本发明属于生物组织工程领域，具体涉及一种用于软骨修复的可注射聚氨基酸水凝胶及其制备方法。
背景技术：
水凝胶是由亲水性聚合物交联形成的三维网络所构成，它能够吸收和保留大量的水或生物液体，具有与细胞外基质(ecm)相似的物理化学性质。在组织工程学和再生医学的领域中，可注射型水凝胶由于其高含水量、与天然细胞外基质相似、具有适合细胞迁移和增殖的多孔三维网络结构、可微创注射操作和能够高度匹配任意缺损部位等优点，已被广泛用于细胞生长的支架及各种生物活性分子的载体。近年来，多种生物材料已被开发成可注射型水凝胶支架，并应用于软骨组织工程和再生医学等领域。
可注射型水凝胶有多种制备方法，根据其制备方式的不同，可主要分为物理水凝胶和化学水凝胶。物理水凝胶是由非共价键自发地形成的，它是对温度、ph或离子浓度等刺激而产生响应性，化学水凝胶是通过化学交联形成的三维网络，如酶催化交联、希夫碱反应、迈克尔加成反应，点击化学反应，和光引发交联等来制备。
生物活性因子(如tgf-β、bmps、igf等)作为软骨组织工程的重要组成部分，可用来调控细胞的分化、诱导和加速软骨的形成。生物活性因子结合到水凝胶中可控制细胞的分化和组织的形成，并能增强水凝胶的生物活性。然而，生长因子药价昂贵、半衰期短、容易变性，直接在水凝胶表面滴加生长因子或用水凝胶直接溶胀含因子的溶液容易产生突释，还会因为局部过量产生毒性和致癌性。通过水凝胶成分中的埜团共价固定因子，可以解决突释及局部过量毒性问题，但因子的活性会因共价反应受到破坏。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种用于软骨修复的可注射聚氨基酸水凝胶及其制备方法，该水凝胶能应用在软骨组织工程中，作为软骨细胞的支架材料等。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种用于软骨修复的可注射聚氨基酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备双键功能化的聚氨基酸；
(2)制备聚氨基酸水凝胶：
将步骤(1)得到的所述双键功能化的聚氨基酸溶于缓冲溶液中，并加入巯基封端的交联剂的溶液，混匀后静置，即得所述聚氨基酸水凝胶；
(3)生长因子的吸附：
对所述聚氨基酸水凝胶进行清洗、脱水，之后转移到含有生长因子的溶液中进行溶胀，即得所述用于软骨修复的可注射聚氨基酸水凝胶。
优选的，所述巯基封端的交联剂为二硫苏糖醇。
二硫苏糖醇作为交联剂，可通过封端的巯基和聚氨基酸接枝的双键进行加成反应。
优选的，所述巯基封端的交联剂的溶液为巯基封端的交联剂的四硼酸钠溶液。四硼酸钠可以调节水凝胶前驱体的ph，使之为弱碱性，并与二硫苏糖醇以及水形成大量氢键，进一步增强凝胶网络，还可催化二硫苏糖醇上巯基与聚谷氨酸上双键的加成反应。
步骤(1)可采用现有技术制备双键功能化的聚氨基酸，也可采用下述方法：
(1)向聚氨基酸的水溶液中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，调节ph为3.5～6.0，于4℃～80℃，搅拌反应3～12小时，随后，将反应溶液用水稀释至原体积的2～10倍，进行透析、干燥后得到所述双键化功能的聚氨基酸；所述甲基丙烯酸缩水甘油酯的用量为所述聚氨基酸的0.1～10倍摩尔量。
优选的，步骤(1)所述的透析的时间为1～7天。
优选的，步骤(1)所述的干燥的时间为1～5天。
优选的，步骤(1)所述的聚氨基酸水溶液中聚氨基酸的质量分数为0.1～10％。
优选的，步骤(1)中所述的聚氨基酸为聚谷氨酸。聚谷氨酸可以和甲基丙烯酸缩水甘油酯通过适当的条件而在其侧链上接枝上双键。然后，通过烯烃-硫醇点击化学反应进行交联，从而形成水凝胶。
优选的，步骤(2)中所述的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液。
优选的，所述四硼酸钠溶液中，四硼酸钠的质量浓度为0.01～2％。
优选的，步骤(2)中所述巯基封端的交联剂的溶液中二硫苏糖醇的质量浓度为0.1～1％。
优选的，步骤(2)中所述双键功能化的聚氨基酸溶于缓冲溶液后，形成的溶液中所述双键功能化的聚氨基酸的质量浓度为0.5～15％。
优选的，步骤(3)中所述的清洗为采用磷酸盐缓冲溶液、氯化钠溶液或水进行清洗。
优选的，步骤(3)中所述的脱水为采用体积浓度为50～99％的乙醇溶液进行脱水。
优选的，步骤(3)中所述的清洗、脱水过程重复3次。
