本发明是一种用于蛋白酶酶谱法的原位凝胶制备方法，属于土壤酶谱法
技术领域：
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背景技术：
：随着土壤酶谱法的发展进步，相关学者对土壤中微生物活动空间分布的探索方式也更加新颖。由于酶谱法是一种不需要破坏土壤结构的原位方法，因此它能够更真实地描绘酶活性。在以后的土壤微生物研究或根际效应的研究中，土壤酶谱法会得到更加广泛的普及与运用。根据已有研究，土壤酶活性的高低关乎土壤微生物活性，在反映微生物活性状况等方面极具参考研究价值，而植物的根际土壤受根系分泌物堆积影响强烈，土壤微生物在此微域多有集聚现象，故土壤酶活性在根际微区普遍偏高。所以根际土壤的酶活性相对于一般土壤的酶活性更具研究价值。在用于研究根际土壤蛋白酶分布的蛋白酶酶谱法中，采用覆盖有相应底物分子的膜来测量土壤中蛋白酶的分布。这些膜可以在以凝胶为基质的土壤表面上孵育，并基于考马斯亮蓝、银染法对蛋白质的染色原理对原位凝胶进行着色。最后利用比色法处理生成酶谱图。目前利用蛋白酶酶谱法来定位和定量土壤中的蛋白酶酶活性的尝试中，尚未有一种明确的优质原位凝胶制备技术或相关参数。制作一种均质、稳定、硬度合适的便于蛋白酶孵育的凝胶是蛋白酶谱酶法的核心。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种以琼脂糖、明胶、β-环状糊精、pbs（磷酸盐缓冲溶液）等为实验原料制备的原位凝胶方法，可用于根际土壤中蛋白酶分布的测定，也可广泛用于蛋白酶酶谱法实验材料。这种用于蛋白酶酶谱法的原位凝胶制备技术填补了相关凝胶制备技术的缺失，通过制备高质量的原位凝胶对实验土壤进行孵育，绘制成酶谱图，为土壤中酶活性计算提供便利。本发明的技术解决方案：一种用于蛋白酶酶谱法的原位凝胶制备方法，包括以下步骤：（1）配液：凝胶采用琼脂糖配制，加入明胶用于确定蛋白酶活性，加入β-环状糊精增加所制备凝胶的稳定性，加入pbs作为保护剂；最后将以上原材料在去离子水中混合均匀；（2）化胶：将所配置溶液置于高压蒸气灭菌锅中，在0.5mpa的条件下加热至70℃，加热时间持续5-15min，至溶液呈澄清状态取出；（3）冷凝成型：准备玻璃室厚度为1mm的玻璃室，玻璃室需可拆卸供所制备凝胶的取用；将所制备的凝胶温度控制在65=75℃，浇铸在玻璃腔室内冷却成型；（4）孵育：凝胶冷却成型后立即拆开玻璃室的一面，稳定住凝胶的一面将其覆盖在平整干燥的根际土壤表面；用塑料薄膜覆盖住凝胶防止其失水干燥，在黑暗条件中以室温孵育24小时；（5）染色：将孵育好的凝胶取下，放置在蒸馏水中，用水平摇床以80rmp处理2分钟以除去表面的附着的土壤；配置水合茚三酮染色溶液并将处理好的凝胶放置在染色溶液中着色10分钟；（6）脱色：将着色后的凝胶置于脱色溶液中在水平摇床中以80rmp处理25-35分钟取出。所述的步骤（1）配液中，凝胶采用1.4w/v%琼脂糖配制，明胶含量为0.08w/v%，β-环状糊精含量为0.2w/v%，pbs浓度为0.2v/v%。所述的步骤（5）染色中所用染色溶液用0.5w/v%水合茚三酮配置，并用乙酸将溶液的ph调节至5.9。所述的步骤（6）脱色中所用的脱色溶液用10v/v%乙醇和10v/v%乙酸配制。本发明的有益效果：1）在原位凝胶配制过程中通过添加0.2%（w/v）β-环状糊精来提高凝胶对光热、氧的稳定性。2）在化胶和浇铸前的温度控制保持在一个合理的范围，既能保证所配制的溶液成分不会挥发散失，也能将冷凝前的溶液控制在均一流动的液体状态。3）根据适量pbs（磷酸盐缓冲溶液）保护稳定试剂，在无菌条件下控制除了根际土壤中蛋白酶部分其他与实验无关的蛋白质不会对该原位凝胶有污染干扰。4）采用了最适用于土壤酶谱法原位凝胶的染色方法。不同于bradford法中考马斯蓝与蛋白质结合变色的性质，本发明制备适用于本原位凝胶和蛋白酶酶谱法的染色和脱色溶液。对比之下，采用水合茚三酮染色方法使得着色更加灵敏以便于通过实验室扫描仪呈现出明显的酶谱图。不同于蛋白质的银染法，所用的试剂不会影响原有土壤中的蛋白酶分布情况，使得实验结果更加准确。