在自然环境下进化出的性质往往是多尺度、多层次的结构。通常情况下，我们规定三维细胞培养基质有三种尺度，包括宏观尺度(10-1～10-3m)、微观尺度(10-3～10-6m)以及纳米尺度(10-6～10-9m)。宏观尺度的结构将会改变基质的基础外观特性，包括其大小和形状，对于在体外进行的三维细胞培养研究，形状以及大小决定了其实用性和功能性。微观尺度上的结构构造被证明可以显著改变三维细胞培养时的物质能量运输的通畅程度。并且该尺度上的可控性对于能否真实模拟体内微组织结构具有重要的影响，例如广泛存在于细胞外基质中的多细胞空间结构。微观尺度的结构在真实环境中的基本的设计参数如孔隙的连通性、孔隙度、几何大小形状以及孔隙的表面形貌往往是共通的，这就给我们在体外进三维细胞培养提供了便利。此外，微观尺度的不同表面特性可以影响激活特定基因的表达，从而影响细胞的增殖和分化。同样，纳米尺度结构对于体外进行细胞三维培养也具有重要意义，因为细胞和细胞外基质之间通过纳米尺度的蛋白质进行物质能量信息的交换，进而调解各种胞内的活动来改变细胞外基质环境。多数细胞外基质常见的大分子都是纳米级别的。例如胶原纤维的直径通常在50～200nm之间，连接纤维蛋白的直径在60～70nm之间，厚度为3nm。除了影响微量营养的供给，纳米尺度的结构特点同样决定了对细胞的表面形貌。因为许多决定细胞表面形貌的细胞信号机制均会涉及到纳米尺度的分子，纳米尺度的表面结构已经被证实可以显著影响细胞黏附、组织形态和分化。
生物支架材料包括天然支架材料和人工合成支架材料。天然支架材料伸展性较差，固有的可溶性成分导致其较不稳定，实验难以标准化。目前已有很多生物材料用于生物医学领域，如壳聚糖、海藻酸钠、胶原蛋白、明胶等等。根据用途，可以对材料进行改性修饰，以达到应用的性能和要求。其中，在三维贴壁细胞培养中，现已报道了多种生物材料，但达到血液相容性、可调节支架空隙、实现动物体内或体外三维培养的良好性能水凝胶，仍需要探索。我们合成的葡聚糖-透明质酸三维多孔支架材料具有良好的可伸展性，物理机械性能较清楚，可根据实验需要的结构形状进行标准化生产，还能通过调节支架空隙大小和密度来控制细胞球的大小，可以实现动物体内或体外三维贴壁细胞培养的要求。
技术实现要素：
本发明的目的是：合成一种葡聚糖-透明质酸水凝胶，为体内外细胞三维培养提供支架和无毒性易生长环境，更好的模拟生物体内环境。
本发明采用的技术方案是：
一种用于细胞三维培养的葡聚糖-透明质酸水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
(1)甲基丙烯酸甲酯修饰的葡聚糖(dex-ma)的制备
选用分子量为15kd～25kd的葡聚糖(dextran,dex)与4-二甲氨基吡啶(dmap)溶解于溶剂二甲基亚砜(dmso)中，控制dex、dmap和dmso的质量比为(1.0～1.5):1:(15～20)，在氮气环境中反应15～30分钟后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)，控制dex与gma的质量比为1:(1.2～1.5)，在15～30℃、氮气环境下搅拌反应2～4天，用稀盐酸将反应溶液ph调至6.5～7.2，将混合物用透析袋透析36～72小时，然后将产品放置于冷冻冰箱或液氮中冷冻24～48小时，再放入冻干机冷冻干燥24～72小时，得到dex-ma；
(2)己二酰肼修饰的透明质酸(ha-adh)的制备
分别称取透明质酸(ha)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶于去离子水中，控制ha、edc和去离子水的质量比为(3～4):1:(1500～2000)，室温下搅拌1～2小时；然后加入己二酰肼(adh)到反应体系中，控制edc与adh的质量比为(1.0～1.2):1，使用稀盐酸调节溶液ph至4.5～5.0，继续搅拌1～2小时；加入naoh溶液调节ph至6.8～7.0；用透析袋对反应产物进行透析，然后将产品放置于冷冻冰箱中冷冻24～48小时，再放入冻干机冷冻干燥24～72小时，得到己二酰肼修饰的透明质酸(ha-adh)。
(3)合成葡聚糖-透明质酸水凝胶(dex-ma-ha)
