本发明属于高分子生物医用水凝胶材料领域，特别涉及一种基于胺-环氧反应的结构可控的环氧水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术：
水凝胶(hydrogel)是一种具有三维网状结构的高分子聚合物，在水中能够吸收大量水分而溶胀，并在溶胀后能够继续保持其原有结构而不被溶解。因此，作为组织工程支架材料具有以下优点：一、组织损伤所造成的局部组织缺损可以通过介入的水凝胶得到物理意义上的填补；二、水凝胶的弹性模量接近人体软组织的优点满足了组织修复中对材料的生物力学特性的要求。三、水凝胶的三维网络结构及良好的渗透性为物质的交换(如营养物质，氧气及细胞的代谢产物)提供便利；四、水凝胶的亲水性为负载和释放水溶性的生物活性因子提供契机，可以减轻损伤部位营养因子缺乏的状况。
同时，人体组织结构中存在很多梯度结构，例如，关节组织就是其中一种。关节对于骨骼动物的运动机能至关重要,在活动中发挥重要作用,正常关节的骨软骨组织结构呈现出明显的梯度渐进性和复杂的生理学特性。同时在关节面上会包覆的一层无血管、无神经的含有少量细胞的终末端分化的多相结缔组织-关节软骨。关节软骨中的细胞及胶原纤维等也存在复杂的梯度渐进性。在各种日常运动生活中，关节软骨因为频繁使用造成的摩擦的关系，极易发生病变及损伤。关节软骨与血管化的组织不同，由于缺少血供来源，软骨细胞被包裹于细胞外基质中，无法快速迁徙到损伤部位进行修复，且缺少细胞分化需要的祖细胞和细胞转移需要的良好环境。同时由于软骨和软骨下骨的生物学特性不同，软骨浅层的压缩模量仅为0.079mpa，而软骨下骨的压缩模量高达5.7gpa，且都具有明显的梯度渐进性结构，导致骨—软骨一体化修复极具挑战。因此，构建仿人体组织的梯度渐进性的生理分层结构的水凝胶，对提升受损组织的有效修复能力具有重要价值。
最后，水凝胶材料自身可以封堵出血创面，同时水凝胶中的相连通的孔径结构可以用来吸附血液中大量的水，从而起到浓缩血液中凝血因子，促进快速凝血的功能。第二，天然水凝胶材料在生理环境下表面的氨基基团会质子化还具有激活血小板，促进血小板聚集和吸附血红细胞的能力，从而提高凝血效率，从而达到快速止血的效果。但是天然水凝胶制备复杂，常引入有机溶剂，易产生生物毒性。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于胺-环氧反应的结构可控水凝胶的制备方法及在组织工程、药物控释和快速止血中的应用。我们通过改变不同聚醚胺单体的摩尔比，从而改变制得的prepolymer中的eo/po比，即亲水和疏水链段比例来达到调控水凝胶内部微观形貌的目的，同时，胺-环氧反应引入的氨基集团在生理条件下带正电的特性，为促进细胞粘附起到积极的作用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明一方面提供了一种环氧水凝胶，所述环氧水凝胶是聚醚胺和环氧化合物在水中进行胺-环氧反应的产物。
上述技术方案中，进一步地，所述聚醚胺为t403、d400或ed900；所述环氧化合物为分子量＜10000含有两个或两个以上的端基为环氧基团的化合物。
上述技术方案中，进一步地，所述环氧化合物为1，3-二环氧丁烷(bde)或聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)。
本发明另一方面提供了前述环氧水凝胶的制备方法，所述方法为：
(1)聚醚胺溶解在水中，得到聚醚胺溶液；
(2)在步骤(1)的聚醚胺溶液中加入环氧化合物，加热反应得到聚醚胺-环氧反应溶液；
(3)在步骤(2)聚醚胺-环氧反应溶液中加入环氧化合物，加热反应即得到环氧水凝胶；或在步骤(2)聚醚胺-环氧反应溶液中加入与步骤(1)不同的聚醚胺溶液，加热反应后，再加入环氧化合物，加热反应即得到环氧水凝胶。
上述技术方案中红，进一步地，所述步骤(1)中聚醚胺溶液的浓度为10-50wt％。
上述技术方案中红，进一步地，所述步骤(2)中加热反应的温度为25-100℃，反应时间为5-100min。
上述技术方案中红，进一步地，所述步骤(2)中聚醚胺和环氧化合物的摩尔比为1:3～4:1。
上述技术方案中红，进一步地，所述步骤(3)中加热反应的温度为25-100℃，所述的聚醚胺-环氧反应溶液和环氧化合物的质量比为1:20～20:1，反应时间0.5-10h。
