本发明涉及生物技术、无机化学、高分子化学、细胞生物学、基因工程等领域，具体涉及阳离子聚合物修饰的金纳米棒及其在递送和控制基因编辑系统的应用。
背景技术：
rna引导的常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(crispr)相关蛋白9(crispr/cas9)最近被用作细胞或生物体基因组编辑的工具，具有广泛的生物医学应用。crispr/cas9是由单引导rna(sgrna)和crispr/cas9内切酶构成，sgrna来识别目的dna靶点，crispr/cas9用于结合dna，切割目的dna靶点。基于crispr/cas9的基因编辑技术为精确性的修改基因组提供了一个强大而可靠的策略，使活细胞中几乎任何基因序列都能精确地编辑。由于其可全基因组特异性和多靶点编辑能力，crispr/cas9及其变种蛋白在生产基因敲除动物、纠正遗传疾病、功能基因组筛查等方面显示出巨大的潜力。尽管crispr/cas9具有种种优势，但是crispr/cas9系统在基因编辑过程中存在时间和空间控制，严重制约了目前crispr/cas9系统的复杂化、多样化的基因编辑应用。另外，非靶点基因编辑也制约了crispr/cas9基因编辑的用于疾病治疗和临床转化。
为了提高crispr/cas9介导的基因组编辑的时空特异性，目前已有使用化学手段和光学手段来控制crispr/cas9活性的方法。化学方法主要是通过小分子药物比如雷帕霉素、多西环素等进行crispr/cas9的活性调控，然而小分子激活缺乏空间特异性和可逆性，可能会引起被编辑细胞或全身细胞的潜在毒性。相对于化学策略，光学策略由于其非侵入性、具有时空特异性和可逆性等特点，使用光学控制crispr/cas9基因编辑会更有前景。然而目前已有的光学基因编辑系统主要是通过蓝光和紫外光控制，蓝紫光由于其较浅的组织穿透能力，以及潜在的光毒性，很难实现在体内基因编辑的应用。而近红外光由于其穿透能力强，没有光毒性，是光学控制crispr/cas9基因编辑的最佳选择。
编码基因编辑系统蛋白crispr/cas9和sgrna的质粒通常有10000个碱基大小，商业化的转染试剂比如lipofectamine2000在转染小于5000个碱基的质粒时具有优异的转染效率，然而对于基因编辑系统的质粒，商业化的转染试剂不能获得良好的转染效率。因此，设计一个对基因编辑系统质粒有良好的转染效率，又能利用近红外光控制crispr基因编辑的是至关重要的。
技术实现要素：
如何解决crispr基因编辑系统与近红外光控制高效结合是目前该技术领域最关键的问题。本发明的目的是提供一种聚合物修饰的金纳米棒材料，使用热敏激活的hsp70启动子启动的crispr质粒，通过聚合物修饰的金纳米棒将hsp70启动的crispr质粒递送进细胞，在近红外激光的控制下，金纳米棒吸收光能转换成局部的热能，通过质粒上的hsp70启动子启动crispr/cas9的转录和表达。聚合物修饰的金纳米棒不仅能有效地运送质粒，同时也能高效地实现近红外光-热能的转换，实现近红外光控基因编辑。
本发明提供的一种聚合物修饰的金纳米棒材料，所述聚合物修饰的金纳米棒材料包括金纳米棒、阳离子聚合物和阴离子聚合物，所述阳离子聚合物和阴离子聚合物通过静电层层自组装修饰到金纳米棒表面，第一步将阴离子聚合物修饰于金纳米棒表面，第二步使用阳离子聚合物修饰于第一步反应后的金纳米棒表面。
所述金纳米棒材料由两步金种生长法制备，第一步使用硼氢化钠还原制成金种，第二步使用对苯二酚还原制备具有近红外光二区吸收的金纳米棒。
所述阴离子聚合物包括但不局限于如式(1)所示的聚苯乙烯磺酸纳、如式(2)所示的聚丙烯酸、如式(3)所示的聚天冬氨酸、如式(4)所示的聚谷氨酸。
式(1)结构如下：
式(1)中，n为300-1000之间的整数；
式(2)结构：
式(2)中，n为30-5000之间的整数；
式(3)结构：
式(3)中，n为20-5000之间的整数；
式(4)结构：
式(4)中，n为20-5000之间的整数。
所述阳离子聚合物包括但不局限于如式(5)所示的聚酰胺-胺树形高分子、如式(6)所示的支化聚乙烯亚胺、如式(7)所示的线性聚乙烯亚胺、如式(8)所示的α-聚赖氨酸、如式(9)所示的ε-聚赖氨酸或如式(10)所示的聚-β环糊精-聚乙烯亚胺材料。
式(5)结构：
式(5)中，n为1-10之间的整数；m为2-4之间的整数；m是聚酰胺-胺树形高分子的核心；核心为乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和1，12-十二烷二胺时，m＝4；核心为氨时，m＝3；核心为甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、正辛胺、正癸胺、正十二胺时，m＝2。
式(6)结构：