优选的，步骤(3)中所述的含有生长因子的溶液中生长因子的浓度为0.02～0.2μg/ml。
优选的，步骤(3)中所述的含有生长因子的溶液为含有生长因子的磷酸缓冲溶液、含有生长因子的氯化钠溶液或生长因子的水溶液。
优选的，步骤(3)中所述的生长因子为转化生长因子、骨形态发生蛋白或胰岛素生长因子。
优选的，所述转化生长因子为tgf-β1、tgf-β2或tgf-β3；所述骨形态发生蛋白为bmp-2或bmp-7；所述胰岛素生长因子为igf-i或igf-ii。
上述的转化生长因子和胰岛素生长因子具有良好软骨诱导功能，骨形态发生蛋白能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。
本发明还提供上述方法制备得到的用于软骨修复的可注射聚氨基酸水凝胶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.步骤(1)中的聚氨基酸通过甲基丙烯酸缩水甘油酯进行改性后，其侧链带有双键基团，使原本难以聚合的聚氨基酸聚合形成水凝胶。步骤(2)中，向聚氨基酸溶液体系中引入二硫苏糖醇作为交联剂，通过烯烃-硫醇点击化学反应形成聚合物网络。通过共价交联形成的水凝胶力学性能好，韧性强，且孔径大小适中。能更好的满足受损软骨修复的需要。
2.形成水凝胶的主体部分是具有优异的细胞/组织亲和性的天然聚氨基酸，且可以完全降解。因此，本发明制备的水凝胶能够完全生物降解，且细胞/组织亲和性好。有利于软骨组织的生长和修复。
3.水凝胶网络中含有巯基封端化合物作为交联剂，巯基封端的二硫苏糖醇可以和步骤(3)中引入的生长因子中的巯基形成动态二硫键，将因子负载在凝胶中。这种动态的结合方式既能解决突释及局部过量毒性问题，同时也避免了生长因子会因公交反应而受到破坏，其活性保持良好，能更好的诱导软骨组织的生长与修复。
附图说明
图1是实施例1制备得到的氨基酸水凝胶的降解性能图。其中不同的折线表示不同浓度的水凝胶的降解曲线，表明凝胶降解速率是可以进行调控的。
图2是实施例1制备得到的氨基酸水凝胶的溶胀性能图。
图3是实施例1制备得到的氨基酸水凝胶的电镜图。
图4是实施例1制备得到的氨基酸水凝胶的电镜图。
图5是实施例1制备得到的氨基酸水凝胶的电镜图。
图6是实施例1制备得到的氨基酸水凝胶的电镜图。
图7是实施例1制备得到的氨基酸水凝胶的培养细胞的增殖实验图，展现了凝胶良好的细胞相容性。
图8是实施例1制备得到的氨基酸水凝胶培养的细胞的死活染色图。其中的亮点表示存活的细胞。
图9是细胞在实施例1制备得到的氨基酸水凝胶中的三维培养死活染色图。其中图a为培养了3天的细胞，图b为培养了1天的细胞。
图10是实施例1制备得到的氨基酸水凝胶的诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化图。其中a是蛋白聚糖相关基因不同时间的相对表达量，b是二型胶原相关基因在不同时间的相对表达量。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明具体实施方案。
实施例1
(1)聚谷氨酸的双键功能化：
将聚谷氨酸溶于去离子水得到聚谷氨酸质量浓度为1％的溶液，然后向溶液中滴加聚谷氨酸0.5倍摩尔量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后将反应液的ph调到4.5，在50℃下搅拌反应6小时，待反应液冷却后，将反应液用水稀释至原体积的2倍，透析5天、干燥1天后得到双键功能化的聚谷氨酸。
(2)聚谷氨酸水凝胶的制备：
将双键功能化的聚谷氨酸溶于磷酸缓冲溶液中，得到质量浓度为5％的双键功能化聚谷氨酸溶液，然后与含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液混合，迅速震荡混匀。然后静置，很快(几十秒内)就可以成胶。含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液中四硼酸钠的质量浓度为0.01％，二硫苏糖醇的质量浓度为0.1％。
(3)生长因子的吸附：
用氯化钠溶液对聚谷氨酸水凝胶进行清洗，再用体积浓度为99％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水，清洗、脱水的操作进行3次，然后将聚谷氨酸水凝胶转移到转化生长因子tgf-β1浓度为0.2μg/ml的磷酸盐缓冲溶液中，溶胀后即得。
实施例2