本发明第三方面提供了环氧水凝胶在组织工程、药物控释和快速止血中的应用。
本发明的有益效果：本发明的环氧水凝胶，其制备工艺简单，制备时间短，以水作为溶剂绿色环保，更避免了在水凝胶中引入有机溶剂的风险；本发明的环氧水凝胶中的氨基集团在生理条件下质子化带正电的特性，有利于吸引细胞粘附，其内部微观形貌可控，环氧水凝胶中的梯度结构有利于粘附的细胞分化；环氧水凝胶中邻位二醇的化学结构会对受损组织中的过氧化自由基(ros)进行直接的消耗，起到保护细胞的能力，具有生物活性和负载疏水性药物的能力和过氧化自由基(ros)释放药物的能力，可作为支架材料用于组织工程领域，例如中枢神经修复领域，可促进神经细胞的黏附和分化，同时也可作为控释系统将疏水药物负载，用于药物负载和释放，最后也可以作为一款快速止血材料来促进伤口止血。
附图说明
图1聚醚胺jt403和prepolymer-tb的红外谱图；
图2实施例1中球状结构tb环氧水凝胶的红外谱图；
图3水凝胶经过fitc(fluoresceinisothiocyanate)标记后的共聚焦显微镜照片；
图4水凝胶负载nilered后的共聚焦显微镜照片；
图5负载有疏水药物模型nilered水凝胶在pbs溶液和1％h2o2pbs溶液中浸泡0、6、24和48h的共聚焦显微镜的图片；
图6l929细胞与经过水凝胶作用后的500μmh2o2培养液共培养24h后的存活情况(**p<0.01，n＝3,themean±sd)；a:不含h2o2，b:与100mg水凝胶作用，c:与50mg水凝胶作用，d:与20mg水凝胶作用，e:不与水凝胶作用，f：共培养24h后的l929细胞存活率；
图7实施例中环氧水凝胶sem图；a:实施例1tb环氧水凝胶，b:实施例2tp环氧水凝胶；
图8实施例中共聚焦显微镜的图片；a:实施例3edb环氧水凝胶20倍拍照，b:实施例4db环氧水凝胶10倍拍照；
图9实施例中环氧水凝胶的sem图；a:实施例5tedb12环氧水凝胶，b:实施例6tedb6环氧水凝胶，c:实施例7tedb3环氧水凝胶；
图10实施例6实验结果图；a:原代神经元细胞与水凝胶共培养24h后的sem图；b:fitc标记的鬼笔环肽染色后的共聚焦显微镜的图片；
图11pc12细胞与水凝胶共培养24h后的fitc标记的鬼笔环肽染色后的共聚焦显微镜的图片；a:10倍拍照，b:20倍拍照，c:40倍拍照；
图12血细胞接触处理后各种材料的3000倍和10000倍sem图像；a/a'：实施例1环氧水凝胶；b/b'明胶止血海绵；c/c'：止血纱布；
图13大鼠肝损伤模型评估材料的止血性能；a:止血时间,b:失血。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的技术方案。这些实施例仅用于本说明而不用于限制发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本发明所限定的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及实验手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得。
实施例1
将1.1g聚醚胺t403(分子量440)加入8.825g超纯水中，震荡溶解，得到聚醚胺溶液；称量0.225g的1,3-二环氧丁烷，加入先前得到的聚醚胺溶液中，震荡混合，在水浴中65℃反应30min，然后冰水浴降温，震荡，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tb)；再将3mlprepolymer-tb和600mg聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)混合，加入模具中，密封，在水浴中65℃反应2h,得到内部微观结构为球状结构tb环氧水凝胶。
实施例2