将dex-ma与ha-adh分别溶于去离子水中，质量浓度范围为8～10％w/v；将两种水溶液搅拌混匀，按照dex-ma与ha-adh质量比为8:1～6:1在70～80℃水浴锅中加热反应16～24小时，得到葡聚糖-透明质酸水凝胶；然后将产品放置于冷冻冰箱中冷冻24～48小时，再放入冻干机24～72小时冷冻干燥后，置于冷冻冰箱冻存。
通过本发明制备得到的一种用于细胞三维培养的葡聚糖-透明质酸水凝胶的制备方法，应用于体内/外细胞培养中，具体应用方法如下：
(1)体外细胞三维培养方法：首先，将dex-ha置于试管或培养板内放于-80℃冷冻冰箱内1～2小时。无菌条件下，按照质量浓度为30～50mg/ml加入dmem培养液于20～40℃静置大约30分钟，将水凝胶注入24孔板或48孔板。其次，消化培养的贴壁细胞，离心后无菌条件下，以2000～10000细胞/ml的密度接种细胞，制备细胞水凝胶混合液，在37℃、5％co2的条件下培养细胞。
(2)小鼠体内细胞培养方法：取(1)制备的细胞水凝胶混合液，使用针管吸取出水凝胶，将水凝胶注射入小鼠皮下移植位置，或采用解剖后注射移植位置。
本发明的有益效果：本发明制备得到的葡聚糖-透明质酸水凝胶经过各项指标检测，水凝胶冻干支架具有较好的孔径和孔隙率，各孔之间相互贯通，大小均匀(见图1)。该水凝胶适用于细胞体外三维培养，水凝胶具无毒且细胞相容性好特性。另外，水凝胶在生物体内(小鼠皮下)易降解，未发现炎症反应及血管增生，可用于体内填充物或药物缓慢释放。另外，细胞与水凝胶混合后，移植小鼠皮下发现可形成肿瘤块状组织，能维持细胞良好的生长状态，为细胞提供必要的三维生长环境。
附图说明
图1为实施例1制备的dex-ma-ha的扫描电镜图；
图2为实施例1水凝胶支架中接种hela细胞的生长状态(第一天)的显微镜图；
图3为实施例1水凝胶支架中接种hela细胞的生长状态(第三天)的显微镜图；
图4为实施例1水凝胶支架中接种hela细胞的生长状态(第六天)的显微镜图；
图5为实施例2制备的dex-ma-ha的扫描电镜图；
图6为实施例3制备的dex-ma-ha的红外光谱分析；
图7为实施例4水凝胶支架中接种hela细胞培养第8天钙黄绿素染色图片。
图8为实施例5水凝胶支架中接种hela细胞培养第8天hoechst染核图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照常规条件或按照产品说明书上所提供的条件。下面实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下结合技术方案和附图详细说明本发明的具体实施方式。
实施例1
葡聚糖-透明质酸水凝胶的制备、扫描电镜表征及水凝胶内细胞生长特性
(1)称量分子量为20kd的dex3g与2.7gdmap溶解于20mldmso中，在氮气环境中反应20分钟后加入4mlgma，在室温、氮气环境下搅拌反应4天，然后用1mol/l的盐酸将反应溶液中和过量的dmap至溶液ph＝7，将混合物进行透析48小时，放入-80℃冷冻冰箱24小时后，冷冻干燥内48小时，得到dex-ma；
(2)称取800mgha与202mgedc加入到盛有400ml去离子水的烧杯中，磁力搅拌一个小时后加入184mg的己二酰肼到反应体系中，使用1mol/l的盐酸不断调节ph＝4.75，继续搅拌两个小时；加入1mol/l的naoh溶液中和溶液使ph＝7.0；使用截留分子量为7kda的透析袋、0.1mol/l的nacl溶液对反应产物进行透析；然后将产品放置于-80摄氏度的冰箱中冷冻24小时，再放入冻干机中48小时冻干，得到ha-adh。
(3)合成葡聚糖-透明质酸水凝胶(dex-ha)：将浓度为8％dex-ma与浓度为8％ha-adh水溶液经磁力搅拌器搅拌混匀，dex-ma与ha-adh质量比为6:1在70℃水浴锅中加热反应20小时，得到葡聚糖-透明质酸水凝胶。
葡聚糖-透明质酸水凝胶的扫描电镜表征：将溶胀化的冷冻干燥的葡聚糖-透明质酸支架的表面进行平整化处理，之后使用扫描电镜进行扫描，观察记录实验结果。如图1所示，水凝胶断面扫描电镜图显示葡聚糖-透明质酸水凝胶支架呈现网状结构，水凝胶内部有很多孔径，孔径大小范围为30μm～80μm。对于一般的哺乳动物细胞来说，在20μm-125μm的孔径下就可以很好的生存。该水凝胶能够满足细胞良好的生长环境，细胞可以在不同层面生长。
