本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶三维支架及其制备方法和在组织工程中的应用。具体是通过光引发甲基丙烯酸-2-氨基盐酸盐修饰的聚谷氨酸交联的方法得到水凝胶多孔支架材料。
背景技术：
水凝胶是一种高含水的三维网状结构的高聚物，可以通过改变高聚物材料的交联密度来调控三维网状结构中孔径的大小，做到程序化控制凝胶材料的含水量，使其在水中维持溶胀但不溶解的状态。并且这种三维网状结构可以很好的模拟细胞外基质，对软体组织进行有针对性地修复与重建，这一方法为组织工程领域提供了新的思路。此外，拥有仿似细胞外基质的水凝胶可以维持正常细胞的增殖、分化，以及拥有高度匹配缺损部位的能力，被视为一种比较理想的软组织替代材料，广泛地应用于组织工程领域，如：药物载体、创面修复和组织工程支架等。
γ-聚谷氨酸(γ-pga)是一种水溶性高分子多肽，由d-谷氨酸或l-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基经过酰胺化反应形成γ-酰胺键聚合形成的阴离子高聚物，主链上含有大量游离羧基，可以利用其特有化学性质进行接枝改性，其相对分子质量在100kda～1000kda之间，是一种酸性氨基酸聚合物，可通过化学合成法、提取法和微生物发酵法获得，具有优异的生物相容性、生物可降解性、保湿等特点，而且其结构与蛋白质的二级结构有相似性，因此在在蛋白质的结构模拟、生物医学领域应用方面被认为是最具应用潜力的生物材料之一。
目前，水凝胶材料的制备方法主要包括化学交联、物理交联、光引发聚合以及酶促交联等四种交联方式。但现有技术的成型方式往往不够温和，在成胶过程中，存在生物相容性差或机械强度不足等问题。
技术实现要素：
针对上述现有技术的问题，本发明提供一种光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶及其制备方法和应用，本发明通过光引发自由基聚合和fe3 的配位化学，将聚谷氨酸交联在一起，形成的水凝胶成型后可作为多孔支架，具有合成工艺简单、反应条件温和、纯水相体系生物相容性好、机械性能可调等特点，可以广泛的应用组织工程材料等领域。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)向含有γ-聚谷氨酸的水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)后活化；之后加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐反应后透析，得到甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物；
(2)将所述甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物加入到含有fe3 的光引发剂溶液中，得到原液；将所述原液于紫外光下照射，即得所述光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
优选的，步骤(1)所述的反应的时间为12～48h。
优选的，步骤(1)中，所述γ-聚谷氨酸的分子量为10万～200万道尔顿。
优选的，步骤(1)中，所述含有γ-聚谷氨酸的水溶液的浓度为10～30g/l。
优选的，步骤(1)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为3:1～1:2；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与γ-聚谷氨酸中羧基的摩尔比为3:1～1:3。
优选的，步骤(1)所述的含有γ-聚谷氨酸的水溶液的ph为4.5～5。
优选的，步骤(1)所述的活化的时间为15～90min。
优选的，步骤(1)所述的活化的温度为0～37℃。
优选的，步骤(1)所述的透析的时间为1～7天。
优选的，步骤(1)还包括透析后冷冻干燥的步骤。
优选的，步骤(2)所述的含有fe3 的光引发剂溶液中，fe3 的浓度为0.5～5g/l。
优选的，步骤(2)所述的光引发剂为i2959。
优选的，步骤(2)所述的含有fe3 的光引发剂溶液为含有fecl3的i2959的水溶液，i2959的质量分数为0.5％。优选的，步骤(2)中，甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐与γ-聚谷氨酸中羧基的摩尔比为4:1～1:5。
优选的，步骤(2)中，所述原液中，所述的甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物的质量浓度为5％～15％。
优选的，步骤(2)所述的紫外光下照射的时间为30s～5min。在紫外光照射的条件下混合制备原液，可在最短30s内迅速成胶。
所述制备方法的反应式为：
本发明还提供由上述方法制得的光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
本发明还提供由上述方法制得的光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶在组织工程材料领域中的应用。
所述应用包括：制备医用敷料和细胞支架。
本发明的有益效果在于：
光引发自由基聚合反应可以在任意部位通过紫外光照射快速进行，几乎不产生有害的毒副产物，并且具有较高的条件可控性，成交方式简单、快捷，是一种理想的化学交联反应；其次可以利用带负电的羧基基团与fe3 进行配位化学，可以利用这种物理增强方式对光交联形成的水凝胶进行物理加固，增强其机械性能，为其作为生物材料的应用提供一种较为理想的交联方式。
本发明以安全无毒、可生物降解材料γ-聚谷氨酸为主体材料，在其分子侧链修饰甲基丙烯酸-2-氨基盐酸盐基团，利用简单可控的光引发自由基聚合反应和简单的fe3 与游离羧基基团之间的物理交联，可以匹配复杂深层组织伤口。同时天然γ-聚谷氨酸具有与天然蛋白质相似的二级结构，模拟细胞外基质构建组织工程仿生多孔支架，使之能够有效促进组织损伤后的修复与再生。该水凝胶材料有效解决了单纯的光引发自由基聚合反应交联水凝胶机械能力弱的缺陷，且具有一定的生物相容性好、操作简便等优点，在医用敷料、药物载体和细胞支架等领域具有广阔的市场应用前景。
此法采用一步成胶技术，合成工艺简单，纯水相体系进行，不会引入其他有机试剂，以及过多的化学试剂，纯氨基酸体系，有更好的生物安全性。
附图说明
图1为本发明所制备得到的光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶扫描电镜图片。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详述的本发明。
实施例1
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-pga，分子量为10万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-pga的质量浓度为10g/l，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，调ph＝4.7，在4℃条件下搅拌活化30分钟。加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐(man·hcl)，室温搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，edc:γ-pga中羧基＝1.2:1，edc:nhs＝1:1，γ-pga中羧基:man·hcl＝1:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)，man的接枝率为20％。
(2)将甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)加入到含有fecl3的i2959溶液中得到原液；原液中γ-pga-man的质量浓度为5％；光引发剂溶液中i2959的质量浓度为0.5％；fe3 的质量浓度为0.5g/l，将所述原液通过紫外光照射5min成型，即得光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