将1.1g聚醚胺t403(分子量440)加入8.825g超纯水中，震荡溶解，得到聚醚胺溶液；称量1.25g的聚乙二醇二缩水甘油醚，加入先前得到的聚醚胺溶液中，震荡混合，在水浴中65℃反应30min，然后冰水浴降温，震荡，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tp)；再将3mlprepolymer-tp和600mg聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)混合，加入模具中，密封，在水浴中65℃反应2h,得到内部微观结构为球状结构tp环氧水凝胶。
实施例3
将1.35g聚醚胺ed900(分子量900)加入9.6g超纯水中，震荡溶解，得到聚醚胺溶液；称量0.09g的1,3-二环氧丁烷，加入先前得到的聚醚胺溶液中，震荡混合，在水浴中65℃反应30min，然后冰水浴降温，震荡，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-edb)；再将3mlprepolymer-edb和600mg聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)混合，加入模具中，密封，在水浴中65℃反应2h,得到内部微观结构为片层结构edb环氧水凝胶。
实施例4
将1.29g聚醚胺d400(分子量430)加入9.6超纯水中，震荡溶解，得到聚醚胺溶液；称量0.15g的1,3-二环氧丁烷，加入先前得到的聚醚胺溶液中，震荡混合，在水浴中65℃反应30min，然后冰水浴降温，震荡，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-db)；再将3mlprepolymer-db和600mg聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)混合，加入模具中，密封，在水浴中65℃反应2h,得到内部微观结构为梯度分布的球状结构db环氧水凝胶。
实施例5
将1.1g聚醚胺t403(分子量440)加入8.825g超纯水中，震荡溶解，得到聚醚胺溶液；称量0.225g的1,3-二环氧丁烷，加入先前得到的聚醚胺溶液中，震荡混合，在水浴中65℃反应10min，然后冰水浴降温，震荡，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tb)；再加入1.875g聚醚胺ed900和聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tb)混合；震荡混合，在水浴中65℃反应10min，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tedb12)；再将3mlprepolymer-tedb12和600mg聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)混合，加入模具中，密封，在水浴中65℃反应2h,得到内部微观结构为梯度结构tedb12环氧水凝胶。
实施例6
将1.1g聚醚胺t403(分子量440)加入8.825g超纯水中，震荡溶解，得到聚醚胺溶液；称量0.225g的1,3-二环氧丁烷，加入先前得到的聚醚胺溶液中，震荡混合，在水浴中65℃反应10min，然后冰水浴降温，震荡，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tb)；再加入3.75g聚醚胺ed900和聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tb)混合；震荡混合，在水浴中65℃反应10min，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tedb6)；再将3mlprepolymer-tedb6和600mg聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)混合，加入模具中，密封，在水浴中65℃反应2h,得到内部微观结构为梯度结构tedb6环氧水凝胶。
实施例7