式(6)中，n为2-100之间的整数；
式(7)结构：
式(7)中，n为20-1500之间的整数；
式(8)结构：
式(8)中，n为20-1000之间的整数；
式(9)结构：
式(9)中，n为20-1000之间的整数；
式(10)结构：
式(10)中，n为10-100之间的整数。
所述的聚合物修饰的金纳米棒材料，其特征在于，所述阴离子聚合物的结构如式(1)-式(4)所示；所述阳离子聚合物包括但不局限于如式(5)所示的聚酰胺-胺树形高分子、如式(6)所示的支化聚乙烯亚胺、如式(7)所示的线性聚乙烯亚胺、如式(8)所示的α-聚赖氨酸、如式(9)所示的ε-聚赖氨酸、如式(10)所示的聚-β环糊精-聚乙烯亚胺等；
本发明的另一个目的是提供所述聚合物修饰的金纳米棒材料作为载体在基因递送，基因编辑系统以及光控基因编辑系统中的应用。其中，所述聚合物修饰的金纳米棒载体，其作为基因、基因编辑系统等分子胞内递送的载体。
其中，所述基因传递中的基因包含但不限于质粒环状脱氧核糖核酸plasmiddna、信使核糖核酸mrna、小干扰核糖核酸sirna和发夹核糖核酸shrna等。
其中，所述基因编辑系统包括但不限于转录激活因子样效应物核酸酶talens、锌指核糖核酸酶zfns和常间回文重复序列丛集关联蛋白系统crispr等。
其中，所述crispr光控基因编辑系统包括但不限于crispr/cas9系统、crispr/dcas9系统、crispr/cas13a系统或crispr/cas13b系统。
利用本发明分别在293t，a549等细胞系中递送上述基因编辑系统。实验结果表明本发明具有以下优点：本发明提出的基因细胞内递送方法具有较高的胞内递送效率，基因进入细胞后能快速进入细胞核并将基因编码的信息表达出来，转染效率远高于商业化转染试剂lipofectamine2000(lipo2000)和pei25kda；通过热启动的hsp70启动子的质粒的递送，发现本发明能将该类型的质粒递送到细胞内，但热启动质粒不会直接表达，在特定波长的激光的照射下，金纳米棒将光能转换成热能，热启动质粒才能快速表达出质粒的信息。通过热启动hsp70启动的基因编辑系统质粒的递送，发现本发明可以利用激光控制基因编辑系统的开启与关闭，并具有很好的时空特异性。通过细胞毒性实验发现本发明提供的聚合物修饰的金纳米棒载体具有低细胞毒性，在热启动基因编辑系统递送的实验条件下细胞的存活率高于95％，具有良好的生物相容性；本发明提出的基因递送和光控基因编辑载体具有制备成本低，材料细胞毒性小的特点，在细胞内递送过程中可以达到高递送效率，能够有效地将基因编辑系统质粒递送到细胞质中，能够在近红外激光的控制下，实现基因编辑的空间时间控制。
附图说明
图1为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc的物理化学性能。
图2为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc与hsp-cas9基因编辑系统质粒形成复合物，并利用琼脂糖凝胶电泳表征apc与质粒的结合能力。
图3为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc与hsp-cas9基因编辑系统质粒形成复合物，并利用热成像仪表证复合物的光热转换能力。
图4为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc向293t细胞内递送hsp-cas9基因编辑系统质粒，并通过绿色荧光蛋白表达检测基因表达效率。
图5为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc向293t-egfp细胞内递送hsp-cas9基因编辑系统质粒编辑egfp基因。
图6为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc向293t细胞内递送hsp-cas9基因编辑系统质粒编辑内源性基因aavs1和rhbdf1。
图7为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc向细胞内递送hsp-cas9基因编辑系统质粒同时编辑aavs1和plk1基因。
图8为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc在不同鸡胸肉的厚度下光控启动hsp-cas9基因编辑系统质粒。
图9为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc对光控启动hsp-cas9基因编辑系统质粒的控制。
图10为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc携带光热启动hsp-cas9基因编辑系统质粒在体内的控制aavs1基因编辑。