水凝胶内细胞生长特性：水凝胶支架分别在24孔板内培养hela细胞。每孔加入30mg已经制好的水凝胶支架，并加入1ml的dmem培养液，每孔以3000/孔的密度接种hela细胞。在37℃、5％co2的条件下培养细胞，使用显微镜观察细胞的变化；如图2、图3、图4所示，hela细胞在水凝胶支架中的生长状态良好，并且细胞生长速度较快；hela细胞在水凝胶内分布均匀，细胞在水凝胶支架中呈3d结构生长，三天后细胞聚集成球体生长，随着天数的增加，球体的直径逐渐增大，并伴有其他的球体3d结构细胞的产生，同时球体的细胞间接触会更加紧密；细胞在培养6天后，水凝胶仍可以保持完整性，说明合成的新型葡聚糖-透明质酸水凝胶可以很好地进行细胞3d培养。
实施例2
葡聚糖-透明质酸水凝胶的制备及扫描电镜表征
实施例1中的(3)，将浓度为8％dex-ma与浓度为8％ha-adh水溶液经磁力搅拌器搅拌混匀，调整dex-ma与ha-adh质量比为6:1在70℃水浴锅中加热反应20小时，得到葡聚糖-透明质酸水凝胶。
dex-ma-ha的扫描电镜表征：如图5所示，所得的葡聚糖-透明质酸水凝胶支架的形貌基本没有变化。
实施例3
葡聚糖-透明质酸水凝胶的制备及红外光谱分析
实施例1中的(3)浓度为8％dex-ma与浓度为8％ha-adh水溶液经磁力搅拌器搅拌混匀，调整dex-ma与ha-adh质量比为6:1在80℃水浴锅中加热反应16小时，得到葡聚糖-透明质酸水凝胶。
dex-ma–adh的红外光谱分析：使用kbr压片法对各个中间产物以及终产物进行处理，之后进行红外光谱分析。如图6所示：1707cm-1处的α，β不饱和羧酸的c＝o伸缩振动吸收峰；1650cm-1处的共轭烯烃c＝c伸缩振动吸收峰；807cm-1处的双键中c-h的面外弯曲振动吸收峰均明显减弱，这是因为ha-adh上的氨基进攻碳碳双键发生迈克尔加成反应，双键打开形成三维交联网络结构所致，证明了迈克尔加成反应的发生。
实施例4
葡聚糖-透明质酸水凝胶的制备及其细胞相容性分析
实施例1中的(1)和(2)获得产物配制成浓度为10％dex-ma与浓度为10％ha-adh水溶液经磁力搅拌器搅拌混匀，调整dex-ma与ha-adh质量比为8:1在70℃水浴锅中加热反应24小时，得到葡聚糖-透明质酸水凝胶。
水凝胶的细胞相容性分析：取24孔细胞培养板，每孔加入30mg已经制好的水凝胶支架，并加入1ml的dmem培养液，每孔以3000/孔的密度接种hela细胞。在37℃、5％co2的条件下培养细胞，使用显微镜观察细胞的变化；根据活/死细胞染色盒上的步骤，使用酯化钙黄绿素(calcein-am,ca)和hoechst对细胞进行染色，4℃避光条件下孵育大约20分钟，使用pbs缓冲液冲洗细胞两次，放置于荧光显微镜下观察细胞。如图7显示，hela活细胞培养8天后进行钙黄绿素染色，能够显示细胞内脂酶活性，葡聚糖-透明质酸水凝胶中hela细胞90％以上被绿色荧光标记，说明hela细胞在水凝胶中存活率较高；图6为对hela细胞培养8天后进行hoechst细胞核染色，hoechst是一种活细胞染料，图中hela细胞90％以上被蓝色荧光标记，说明hela细胞在水凝胶中存活率较高。
实例5
葡聚糖-透明质酸水凝胶的制备及其体内可降解性和组织相容性检测
实施例1中的(1)和(2)浓度为10％dex-ma与浓度为10％ha-adh水溶液经磁力搅拌器搅拌混匀，调整dex-ma与ha-adh质量比为8:1在70℃水浴锅中加热反应24小时，得到葡聚糖-透明质酸水凝胶。
取24孔细胞培养板，每孔加入30mg已经制好的水凝胶支架，并加入1ml的dmem培养液，每孔以3000/孔的密度接种hela细胞。在37℃、5％co2的条件下培养细胞，使用显微镜观察细胞的变化；根据活/死细胞染色盒上的步骤，使用hoechst对细胞进行染色，4℃避光条件下孵育10分钟，使用pbs缓冲液冲洗细胞三次，放置于荧光显微镜下观察细胞。如图8显示，hela细胞90％以上被蓝色荧光标记，说明hela细胞在水凝胶中存活率较高。