将1.1g聚醚胺t403(分子量440)加入8.825g超纯水中，震荡溶解，得到聚醚胺溶液；称量0.225g的1,3-二环氧丁烷，加入先前得到的聚醚胺溶液中，震荡混合，在水浴中65℃反应10min，然后冰水浴降温，震荡，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tb)；再加入7.5g聚醚胺ed900和聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tb)混合；震荡混合，在水浴中65℃反应10min，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tedb3)；再将3mlprepolymer-tedb3和600mg聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)混合，加入模具中，密封，在水浴中65℃反应2h,得到内部微观结构为梯度结构tedb3环氧水凝胶。
实施例8
将1.1g聚醚胺t403(分子量440)加入8.825g超纯水中，震荡溶解，得到聚醚胺溶液；称量0.225g的1,3-二环氧丁烷，加入先前得到的聚醚胺溶液中，震荡混合，在水浴中65℃反应30min，然后冰水浴降温，震荡，得到聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tb)；再将3mlprepolymer-tb和600mg聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)混合，加入模具中，密封，在水浴中30℃反应2h,得到片层结构水凝胶，其内部没有互通网络结构。其扫描电镜图如图13所示，微观形貌是一层膜。
实验例1
实施例1水凝胶表面氨基集团的检测：
我们对实施例1中的制备的聚醚胺-环氧反应溶液(prepolymer-tb)和内部微观结构为球状结构t环氧水凝胶通过红外光谱进行化学结构的分析，可以很明显看出prepolymer-tb和tb环氧水凝胶中有氨基基团的存在(图1和2)。同时，我们应用异硫氰酸荧光素(fitc)能够和氨基反应并发出荧光的特性，通过共聚焦显微镜证实了水凝胶是球状结构且表面呈现出丰富的氨基集团(图3)。
实验例2
实施例1水凝胶负载疏水性药物的能力:
我们采用了具有亲脂性的荧光分子尼罗红作为药物模型，水凝胶浸泡在尼罗红溶液中一段时间后，在共聚焦显微镜下观察到水凝胶中的微球呈现出红色的荧光，这说明尼罗红被吸附进了微球中，水凝胶中的微球可用来包载疏水性药物(图4)。
实验例3
实施例1水凝胶对负载的药物进行ros响应性释放：
我们采用了具有亲脂性的荧光分子尼罗红作为药物模型，对实施例1水凝胶ros响应性释放能力进行检测。水凝胶浸泡在尼罗红溶液中一段时间后，在共聚焦显微镜下观察到水凝胶中的微球呈现出红色的荧光，然后让其在1％h2o2中浸泡6、24和48h，通过共聚焦显微镜下检测其在不同时间的荧光强度，可以明显看出，其荧光强度发生了明显下降，说明有尼罗红疏水药物模型被释放出来(图5)。
实验例4
实施例1水凝胶消耗过氧化自由基(ros)，保护细胞的能力的测试:
为了验证水凝胶是否具有抗氧化性及对氧自由基直接消耗的能力，水凝胶的生物活性评价通过外加h2o2对细胞的破坏来进行探究。正常情况下，一定量的h2o2会导致细胞死亡，而本实验探究水凝胶自身的抗氧化性能否对细胞起到保护作用。首先将20、50、100mg的水凝胶和500μmol/l的h2o2溶液37℃接触24h，然后和l929细胞在37℃细胞培养箱中共培养24h，不加h2o2的培养液和不接触水凝胶的h2o2溶液作为对照组。
从图6中可以看出加入一定的h2o2后，细胞的形貌呈圆形同时观察到大量细胞碎片，细胞大量死亡；而经过水凝胶浸泡后的培养的细胞形貌及存活情况得到改善，并且随着添加水凝胶浸泡的质量的增加，细胞形貌越来越好，呈梭形，并且生长状态也远优于不加水凝胶浸泡的。尤其是100mg的水凝胶浸泡处理后共培养的那组细胞，其细胞形貌和直接用培养液培养的完全一致，其细胞存活率也达到了用培养液培养的水平。而不加入水凝胶或是只加入20mg浸泡的水凝胶，其细胞存活率都极低，只有18.3％和37％，跟其余组相比，其具有显著统计学差异(p<0.01)。这说明水凝胶具有一定的对氧自由基直接消耗的能力，能够在一定程度上起到保护细胞的作用。
实验例5
实施例1和2水凝胶形貌结构