图11为实施例1中聚合物修饰的金纳米棒apc在体内光控启动hsp-cas9基因编辑系统质粒、通过敲除plk1治疗癌症。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：基于金纳米棒和聚乙烯亚胺的合成阳离子金纳米棒基因递送载体。
在一个具体的实施例中，金纳米棒的制备方法为：依次使用王水和蒸馏水预先清洗所需的25ml烧瓶和搅拌子，称取5.0mg三水氯金酸固体溶于50μl的蒸馏水配制成氯金酸母液，将50μl氯金酸母液加入到12.5ml的蒸馏水中配制成氯金酸反应液。称取0.364g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶于5.0ml的蒸馏水，在30℃条件下搅拌使ctab完全溶解后，依次加入2.5ml蒸馏水和2.5ml氯金酸反应液制成反应液a，继续搅拌5分钟。将4mg硼氢化钠溶于10ml蒸馏水中制成硼氢化钠溶液，取600μl硼氢化钠溶液快速加入到反应液a中，加入硼氢化钠后10秒钟停止搅拌，反应液a避光30℃静置90分钟。0.364gctab在30℃的5.0ml的蒸馏水完全溶解，加入5.0ml氯金酸反应液制成反应液b，继续搅拌5分钟。将17mg硝酸银溶于1.0ml蒸馏水中，取120μl加入到反应液b，继续搅拌30秒。将11mg对苯二酚溶于1.0ml蒸馏水，取600μl加入到反应液b中，继续搅拌1分钟后，加入320μl反应液a到反应液b中，搅拌30秒，停止反应，避光30℃静置12小时得到金纳米棒溶液。取1ml金棒溶液(0.2mg/mlau)7000g离心10分钟，加入100μl重悬后加入到10ml的聚苯乙烯磺酸钠(2mg/ml)和氯化钠(1mm)混合溶液中，30℃搅拌反应1小时，7000g离心10分钟，吸去上清留底部沉淀，再分散到1ml去离子水中，得到ar-pss。取1mlar-pss加入到10ml的聚阳离子材料(2mg/ml)和氯化钠(1mm)混合溶液中，30℃搅拌反应1小时，7000g离心10分钟，吸去上清留底部沉淀，再分散到1ml去离子水中，得到apc材料。根据第二步修饰的聚阳离子材料的种类，使用聚-β环糊精-聚乙烯亚胺(分子量大于14000da，聚乙烯亚胺分子量600da，聚乙烯亚胺：β环糊精＝1：1)，树枝状聚乙烯亚胺(分子量25000da)，线性聚乙烯亚胺(分子量5000da)，聚酰胺-胺树形高分子(第五代)，α-聚赖氨酸修饰的金纳米棒分别命名为apc，apc2，apc3，apc4和apc5。
实施例2：聚合物修饰的金纳米棒基因递送载体apc的物理化学性能。
金纳米棒是一种纳米级的棒状材料，其内核为金元素，外部通过聚苯乙烯磺酸钠pss和聚阳离子材料(聚-β环糊精-聚乙烯亚胺)制备得到apc材料，通过透射电子显微镜和高分辨透射电子显微镜能谱分别表征金纳米棒的形态和元素组成。
具体操作方法如下：将合成的apc溶液(0.05mg/mlau)2μl结合1μg质粒后孵育30分钟，然后将其滴在铜网上，自然烘干，使用透射电子显微镜ht7700和高分辨透射电子显微镜jem-1010分别观察。
实验结果：其透射电镜和高分辨透射电镜能谱图如图1所示，图1a中可知金棒的长径比为7.1，长106.4±14.1nm，宽＝15.2±3.3nm。图1b显示，聚苯乙烯磺酸钠中的硫元素和聚-β环糊精-聚乙烯亚胺的氮元素与金元素重叠，说明apc的材料合成成功。图1a比例尺100nm，图1b比例尺25nm。
实施例3：聚合物修饰的金纳米棒apc与基因编辑系统质粒形成复合物，并利用琼脂糖凝胶电泳表征apc与质粒的结合能力。
基因编辑的质粒通常在10000个碱基以上大小，一般的材料不易于与大质粒结合，使用hsp-cas9-gfp-luci质粒作为模型，研究apc与质粒的结合能力。
具体操作方法如下：将质粒与apc溶液混合均匀，室温孵育30分钟，加入上样缓冲液混合均匀，加入到1％琼脂糖凝胶中，电压控制在120v，通电时间40min，检测apc与hsp-cas9-gfp-luci质粒的是否能够结合。
实验结果：图2表示本发明实施例1制备的apc与hsp-cas9质粒在0.15质量比时就能结合，apc具有较好的负载基因编辑系统质粒的能力。
实施例4：聚合物修饰的金纳米棒apc与基因编辑系统质粒形成复合物，并利用热成像仪表证复合物的光热转换能力。
具体操作方法如下：将合成的apc溶液(0.05mg/mlau)在1064nm的激光器下使用不同的激光强度，使用红外热成像仪研究apc溶液的升温情况。