实施例2
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-pga，分子量为70万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-pga的质量浓度为30g/l，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，调ph＝4.9，在30℃条件下搅拌活化60分钟。加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐(man·hcl)，室温搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，edc:γ-pga中羧基＝1:1，edc:nhs＝1:1，γ-pga中羧基:man·hcl＝1:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)，man的接枝率为15％。
(2)将甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)加入到含有fe3 的i2959的水溶液中得到原液；原液中γ-pga-man的质量浓度为5％；光引发剂溶液中i2959的质量浓度为0.5％；fe3 的质量浓度为1g/l，将所述原液通过紫外光照射4min成型，即得光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
实施例3
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-pga，分子量为70万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-pga的质量浓度为10g/l，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，调ph＝5.0，在15℃条件下搅拌活化45分钟。加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐(man·hcl)，室温搅拌反应48小时；各物质的摩尔比如下，edc:γ-pga中羧基＝2:1，edc:nhs＝1:1，γ-pga中羧基:man·hcl＝1:2。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析5天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)，man的接枝率为18％。
(2)将甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)加入到含有fe3 的i2959水溶液中得到原液；原液中γ-pga-man的质量浓度为15％；光引发剂溶液中i2959的质量浓度为0.5％；fe3 的质量浓度为5g/l，制备原液的过程中保持紫外光照射，30s即成型，得到光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
实施例4
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-pga，分子量为200万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-pga的质量浓度为20g/l，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，调ph＝4.5，在37℃条件下搅拌活化15分钟。加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐(man·hcl)，室温搅拌反应48小时；各物质的摩尔比如下，edc:γ-pga中羧基＝2:1，edc:nhs＝2:1，γ-pga中羧基:man·hcl＝1:3。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析7天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)，man的接枝率为27％。
(2)将甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)加入到含有fe3 的i2959水溶液中得到原液；原液中γ-pga-man的质量浓度为10％；光引发剂溶液中i2959的质量浓度为0.5％；fe3 的质量浓度为3g/l，将所述原液通过紫外光照射1min成型，即得光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
实施例5
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-pga，分子量为70万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-pga的质量浓度为10g/l，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，调ph＝4.8，在15℃条件下搅拌活化90分钟。加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐(man·hcl)，室温搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，edc:γ-pga中羧基＝3:1，edc:nhs＝3:1，γ-pga中羧基:man·hcl＝2:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析1天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)，man的接枝率为12％。
(2)将甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)加入到含有fe3 的i2959水溶液中得到原液；原液中γ-pga-man的质量浓度为5％；光引发剂溶液中i2959的质量浓度为0.5％；fe3 的质量浓度为5g/l，将所述原液通过紫外光照射3min成型，即得光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
实施例6
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-pga，分子量为200万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-pga的质量浓度为10g/l，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，调ph＝4.8，在0℃条件下搅拌活化45分钟。加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐(man·hcl)，室温搅拌反应48小时；各物质的摩尔比如下，edc:γ-pga中羧基＝3:1，edc:nhs＝1:2，γ-pga中羧基:man·hcl＝3:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析5天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)，man的接枝率为18％。
(2)将甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)加入到含有fe3 的i2959水溶液中得到原液；原液中γ-pga-man的质量浓度为15％；光引发剂溶液中i2959的质量浓度为0.5％；fe3 的质量浓度为2g/l，将所述原液通过紫外光照射1.5min成型，即得光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