(1)聚谷氨酸的双键功能化：
将聚谷氨酸溶于去离子水得到聚谷氨酸质量浓度为0.1％的溶液，然后向溶液中滴加聚谷氨酸1倍摩尔量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后将反应液的ph调到3.5，在30℃下搅拌反应8小时，待反应液冷却后，将反应液用水稀释至原体积的4倍，透析1天、干燥1天后得到双键功能化的聚谷氨酸。
(2)聚谷氨酸水凝胶的制备：
将双键功能化的聚谷氨酸溶于磷酸缓冲溶液中，得到质量浓度为0.5％的双键功能化聚谷氨酸溶液，然后与含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液混合，迅速震荡混匀。然后静置，很快(几十秒内)就可以成胶。含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液中四硼酸钠的质量浓度为0.05％，二硫苏糖醇的质量浓度为1％。
(3)生长因子的吸附：
用去离子水对聚谷氨酸水凝胶进行清洗，再用体积浓度为80％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水，清洗、脱水的操作进行3次，然后将聚谷氨酸水凝胶转移到转化生长因子tgf-β2浓度为0.02μg/ml的磷酸盐缓冲溶液中，溶胀后即得。
实施例3
(1)聚谷氨酸的双键功能化：
将聚谷氨酸溶于去离子水得到聚谷氨酸质量浓度为3％的溶液，然后向溶液中滴加聚谷氨酸5倍摩尔量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后将反应液的ph调到5，在4℃下搅拌反应12小时，待反应液冷却后，将反应液用水稀释至原体积的10倍，透析7天、干燥3天后得到双键功能化的聚谷氨酸。
(2)聚谷氨酸水凝胶的制备：
将双键功能化的聚谷氨酸溶于磷酸缓冲溶液中，得到质量浓度为10％的双键功能化聚谷氨酸溶液，然后与含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液混合，迅速震荡混匀。然后静置，很快(几十秒内)就可以成胶。含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液中四硼酸钠的质量浓度为0.1％，二硫苏糖醇的质量浓度为0.5％。
(3)生长因子的吸附：
用磷酸盐缓冲溶液对聚谷氨酸水凝胶进行清洗，再用体积浓度为50％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水，清洗、脱水的操作进行3次，然后将聚谷氨酸水凝胶转移到转化生长因子tgf-β3浓度为0.05μg/ml的氯化钠溶液中，溶胀后即得。
实施例4
(1)聚谷氨酸的双键功能化：
将聚谷氨酸溶于去离子水得到聚谷氨酸质量浓度为10％的溶液，然后向溶液中滴加聚谷氨酸0.1倍摩尔量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后将反应液的ph调到6，在10℃下搅拌反应10小时，待反应液冷却后，将反应液用水稀释至原体积的8倍，透析3天、干燥3天后得到双键功能化的聚谷氨酸。
(2)聚谷氨酸水凝胶的制备：
将双键功能化的聚谷氨酸溶于磷酸缓冲溶液中，得到质量浓度为15％的双键功能化聚谷氨酸溶液，然后与含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液混合，迅速震荡混匀。然后静置，很快(几十秒内)就可以成胶。含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液中四硼酸钠的质量浓度为0.5％，二硫苏糖醇的质量浓度为0.8％。
(3)生长因子的吸附：
用磷酸盐缓冲溶液对聚谷氨酸水凝胶进行清洗，再用体积浓度为99％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水，清洗、脱水的操作进行3次，然后将聚谷氨酸水凝胶转移到骨形态发生蛋白bmp-2浓度为0.1μg/ml的水溶液中，溶胀后即得。
实施例5
(1)聚谷氨酸的双键功能化：
将聚谷氨酸溶于去离子水得到聚谷氨酸质量浓度为0.5％的溶液，然后向溶液中滴加聚谷氨酸10倍摩尔量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后将反应液的ph调到4.5，在80℃下搅拌反应3小时，待反应液冷却后，将反应液用水稀释至原体积的6倍，透析5天、干燥5天后得到双键功能化的聚谷氨酸。