实验结果：图3所示为apc的光热转换能力。图(a)和(b)显示，在30分钟激光照射时间内，使用0.33w/cm2强度的1064nm激光照射，照射前(a)和照射后(b)金棒的长径比和形貌不发生明显变化。图(c)显示，在300秒的激光照射时间内，0.33w/cm2的强度的激光照射可使溶液升温到45摄氏度，1.00w/cm2的强度的激光照射可使溶液升温到63℃。图(d)显示，apc在多次激光照射循环中都能维持较好的光热转换性能。图(e)显示，在室温环境下，使用apc在0.33w/cm2的激光照射下，溶液温度在10分钟内可达到并稳定在42℃。图(f)显示，在37℃环境下，溶液温度在3分钟内可达到并稳定于42℃。表明本发明实例1制备的聚合物修饰的金纳米棒材料apc具有优异的光热转化能力。
实施例5：聚合物修饰的金纳米棒apc向293t细胞内递送hsp-cas9基因编辑系统质粒，并通过绿色荧光蛋白表达检测基因表达效率。
以hsp-cas9-gfp-luci作为模型质粒，通过检测细胞内的荧光，在293t细胞上评估聚合物修饰的金纳米棒apc递送的效率，以lipo2000和pei25kda作为阳性对照。
具体操作方法如下：将293t细胞接种到48孔板中过夜，待293t细胞密度达到80％以上时，开始聚合物转染递送实验。将hsp-cas9-gfp-luci分别与本发明实施例1制备的apc充分混合后，于200μl无血清培养基中温和混匀，室温孵育30分钟后加入到48孔板中，转染6小时后，移除转染培养基并加入200μl含有10％血清的dmem培养基，继续培养2小时，将48孔板置于1064nm的激光器下激光30分钟，采用的激光方式是间隔式的脉冲激光，lipo2000和pei25kda对照组采用42℃水浴加热30分钟作为对比。继续培养48小时后在显微镜下观察绿色荧光蛋白表达量并拍照。
实验结果：图4为本发明实施例1中的材料在293t细胞上递送hsp-cas9-gfp-luci质粒的结果。结果表明相比于lipo2000和pe125kda，聚合物修饰的金纳米棒apc具有较高的转染效率，如不使用激光激活，apc的egfp绿色荧光蛋白表达量较低，表明apc需要使用激光激活才能表达质粒中的信息。
实施例6：聚合物修饰的金纳米棒apc向293t-egfp细胞内递送hsp-cas9基因编辑系统质粒敲除egfp基因。
具体操作方法如下：将稳定表达egfp绿色荧光蛋白的293t-egfp细胞接种到24孔板过夜，待293t-egfp细胞密度达到80％左右，开始质粒与apc复合物的转染实验。首先将hsp-cas9质粒与apc混匀，室温孵育30分钟，之后加入100μl无血清培养基，hsp-cas9质粒的剂量为每孔1μg。24孔板中的细胞提前加入400μl无血清培养基，将孵育好的复合物缓慢加入到细胞培养板中，37℃培养箱孵育6小时。移除转染培养基并加入500μl含有10％血清的dmem培养基，继续培养2h后，置于1064nm的激光器下激光30分钟，采用的激光方式是间隔式的脉冲激光。继续培养48小时后，使用激光共聚焦显微镜观察细胞内的绿色荧光蛋白敲除效率。并使用流式细胞仪定量分析293t-egfp细胞中egfp绿色荧光蛋白的平均荧光强度。所采用的sgegfp的靶点为：ggagcgcaccatcttcttca。
实验结果：图5为本发明制备的聚合物apc在293t-egfp细胞上递送hsp-cas9的质粒中敲除egfp的效率。在荧光显微镜下的细胞荧光图片(a)，流式细胞仪统计的细胞平均荧光强度(b)。结果表明本发明制备的聚合物apc可以通过光热启动激活crispr/cas9的表达，发挥其在293t-egfp细胞内编辑egfp基因的能力，并且基因编辑效率远优于商业化试剂lipo2000。
实施例7：聚合物修饰的金纳米棒apc向293t细胞内递送hsp-cas9基因编辑系统编辑内源性基因aavs1和rhbdf1。
具体操作方法如下：首先通过体外合成的方法制备把靶向aavs1的sgrna(sgaavs1和sgrhbdf1)(aavs1的靶点为accccacagtggggccacta，rhbdf1的靶点为gtccccagggccgctccgtt；atgccagggggaccgccgac；ccgtggccgtgccttccgtg)，并二代基因测序的方法鉴定sgrna是否有插入目的表达载体中。鉴定完毕之后，用于细胞实验。将293t细胞接种到24孔板，培养过夜。待细胞密度达到80％以上时，准备质粒递送实验。首先将带有sgaavs1和sgrhbdf1的hsp-cas9质粒与不同质量比的apc混合30分钟，之后在100μl无血清dmem培养基再次混匀。hsp-cas9的剂量为每孔1μg。室温孵育30分钟后，将该复合物加入到提前换好无血清培养基的细胞培养液中，于细胞培养箱中37℃孵育6小时。之后移除培养基，加入500μl含有10％血清的dmem培养基，继续培养2小时后，置于1064nm的激光器下激光30分钟，采用的激光方式是间隔式的脉冲激光。继续培养48小时。收样，根据商业化试剂盒提取基因组总dna，pcr扩增带有突变位点的目的片段(aavs1-fp：attcccagggccggttaatg；aavs1-rp：tcccaagaggagaa-gcagtt；rhbdf1-fp：gtgtctggatgggagagcat；rhbdf1-rp：tggagg-ataccttcctgagca)，之后将pcr产物纯化，pcr加热变性退火复性处理，最后在变性好的体系中加入0.5μl的t7e1核酸内切酶，在37℃下反应15分钟后，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测和分析酶切结果，琼脂糖电泳电压控制为120v，电泳时间40分钟。