图7中a和b分别为实施例1和2的sem图片，可以明显看出实施例1和2水凝胶内部微观结构为球状形貌，但实施例1的球状尺寸明显大于实施例2，这说明加入的双环氧单体的种类对水凝胶内部微观形貌具有重要影响。
实施例3和4水凝胶形貌结构:
从图8可以明显看出实施例3水凝胶内部微观结构为片层(图8a)，且表面富含氨基集团；而实施例4水凝胶内部微观结构为梯度分布的球状结构(图8b)，表面富含氨基集团。
实施例4、5和6水凝胶形貌结构:
从图9中的a、b和c可以明显看出实施例4、5和6水凝胶内部结构呈现梯度分布。
实验例6
为了验证水凝胶是否具有促进神经细胞黏附和分化的能力，我们选择实施例1中的球状结构tb环氧水凝胶为例，通过在球状结构tb环氧水凝胶上接种pc12细胞和原代神经元细胞，观察pc12细胞和原代神经元细胞在环氧水凝胶样品上的黏附行为、细胞的微观形貌、神经轴突的生长情况。从图10和图11，可以看出球状结构tb环氧水凝胶能够很好的支持pc12细胞和原代神经元细胞的黏附，并且接触24h后，原代神经元细胞有着明显的分化行为，能够观察到明显的神经轴突生长出来。这说明环氧水凝胶材料具有促进神经细胞黏附和分化的能力，在神经修复领域具有潜在的应用价值。
实验例7
为了验证环氧水凝胶是否具有应用在止血领域的潜力，我们选择实施例1中的球状结构tb环氧水凝胶为例，通过球状结构tb环氧水凝胶与血细胞接触，观察血细胞在环氧水凝胶样品上的黏附行为，检测其吸引血细胞粘附的能力，以商业止血纱布和明胶止血海绵为对照。从图12可以看出，相对于商业止血纱布和明胶而言，水凝胶具有更好的吸引血细胞粘附的能力。同时，我们利用大鼠肝损伤模型，通过和商用明胶海绵和止血纱布进行比较，评价环氧水凝胶的止血能力(出血量和止血时间)。从图13可以明显看出，采用环氧水凝胶的实验组止血时间和出血量明显少于商用明胶海绵和止血纱布的实验组，这说明水凝胶具有更好的止血性能。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
1.一种环氧水凝胶，其特征在于，所述环氧水凝胶是聚醚胺和环氧化合物在水中进行胺-环氧反应的产物。
2.根据权利要求1所述的环氧水凝胶，其特征在于，所述聚醚胺为t403、d400或ed900；所述环氧化合物为分子量＜10000含有两个或两个以上的端基为环氧基团的化合物。
3.根据权利要求2所述的环氧水凝胶，其特征在于，所述环氧化合物为1，3-二环氧丁烷(bde)或聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)。
4.一种权利要求1所述的环氧水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法为：
(1)聚醚胺溶解在水中，得到聚醚胺溶液；
(2)在步骤(1)的聚醚胺溶液中加入环氧化合物，加热反应得到聚醚胺-环氧反应溶液；
(3)在步骤(2)聚醚胺-环氧反应溶液中加入环氧化合物，加热反应即得到环氧水凝胶；或在步骤(2)聚醚胺-环氧反应溶液中加入与步骤(1)不同的聚醚胺溶液，加热反应后，再加入环氧化合物，加热反应即得到环氧水凝胶。
5.根据权利要求4所述的环氧水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中聚醚胺溶液的浓度为10-50wt％。
6.根据权利要求4所述的环氧水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中加热反应的温度为25-100℃，反应时间为5-100min。
7.根据权利要求4所述的环氧水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中聚醚胺和环氧化合物的摩尔比为1:3～4:1。
8.根据权利要求4所述的环氧水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中聚醚胺-环氧反应溶液和环氧化合物的质量比为1:20～20:1。
9.根据权利要求4所述的环氧水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中加热反应的温度为25-100℃，反应时间0.5-10h。
10.权利要求1所述的环氧水凝胶在组织工程、药物控释和快速止血中的应用。
技术总结