(2)聚谷氨酸水凝胶的制备：
将双键功能化的聚谷氨酸溶于磷酸缓冲溶液中，得到质量浓度为1％的双键功能化聚谷氨酸溶液，然后与含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液混合，迅速震荡混匀。然后静置，很快(几十秒内)就可以成胶。含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液中四硼酸钠的质量浓度为1％，二硫苏糖醇的质量浓度为1％。
(3)生长因子的吸附：
用磷酸盐缓冲溶液对聚谷氨酸水凝胶进行清洗，再用体积浓度为99％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水，清洗、脱水的操作进行3次，然后将聚谷氨酸水凝胶转移到骨形态发生蛋白bmp-7浓度为0.2μg/ml的磷酸盐缓冲溶液中，溶胀后即得。
实施例6
(1)聚谷氨酸的双键功能化：
将聚谷氨酸溶于去离子水得到聚谷氨酸质量浓度为1％的溶液，然后向溶液中滴加聚谷氨酸0.5倍摩尔量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后将反应液的ph调到4.5，在50℃下搅拌反应6小时，待反应液冷却后，将反应液用水稀释至原体积的5倍，透析5天、干燥5天后得到双键功能化的聚谷氨酸。
(2)聚谷氨酸水凝胶的制备：
将双键功能化的聚谷氨酸溶于磷酸缓冲溶液中，得到质量浓度为5％双键化聚谷氨酸溶液，然后与含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液混合，迅速震荡混匀。然后静置，很快(几十秒内)就可以成胶。含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液中四硼酸钠的质量浓度为1％，二硫苏糖醇的质量浓度为1％。
(3)生长因子的吸附
用磷酸盐缓冲溶液对聚谷氨酸水凝胶进行清洗，再用体积浓度为99％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水，清洗、脱水的操作进行3次，然后将聚谷氨酸水凝胶转移到胰岛素生长因子igf-i浓度为0.2μg/ml的磷酸盐缓冲溶液中，溶胀后即得。
实施例7
(1)聚谷氨酸的双键功能化：
将聚谷氨酸溶于去离子水得到聚谷氨酸质量浓度为1％的溶液，然后向溶液中滴加聚谷氨酸0.5倍摩尔量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后将反应液的ph调到4.5，在50℃下搅拌反应6小时，待反应液冷却后，将反应液用水稀释至原体积的5倍，透析5天、干燥5天后得到双键功能化的聚谷氨酸。
(2)聚谷氨酸水凝胶的制备：
将双键功能化的聚谷氨酸溶于磷酸缓冲溶液中，得到质量浓度为5％双键化聚谷氨酸溶液，然后与含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液混合，迅速震荡混匀。然后静置，很快(几十秒内)就可以成胶。含有二硫苏糖醇的四硼酸钠水溶液中四硼酸钠的质量浓度为2％，二硫苏糖醇的质量浓度为1％。
(3)生长因子的吸附
用磷酸盐缓冲溶液对聚谷氨酸水凝胶进行清洗，再用体积浓度为99％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水，清洗、脱水的操作进行3次，然后将聚谷氨酸水凝胶转移到胰岛素生长因子igf-ii浓度为0.2μg/ml的磷酸盐缓冲溶液中，溶胀后即得。
实施例8
将实施例1制备得到的氨基酸水凝胶冻干并进行称重并且记为w0，然后将干凝胶放入模拟体液中，每隔24小时将凝胶从模拟体液中取出再次冻干，记下干重为wt，直至凝胶降解完毕。结果如图1所示。从图1可以看出，凝胶可以实现可控降解，通过凝胶固含量差异性的设计，调控凝胶具体的降解时间，从而实现有效物质的可控释放，避免局部突释。
将实施例1制备得到的氨基酸水凝胶冻干并进行称重并且记为w0，然后将干凝胶放入磷酸盐缓冲溶液中，每隔一段时间取出称重，直至重量不再发生变化，记为wt。结果如图2所示。凝胶先发生溶胀，继而进行降解。实现有效因子的释放。
从图3-图6的电镜图中可以看出，凝胶内部的多孔网络，实现对有效因子的有效负载。并且这种多孔网络的结构，孔隙率，孔径也是可以很好的进行调控。