实验结果：图6为本发明制备的聚合物apc在293t细胞内光控制基因编辑aavs1基因和rhbdf1基因的能力。结果表明，光控激活crispr/cas9系统，在aavs1基因(a)和rhbdf1基因(b)中都有比lipo2000更优异的基因编辑效率。
实施例8：聚合物修饰的金纳米棒apc向细胞内递送hsp-cas9基因编辑系统同时编辑aavs1和plkl基因。
具体操作方法如下：首先通过体外合成的方法把靶向aavs1和plk1的sgrna(sgaavs1和sgplk1)(aavs1的靶点为accccacagtggggccac-ta；plk1的靶点为aagtcgaatatgacggggag)，并二代基因测序的方法证明sgrna是否有克隆到表达载体上。鉴定完毕之后，用于细胞实验。将293t细胞接种到24孔板中，待细胞密度达到80％以上时，准备质粒递送实验。首先将带有sgaavs1和sgplk1的hsp-cas9质粒与apc混合，之后在100μl无血清dmem培养基再次混匀。hsp-cas9的剂量为每孔1μg，其中带有sgaavs1和sgplk1的质粒分别为0.5μg，同时。室温孵育30分钟后，将该复合物加入到提前换好无血清培养基的细胞培养液中，于细胞培养箱中37℃孵育6小时。之后移除培养基，加入500μl含有10％血清的dmem培养基，继续培养2h后，置于1064nm的激光器下激光30分钟，采用的激光方式是间隔式的脉冲激光。继续培养48小时。提取基因组总dna，pcr扩增带有突变位点的目的片段后(aavs1-fp：attcccagggccggttaatg；aavs1-rp：tcccaagaggagaagcagtt；plk1-fp：cctgtttcaaagcatagcccc，plk1-rp：ccatgacctaggctgcagaaa)，之后将pcr产物纯化，pcr加热变性退火复性处理，最后在变性好的体系中加入0.5μl的t7e1核酸内切酶，在37℃下反应15分钟后，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测和分析酶切结果，琼脂糖电泳电压控制为120v，电泳时间40分钟。
实验结果：图7为本发明制备的聚合物apc在293t细胞上递送hsp-cas9质粒编辑aavs1和plk1基因位点后使用t7e1核酸内切酶法检测突变体的突变率，相比于商业化试剂lipo2000，在光控制激活之下，apc显示较高的双基因编辑效率，具有较好的基因递送和基因编辑能力。
实施例9：聚合物修饰的金纳米棒apc在不同鸡胸肉的厚度下光控启动hsp-cas9基因编辑系统。
具体操作方法如下：首先通过上述的合成方法合成sgrna(sgaavs1)(aavs1的靶点为accccacagtggggccacta)。将293t细胞接种到24孔板，培养过夜。待细胞密度达到80％以上时，准备质粒递送实验。将hsp-cas9质粒与apc混合，hsp-cas9质粒的剂量为每孔1μg，室温孵育30分钟后，在100μl无血清dmem培养基再次混匀。将该复合物加入到提前换好无血清培养基的细胞培养液中，于细胞培养箱中37℃孵育6小时。之后移除培养基，加入500μl含有10％血清的dmem培养基，继续培养2h后，在24孔板上盖上不同厚度的鸡胸肉，置于1064nm的激光器下激光30分钟，采用的激光方式是间隔式的脉冲激光。继续培养48小时。提取基因组总dna，pcr扩增带有突变位点的目的片段(aavs1-fp：attcccagggccggttaatg；aavs1-rp：tcccaagag-gagaagcagtt)，之后将pcr产物纯化，pcr加热变性退火复性处理，最后在变性好的体系中加入0.5μl的t7e1核酸内切酶，在37℃下反应15分钟后，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测和分析酶切结果，琼脂糖电泳电压控制为120v，电泳时间40分钟。
实验结果：图8为本发明制备的apc在不同鸡胸肉的厚度下光控启动hsp-cas9基因编辑能力的效果图。结果表明，apc在多种厚度的鸡胸肉覆盖下，都能启动hsp-cas9基因编辑系统的表达并对aavs1基因进行切割，aavs1基因切割的效率随着覆盖鸡胸肉的厚度逐渐减少，在12毫米厚度的鸡胸肉覆盖下，aavs1基因的编辑效率仍可达6.6％，表明1064nm的激光具有较好的深部组织穿透能力，并可在深部组织中激活apc光热转换启动hsp-cas9基因编辑系统进行基因编辑。