实施例7
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-pga，分子量为200万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-pga的质量浓度为10g/l，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，调ph＝4.6，在4℃条件下搅拌活化30分钟。加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐(man·hcl)，室温搅拌反应12小时；各物质的摩尔比如下，edc:γ-pga中羧基＝1:3，edc:nhs＝1:1.2，γ-pga中羧基:man·hcl＝1:4。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)，man的接枝率为21％。
(2)将甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)加入到含有fe3 的i2959水溶液中得到原液；原液中γ-pga-man的质量浓度为10％；光引发剂溶液中i2959的质量浓度为0.5％；fe3 的质量浓度为1g/l，将所述原液通过紫外光照射5min成型，即得光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
实施例8
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-pga，分子量为70万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-pga的质量浓度为10g/l，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，调ph＝4.9，在4℃条件下搅拌活化45分钟。加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐(man·hcl)，室温搅拌反应36小时；各物质的摩尔比如下，edc:γ-pga中羧基＝1:2，edc:nhs＝1:2，γ-pga中羧基:man·hcl＝5:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)，man的接枝率为15％。
(2)将甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-pga-man)加入到含有fe3 的i2959水溶液中得到原液；原液中γ-pga-man的质量浓度为15％；光引发剂溶液中i2959的质量浓度为0.5％；fe3 的质量浓度为0.5g/l，将所述原液通过紫外光照射3min成型，即得光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
实施例9：细胞毒性评价实验
采用死活染色评价γ-聚谷氨酸水凝胶的细胞相容性，实验对象为小鼠成纤维细胞(l929)。具体实验步骤为：(1)将l929细胞培养在含10％胎牛血清和1％双抗的高糖dmem培养基中，置于37℃、5％的co2培养箱中直到细胞汇合率达85％以上，用胰蛋白酶消化后离心，并用培养基调整细胞密度为1×105cell/ml的细胞悬液；(2)然后接种该细胞悬液到24孔板中，每孔200μl，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中培养12小时贴壁后；(3)吸出原有的培养液，分别加入1ml的γ-pga-man/fe3 水凝胶的浸提液、空白对照液(即新鲜完全培养基)以及相同浓度的gelma水凝胶的浸提液，每组共3个平行样本；(4)分别在24h，48h，72h三个时间点每孔按照每毫升加入40μl的比例加入ao/eb染液染色工作液，37℃恒温培养箱中放置5分钟后于荧光倒置显微镜下观察荧光染色的细胞。染色后的细胞在荧光显微镜下，观察细胞形态，活细胞呈现出绿色正常结构；死细胞呈现出橘红色固缩状或圆珠状结构。
注：染色工作液配置：将吖啶橙(ao)溶液和溴化乙锭(eb)溶液按1:1的体积比混合成工作液，现用现配。本实验ao、eb溶液浓度分别为100μg/ml，所含稳定剂不影响实验效果。
实施例10
γ-pga水凝胶l929细胞三维培养：用含光引发剂的pbs(0.01m，ph＝7.4)配置水凝胶前体液(15％wtγ-pga-man和0.1％wtfe3 )，使用0.22μm的微孔滤膜除菌。无菌条件下，按照2×106cell/ml的细胞最终密度与聚合物溶液混匀，在直径1cm的模具中充分混合后，利用紫外光照射使其聚合成胶。随后，将水凝胶置于共聚焦培养皿中加入3ml新鲜培养基培养，间隔24h换液，不同时间点间取出水凝胶样品用上述的ao-eb染液染色工作液染色1-6h，用荧光共聚焦显微镜观察水凝胶内三维培养细胞的生长情况。l929细胞封装在γ-聚谷氨酸水凝胶中培养不同时间后均具有较高的细胞相容性，在支架中的细胞形态大多呈梭状并在三维网络结构中呈现增殖状态。水凝胶内部活细胞呈现出绿色荧光，仅有较少呈现出红色荧光死细胞，说明制备的γ-聚谷氨酸水凝胶支架均具有良好的细胞相容性并有望成为细胞培养的新型支架材料。
综上表明，我们提供了一种利用γ-聚谷氨酸(γ-pga)通过光引发自由基聚合反应并通过物理配位作用来构建的仿生水凝胶支架材料不仅具有一定强度的机械性能，也具有优良的细胞相容性，有望后期包载细胞用于受损软组织的修复与再生，因此在医用敷料、组织工程等领域具有广阔的市场应用前景。
1.一种光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）向含有γ-聚谷氨酸的水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺后活化；之后加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐反应后透析，得到甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物；
（2）将所述甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物加入到含有fe3 的光引发剂溶液中，得到原液；将所述原液于紫外光下照射，即得所述光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的反应的时间为12~48h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为3:1~1:2；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与γ-聚谷氨酸中羧基的摩尔比为3:1~1:3。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的含有fe3 的光引发剂溶液中，fe3 的浓度为0.5~5g/l。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的光引发剂为i2959。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐与γ-聚谷氨酸中羧基的摩尔比为4:1~1:5。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述原液中，所述的甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐修饰的γ-聚谷氨酸聚合物的质量浓度为5%~15%。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的紫外光下照射的时间为30s~5min。
9.权利要求1-8任一所述制备方法制得的光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
10.权利要求1-8任一所述制备方法制得的光交联的γ-聚谷氨酸水凝胶在组织工程材料领域中的应用。
技术总结