将实施例1制备得到的氨基酸水凝胶铺于96孔板中，在上面培养细胞。向每孔中加入一定量的cck-8试剂盒液体，然后用酶标仪测量490nm下的吸光度，对照组为matrigel，比较二者的吸光度。另将细胞培养于6孔板中，加入ao/eb染液，于荧光显微镜下观察。活细胞发出绿色荧光，死细胞发出红色荧光。结果如图7、8所示。从图7、8可以看出，凝胶具有极好的细胞相容性，二维培养过程中(cck-8，dead/live)发现细胞存活率很高。
将实施例1制备得到的氨基酸水凝胶中包载骨髓间充质干细胞，其过程如下，成胶前将骨髓间充质干细胞用凝胶前驱体溶液混匀，然后与交联剂混匀成胶。培养一段时间后，用ao/eb染色，然后在激光荧光共聚焦显微镜下观察。活细胞发出绿色荧光，死细胞发出红色荧光。结果如图9所示。图9中的b图首先可以发现细胞可以在凝胶内部很好的存活下来，其次可以实现有效的增殖。表明了凝胶内部也是适合细胞进行生长，更一步的验证了凝胶的细胞相容性。
将实施例1制备得到的氨基酸水凝胶培养间充质干细胞。分别在第7天和第14天提取细胞rna，进行rt-qpcr检测相关基因的表达。结果如图10所示。a，b表明了间充质干细胞体外培养的关于多糖以及二型胶原的一个表达。表明细胞在凝胶内部生长过程中，有效因子仍可以发挥其促软骨分化的作用，有效因子仍具有较高的活性。
综上所述，本发明制备可注射型自愈合聚谷氨酸水凝胶和应用简便有效，且成本相对较低，在未来的临床应用方面有极大前景。
需要说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非用以限定本发明的权利范围；同时以上的描述，对于相关技术领域的专门人士应可明了及实施，因此其它未脱离本发明所揭示的精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含在申请专利范围中。
1.一种用于软骨修复的可注射聚氨基酸水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备双键功能化的聚氨基酸；
(2)制备聚氨基酸水凝胶：
将步骤(1)得到的所述双键功能化的聚氨基酸溶于缓冲溶液中，并加入巯基封端的交联剂的溶液，混匀后静置，即得所述聚氨基酸水凝胶；
(3)生长因子的吸附：
对所述聚氨基酸水凝胶进行清洗、脱水，之后转移到含有生长因子的溶液中进行溶胀，即得所述用于软骨修复的可注射聚氨基酸水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述巯基封端的交联剂为二硫苏糖醇。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述巯基封端的交联剂的溶液为巯基封端的交联剂的四硼酸钠溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括如下步骤：
向聚氨基酸的水溶液中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，调节ph为3.5～6.0，于4℃～80℃，搅拌反应3～12小时，随后，将反应溶液用水稀释至原体积的2～10倍，进行透析、干燥后得到所述双键化功能的聚氨基酸；所述甲基丙烯酸缩水甘油酯的用量为所述聚氨基酸的0.1～10倍摩尔量。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的聚氨基酸为聚谷氨酸。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的含有生长因子的溶液中生长因子的浓度为0.02～0.2μg/ml。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的含有生长因子的溶液为含有生长因子的磷酸缓冲溶液、含有生长因子的氯化钠溶液或生长因子的水溶液。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的生长因子为转化生长因子、骨形态发生蛋白或胰岛素生长因子。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述转化生长因子为tgf-β1、tgf-β2或tgf-β3；所述骨形态发生蛋白为bmp-2或bmp-7；所述胰岛素生长因子为igf-i或igf-ii。
10.权利要求1-9任一所述制备方法制备得到的用于软骨修复的可注射聚氨基酸水凝胶。
技术总结