实施例10：聚合物修饰的金纳米棒apc对光控启动hsp-cas9基因编辑系统的控制。
具体操作方法如下：首先通过上述的合成方法合成sgrna(sgaavs1)(aavs1的靶点为accccacagtggggccacta)。将293t细胞接种到24孔板，培养过夜。待细胞密度达到80％以上时，准备质粒递送实验。hsp-cas9-gfp-luci的剂量为每孔1μg，室温孵育30分钟后，在100μl无血清dmem培养基再次混匀。将该复合物加入到提前换好无血清培养基的细胞培养液中，于细胞培养箱中37℃孵育6小时。之后移除培养基，加入500μl含有10％血清的dmem培养基，继续培养2小时后，置于1064nm的激光器下激光5～30分钟。继续培养24小时。再置于1064nm的激光器下激光，激光时间为5～30分钟。采用的激光方式是间隔式的脉冲激光，激光强度0.33w/cm2。培养72小时后消化细胞。测量每个样品的荧光素酶表达量，并通过测量每个样品的总蛋白含量对荧光素酶表达量进行定量。另外提取基因组总dna，pcr扩增带有突变位点的目的片段(aavs1-fp：attcccagggccggttaatg；aavs1-rp：tcccaagaggagaagcagtt)，之后将pcr产物纯化，pcr加热变性退火复性处理，最后在变性好的体系中加入0.5μl的t7e1核酸内切酶，在37℃下反应15分钟后，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测和分析酶切结果，琼脂糖电泳电压控制为120v，电泳时间40分钟。
实验结果：图9为本发明制备的apc光控启动hsp-cas9基因编辑系统的控制机理。在5分钟激光内，其荧光素酶表达增量达到最大，表明光遗传学激活后能快速增强基因表达。然而，荧光素酶表达增量水平在此时间点后略有下降，并在移除光激活器后下降到基线水平。然而，当激光在第一次激活后24小时再次开启时，荧光素酶表达强度再次迅速增加，并再移除光激活器后又下降到基线水平。上述实验结果表明，apc对控制基因的表达是可逆的，apc可作为光遗传学开关来调节crispr/cas9的表达和活性。这些发现进一步激励我们探索如何通过开发的这个光遗传学开关精确调控基因编辑水平。通过将光激活的时间长度从5分钟控制到30分钟，我们发现基因编辑效率范围可以从3.4％精确调到31.3％。
实施例11：聚合物修饰的金纳米棒apc携带光热启动hsp-cas9质粒在体内的控制aavs1基因编辑。
具体操作方法如下：首先通过上述的合成方法合成sgrna(sgaavs1)(aavs1的靶点为accccacagtggggccacta)。将a549细胞接种到10cm培养皿中，培养过夜。待细胞密度达到70％以上时，准备质粒递送实验。crispr/cas9-luc的剂量为每孔10μg，apc的剂量为每孔5μg。室温孵育30分钟后，之后在100μl无血清dmem培养基再次混匀。室温孵育30分钟后，将该复合物加入到提前换好无血清培养基的细胞培养液中，于细胞培养箱中37℃孵育12小时。消化细胞，重悬于250μl的pbs中，将转染好的细胞注射在6周龄小鼠的背部，背部左测注射无转染a549细胞，背部右侧注射转染了hsp-cas9-luci质粒的a549细胞悬液。8小时后，将小鼠置于1064nm的激光器下激光激活背部注射a549细胞悬液的部位，光激活的时间分为5～30分钟。48h之后，将提前腹腔注射荧光素酶底物的小鼠置于小动物活体成像仪中观察荧光素酶表达并拍照。之后，将其组织囊肿取出，提取基因组总dna，pcr扩增带有突变位点的目的片段(aavs1-fp：attcccagggccggttaatg；aavs1-rp：tcccaagaggagaagcagtt)，之后将pcr产物纯化，pcr加热变性退火复性处理，最后在变性好的体系中加入0.5μl的t7e1核酸内切酶，在37℃下反应15分钟后，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测和分析酶切结果，琼脂糖电泳电压控制为120v，电泳时间40分钟。
实验结果：图10(a)为本发明制备的聚合物apc光控启动基因编辑系统(crispr/cas9)的示意图。结果表明，所制备的聚合物apc转染基因编辑系统24小时后，激光开启后荧光素酶强度迅速增加，在5分钟时，其增量达到最大，表明光遗传学激活后能快速增强基因表达。然而，荧光素酶表达水平在此时间点后略有下降，并在移除光激活器后显著下降到基线水平。然而，当激光在第一次激活后24小时再次开启时，荧光素酶表达强度再次迅速增加，并再移除光激活器后又下降到基线水平。上述实验结果表明，apc对控制基因的表达是可逆的，聚合物apc可作为光遗传学开关来调节crispr/cas9的表达和活性(b)。这些发现进一步激励我们探索如何通过开发的这个光遗传学开关精确调控基因编辑水平。通过将光激活的时间长度从5分钟控制到30分钟，我们发现基因编辑效率范围可以从3.4％提升到31.4％(c，d)。