具体实施方式一种用于蛋白酶酶谱法的原位凝胶制备技术原材料为：琼脂糖、明胶、β-环状糊精、pbs（磷酸盐缓冲溶液）、水合茚三酮、乙醇和乙酸。制备方法如下：（1）配液：凝胶均采用1.4%（w/v）琼脂糖配制，用于确定蛋白酶活性的明胶含量为0.08%（w/v），同时加入0.2%（w/v）β-环状糊精增加所制备凝胶的稳定性和0.2%（v/v）pbs（磷酸盐缓冲溶液）作为保护剂。最后将以上原材料在去离子水中混合均匀。（2）化胶：将所配置溶液置于高压蒸气灭菌锅中，在0.5mpa的条件下加热至70℃，加热时间持续10分钟左右。至溶液呈澄清状态取出。（3）冷凝成型：准备与适宜大小的玻璃室（大小同所备根际土壤大小相符），玻璃室厚度为1mm，玻璃室需可拆卸供所制备凝胶的取用。将所制备的凝胶温度控制在70℃左右浇铸在玻璃腔室内冷却成型（冷却至室温时基本成型并呈透明状）。（4）孵育：凝胶冷却成型后立即拆开玻璃室的一面，稳定住凝胶的一面将其覆盖在平整干燥的根际土壤表面。用塑料薄膜覆盖住凝胶防止其失水干燥，在黑暗条件中以室温孵育24小时。（5）染色：将孵育好的凝胶取下，放置在蒸馏水中，用水平摇床以80rmp处理2分钟以除去表面的附着的土壤。配置水合茚三酮染色溶液并将处理好的凝胶放置在染色溶液中着色10分钟。（6）脱色：将着色后的凝胶置于脱色溶液中在水平摇床中以80rmp处理30分钟左右取出。进一步的，步骤（5）染色中所用染色溶液用0.5%（w/v）水合茚三酮配置，并用乙酸将溶液的ph调节至5.9左右。进一步的，步骤（6）脱色中所用的脱色溶液用10%（v/v）乙醇和10%（v/v）乙酸配制。实施例1：原位凝胶的制备（未孵育）（1）配液：在250ml的去离子水中置入3.5g的琼脂糖、0.2g的明胶、0.5g的β-环状糊精和0.5ml的pbs缓冲溶液，搅拌均匀。（2）化胶：将所配置溶液置于高压蒸气灭菌锅中，在0.5mpa的条件下加热至70℃，加热时间持续10分钟左右。至溶液呈澄清状态取出。（3）冷凝成型：准备25cm×10cm的玻璃室，玻璃室厚度为1mm，玻璃室需可拆卸供所制备凝胶的取用。将所制备的凝胶温度控制在70℃浇铸在玻璃腔室内冷却成型（冷却至室温时基本成型）。（4）染色：将冷却好的凝胶取下。借鉴水合茚三酮法将处理好的凝胶放置在染色溶液中着色10分钟。所述的染色溶液是用5g水合茚三酮、用乙酸调节溶液ph在5.9左右，在去离子水中混合1l溶液制成。（5）脱色：将着色后的凝胶置于脱色溶液中在水平摇床中以80rmp处理30分钟左右取出。所述的脱色溶液是用500ml乙醇和500ml乙酸在去离子水中混合5l溶液制成。对比例1：校准凝胶的制备（未孵育）配液时更改明胶成分的含量：在250ml的去离子水中置入3.5g的琼脂糖、0.15g的明胶、0.5g的β-环状糊精和0.5ml的pbs缓冲溶液，搅拌均匀。其余步骤同实施例1。对比例2：校准凝胶的制备（未孵育）配液时更改明胶成分的含量：在250ml的去离子水中置入3.5g的琼脂糖、0.1g的明胶、0.5g的β-环状糊精和0.5ml的pbs缓冲溶液，搅拌均匀。其余步骤同实施例1。对比例3：校准凝胶的制备（未孵育）配液时更改明胶成分的含量：在250ml的去离子水中置入3.5g的琼脂糖、0.05g的明胶、0.5g的β-环状糊精和0.5ml的pbs缓冲溶液，搅拌均匀。其余步骤同实施例1。对比例4：校准凝胶的制备（未孵育）配液时更改明胶成分的含量：在250ml的去离子水中置入3.5g的琼脂糖、0.5g的β-环状糊精和0.5ml的pbs缓冲溶液，不置入明胶，搅拌均匀。其余步骤同实施例1。对比例5：校准凝胶的制备（未孵育）配液时更改明胶成分的含量：在250ml的去离子水中置入3.5g的琼脂糖和0.25g的β-环状糊精，不置入明胶，搅拌均匀。其余步骤同实施例1。效果实施例将实施例与对比例所制备的原位凝胶（未孵育）在实验室扫描仪下扫描，将所扫描后结果中的基质进行灰度值分配，黑色像素对应灰度值为0，白色像素对应灰度值为256。我们以灰度值大小反应染色深浅，比较不同明胶浓度下所配制染色溶液对各原位凝胶的染色效果。明胶浓度（w/v）灰度值实施例10.089对比例10.06G对比例20.04V对比例30.02