水凝胶体内可降解性和组织相容性检测：称取水凝胶各20mg，将其各分成两份装入24孔板内，每个孔10mg。向每个孔加入dmem溶液0.5ml，静置大约30分钟。取6只spf级小鼠，使用针管吸取出水凝胶，将0.5ml的水凝胶注射入小鼠右侧腹部皮下位置，注射6只。正常培养小鼠30天，在对小鼠皮下注射葡聚糖-透明质酸水凝胶一个月后，小鼠没有出现异样，发现小鼠无炎症反应，未出现血管堆积，且水凝胶胶块已经消失，说明合成的葡聚糖-透明质酸水凝胶无毒且具有良好的生物可降解性。
水凝胶小鼠体内细胞培养:称取水凝胶各20mg，将其各分成两份装入24孔板内，每个孔10mg。向每个孔加入含有5×105hela细胞的dmem溶液0.5ml，静置大约30分钟。取6只spf级小鼠，使用针管吸取出水凝胶细胞复合物，将其注射入小鼠右侧腹部皮下位置，注射6只。观察小鼠形态变化，60分钟后将小鼠放回鼠笼内。之后三天使用酒精擦洗伤口，进行消毒。正常培养小鼠30天。在对小鼠皮下注射葡聚糖-透明质酸水凝胶与5×105hela细胞一个月后，观察皮下形成细胞肿瘤状态，发现细胞在水凝胶内生长良好，在小鼠皮下能生长并能形成肿瘤团块组织，在小鼠体内能为细胞提供必要的三维生长环境。
1.一种用于细胞三维培养的葡聚糖-透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)甲基丙烯酸甲酯修饰的葡聚糖dex-ma的制备
选用分子量为15kd～25kd的葡聚糖dex与4-二甲氨基吡啶dmap溶解于溶剂二甲基亚砜dmso中，控制dex、dmap和dmso的质量比为(1.0～1.5):1:(15～20)，在氮气环境中反应15～30分钟后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯gma，控制dex与gma的质量比为1:(1.2～1.5)，在15～30℃、氮气环境下搅拌反应2～4天，用稀盐酸将反应溶液ph调至6.5～7.2，将混合物用透析袋透析36～72小时，然后将产品放置于冷冻冰箱或液氮中冷冻24～48小时，再放入冻干机冷冻干燥24～72小时，得到dex-ma；
(2)己二酰肼修饰的透明质酸ha-adh的制备
分别称取透明质酸ha与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc溶于去离子水中，控制ha、edc和去离子水的质量比为(3～4):1:(1500～2000)，室温下搅拌1～2小时；然后加入己二酰肼adh到反应体系中，控制edc与adh的质量比为(1.0～1.2):1，使用稀盐酸调节溶液ph至4.5～5.0，继续搅拌1～2小时；加入naoh溶液调节ph至6.8～7.0；用透析袋对反应产物进行透析；然后将产品放置于冷冻冰箱中冷冻24～48小时，再放入冻干机冷冻干燥24～72小时，得到己二酰肼修饰的透明质酸ha-adh；
(3)合成葡聚糖-透明质酸水凝胶dex-ma-ha
将dex-ma与ha-adh分别溶于去离子水中，质量浓度范围为8～10％w/v；将两种水溶液搅拌混匀，按照dex-ma与ha-adh质量比为8:1～6:1在70～80℃水浴锅中加热反应16～24小时，得到葡聚糖-透明质酸水凝胶；然后将产品放置于冷冻冰箱中冷冻24～48小时，再放入冻干机24～72小时冷冻干燥后，置于冷冻冰箱冻存。
2.权利要求1制备得到的葡聚糖-透明质酸水凝胶，应用于体内/外细胞培养中。
3.根据权利要求2所述的一种用于细胞三维培养的葡聚糖-透明质酸水凝胶的应用，其特征在于，具体应用方法如下：
(1)体外细胞三维培养方法：首先，将dex-ha置于试管或培养板内放于-80℃冷冻冰箱内1～2小时；无菌条件下，按照质量浓度为30～50mg/ml加入dmem培养液于20～40℃静置30分钟，将水凝胶注入24孔板或48孔板；其次，消化培养的贴壁细胞，离心后无菌条件下，以2000～10000细胞/ml的密度接种细胞，制备细胞水凝胶混合液，在37℃、5％co2的条件下培养细胞；
(2)小鼠体内细胞培养方法：取(1)制备的细胞水凝胶混合液，使用针管吸取出水凝胶，将水凝胶注射入小鼠皮下移植位置，或采用解剖后注射移植位置。
技术总结