实施例12：聚合物修饰的金纳米棒apc在体内光控启动hsp-cas9基因编辑系统通过敲除plk1治疗癌症。
具体操作方法如下：首先通过上述的合成方法合成sgrna(sgplk1)(plk1的靶点为aagtcgaatatgacggggag)。将a549细胞接种在balb/c裸鼠的背部皮下，a549细胞个数：2×106个。当肿瘤大小达到～80mm3(实验第0天)时，将携带肿瘤的裸鼠随机分为5组，每组5只小鼠。通过将含有10μghsp-cas9-sgplk1的50μldna溶液与50μl聚合物apc混合，在室温下进一步温育30分钟，加入10μl10x生理盐水配成注射液。其他的组依次注射生理盐水和apc。在实验的第一周内连续进行两次注射，之后持续观察21天。在每次注射8h之后，置于1064nm的激光器下对肿瘤部位激光30分钟，采用的激光方式是间隔式的脉冲激光，肿瘤部位温度通过热成像仪控制在42摄氏度以下。在每个时间点，用游标卡尺测量实体肿瘤的大小。通过使用以下公式计算肿瘤的体积：肿瘤体积＝[肿瘤长度*(肿瘤的宽度)2]/2。在第22天的将小鼠安乐死，记录小鼠体重，将其解剖后将其肿瘤组织取出拍照，测量肿瘤大小。
实验结果：图11为本发明制备的聚合物apc验证其在光控hsp-cas9基因编辑纳米系统用于癌症治疗的能力(a)。结果表明，所制备的聚合物apc在治疗肿瘤具有明显的优势，在光激活crispr/cas9表达一段时间之后(b)，plk1基因被破坏从而引起大量的肿瘤细胞凋亡(c，d)。与治疗前的初始大小相比，肿瘤大小也小得多。与此形成鲜明对比的是，使用相同配方治疗的小鼠，但没有光激活crispr/cas9表达的实验组，肿瘤迅速发展，在21天肿瘤体积达到1270mm3(e，f)。并且相对于无治疗组，治疗组的体重增加了4g左右(g)，体现了治疗组有助于小鼠恢复健康。这些结果共同证明了这种光遗传学可激活的crispr/cas9纳米系统可用于肿瘤治疗。
以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。
序列表
<110>浙江大学
<120>一种聚合物修饰的金纳米棒材料及其应用
<160>13
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>339
<212>dna
<213>热休克蛋白70(hsp70)
<400>1
cactctggcctctgattggtccaaggaaggctggggggcaggacgggaggcgaaaaccct60
ggaatattcccgacctggcagcctcatcgagctcggtgattggctcagaagggaaaaggc120
gggtctccgtgacgacttataaaagcccaggggcaagcggtccggataacggctagcctg180
aggagctgctgcgacagtccactacctttttcgagagtgactcccgttgtcccaaggctt240
cccagagcgaacctgtgcggctgcaggcaccggcgcgtcgagtttccggcgtccggaagg300
accgagctcttctcgcggatccagtgttccgtttccaga339
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>靶向绿色荧光蛋白的sgrna(sgegfp)
<400>2
ggagcgcaccatcttcttca20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>靶向腺相关病毒整合位点1的sgrna(sgaavs1)
<400>3
attcccagggccggttaatg20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>扩增腺相关病毒整合位点1正向引物(aavs1-fp)
<400>4
accccacagtggggccacta20
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>扩增腺相关病毒整合位点1反向引物(aavs1-rp)
<400>5
tcccaagaggagaagcagtt20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>靶向人类长菱家族基因的sgrna(sgrhbdf1)
<400>6
gtccccagggccgctccgtt20
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>靶向人类长菱家族基因的sgrna(sgrhbdf2)
<400>7
atgccagggggaccgccgac20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>靶向人类长菱家族基因的sgrna(sgrhbdf3)
<400>8
ccgtggccgtgccttccgtg20
<210>9
<211>20
<212>dna
<213>扩增人类长菱家族基因正向引物(rhbdf-fp)
<400>9
gtgtctggatgggagagcat20
<210>10
<211>21
<212>dna
<213>扩增人类长菱家族基因反向引物(rhbdf-rp)
<400>10
tggaggataccttcctgagca21
<210>11
<211>20
<212>dna
<213>靶向丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的sgrna(sgplk1)
<400>11
aagtcgaatatgacggggag20
<210>12
<211>21
<212>dna
<213>扩增丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶正向引物(plk1-fp)
<400>12
cctgtttcaaagcatagcccc21
<210>13
<211>21
<212>dna
<213>扩增丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶反向引物(plk1-rp)
<400>13
ccatgacctaggctgcagaaa21
1.一种聚合物修饰的金纳米棒材料，其特征在于，由金纳米棒，阳离子聚合物，阴离子聚合物构成，所述聚合物修饰是使用静电层层吸附的方法负载在金纳米棒表面，第一步将阴离子聚合物修饰于金纳米棒表面，第二步使用阳离子聚合物修饰于第一步反应后的金纳米棒表面。
2.根据权利要求1所述的聚合物修饰的金纳米棒材料，其特征在于，所述阴离子聚合物选自如式(1)所示的聚苯乙烯磺酸纳、如式(2)聚丙烯酸、如式(3)所示的聚天冬氨酸、如式(4)所示的聚谷氨酸；
式(1)结构：
其中，n为300-1000之间的整数；
式(2)结构：
其中，n为30-5000之间的整数；
式(3)结构：
其中，n为20-5000之间的整数；
式(4)结构：
其中，n为20-5000之间的整数。
3.根据权利要求1所述的聚合物修饰的金纳米棒材料，其特征在于，所述阳离子聚合物选自如式(5)所示的聚酰胺-胺树形高分子、如式(6)所示的支化聚乙烯亚胺、如式(7)所示的线性聚乙烯亚胺、如式(8)所示的α-聚赖氨酸或如式(9)所示的ε-聚赖氨酸，如式(10)所示的聚-β环糊精-聚乙烯亚胺；
式(5)结构：
其中，n为1-10之间的整数，m为2-4之间的整数，m是聚酰胺-胺树形高分子的核心；当核心为乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和1,12-十二烷二胺时，m＝4；当核心为氨时，m＝3；当核心为甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、正辛胺、正癸胺、正十二胺时，m＝2；
式(6)结构：
其中，n为2-100之间的整数；
式(7)结构：
其中，n为20-1500之间的整数；
式(8)结构：
其中，n为20-1000之间的整数；
式(9)结构：其中，n为20-1000之间的整数；
式(10)结构：
其中，n为10-100之间的整数。
4.权利要求1-10之任一项所述的聚合物修饰的金纳米棒材料作为载体在基因递送，基因编辑系统以及光控基因编辑系统中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，基因递送中的基因选自质粒plasmid、信使核糖核酸mrna、小干扰核糖核酸sirna或发夹核糖核酸shrna。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因编辑系统包括转录激活因子样效应物核酸酶talens、锌指核糖核酸酶zfns、常间回文重复序列丛集关联蛋白系统crispr。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述crispr基因编辑系统包括crispr/cas9系统、crispr/dcas9系统、crispr/cas13a系统或crispr/cas13b系统。
技术总结