本发明属于分子科技领域，涉及一种环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料及其制备方法和应用。
背景技术：
半胱氨酸是人体中一种非必需氨基酸，它存在于角蛋白中。角蛋白是构成指甲、脚趾甲、皮肤和头发的主要蛋白质，有助于产生胶原蛋白，保持皮肤弹性和纹理。对肝实质细胞有保护作用，并能刺激造血功能，增加白细胞和促进皮肤修复。它的缺乏可引起发色丧失、银屑病、水肿、嗜睡、肝损伤、造血减少、白细胞减少等问题。因此，它在蛋白质合成、解毒和代谢中发挥重要作用。然而，体内半胱氨酸的异常浓度可能与先天性代谢紊乱和胱氨酸尿症有关。半胱氨酸的定量对人体健康具有重要意义。对各种疾病的准确预诊断具有重要价值。
许多研究人员一直致力于开发敏感和高选择性检测半胱氨酸的方法，这些检测方法主要应用在环境、医药、生物样品和前体等领域，诸如毛细管电泳、高效液相色谱法、质谱，光分析，电化学伏安法，比色法等。除比色法外，其他方法是基于氧化还原化学或显色团/荧光团的衍生物进行检测，检测过程涉及诸如高温、特定仪器、使用有毒和危险试剂、需要加强对微量成分的检测以及消除基本干扰等条件。然而，比色法是基于金属纳米粒子的颜色变化进行检测，操作简单，用肉眼检测和分析即可实现，具有高灵敏度和高选择性。例如，通过溶液颜色的变化即可判断医药样品中是否存在指定检测的物质。
中国专利cn105784616a公布了“基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法”。该专利通过向双金属纳米团簇溶液中加入可能含有半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的待测样品、柠檬酸钠、过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，观察所形成的混合反应体系在可见光波段的吸光值，实现对待测样品中的指定物质的检测。但此方法需要使用致癌物过氧化氢参与双金属纳米团簇与半胱氨酸或乙酰半胱氨酸之间分子识别的进程，在使用过程中如操作不当可能会对呼吸道及皮肤造成腐蚀损伤。中国专利cn109645805a公布了“一种免标快速检测半胱氨酸的新方法”。主要基于tmb在钴掺杂的碳纳米材料存在情况下加入半胱氨酸，再观察其紫外吸收值的变化进行检测。但此方法需要使用具有强氧化性、强腐蚀性的硫酸来终止钴掺杂的碳纳米材料与半胱氨酸分子的识别进程，检测过程存在一定的安全隐患，操作困难。美国专利us9201075公布了“colorimetricandfluorometricdeterminationofhomocysteineandcysteine”。基于4-二甲基氨基肉桂醛等指示剂，利用可见、紫外吸收光谱法进行比色测定半胱氨酸的浓度。此方法中使用的指示剂对皮肤和眼睛有刺激作用。目前大部分已报道的检测半胱氨酸分子的识别环境存在一定毒性，难以符合当今时代对环保的需求。
技术实现要素：
针对上述的问题，本发明的目的在于提供一种环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料。
本发明的另一目的在于提供一种上述环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料的制备方法。该方法旨在解决在检测半胱氨酸过程中使用有毒药剂的问题，同时该制备方法所制得的有机/无机杂化材料能快速、高灵敏度、高选择性地对半胱氨酸进行比色检测。
本发明的再一目的在于提供一种上述环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料，所述的有机/无机杂化材料是将硝酸银溶液、氢氧化钠溶液和氨水均匀混合，制得银氨溶液；然后将木浆、tempo、溴化钠、次氯酸钠溶液混合，调节ph在9～11，在ph值没有进一步变化后，将ph值调至7，对混合溶液透析后的溶液进行机械搅拌，制得tempo预处理的纳米纤维素溶液；将银氨溶液加入到tempo预处理的纳米纤维素溶液，将混合溶液在60～90℃下水浴加热制得；述的有机/无机杂化材料是tempo预处理的纳米纤维素和银纳米粒子杂化材料，所述tempo预处理的纳米纤维素的宽度为5～10nm，长度为150～250nm；所述的有机/无机杂化材料中银的粒径为5～30nm；所述有机/无机杂化材料在ph为4.5～5.5时，其吸收波长为390～410nm。
优选地，所述硝酸银溶液的浓度为1～3wt％，所述氢氧化钠溶液的浓度为1～3wt％，所述氨水溶液的浓度为1～3wt％；所述硝酸银溶液、氢氧化钠溶液和氨水溶液的体积比为1：(2～5)：(12～30)。
优选地，所述木浆为漂白针叶木浆或阔叶木木浆；所述漂白针叶或阔叶木浆的纯纤维素的含量为95～99％，裂断长度为7.4～7.7km，粘度为15～18mpa.s。
优选地，所述木浆、tempo、溴化钠的质量比为(0.5～1)：(0.01～0.02)：(0.05～0.15)；所述次氯酸钠溶液的浓度为5～8mmol/l；所述木浆、tempo和溴化钠的总质量与次氯酸钠溶液的体积比为(0.56～1.17)g：(20～40)ml。
优选地，所述透析用透析袋的分子量为12000～14000da；所述透析的时间为5～7天；所述机械搅拌的速率为35000～40000rpm。
优选地，所述银氨溶液和tempo预处理的纳米纤维素溶液的体积比为(2000～4000)μl：(26～28)ml，所述tempo预处理的纳米纤维素溶液的浓度为1～2mol/l。
所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料的制备方法，包括以下具体步骤：
s1.将硝酸银溶液、氢氧化钠溶液、氨水溶液均匀混合制备银氨溶液；
s2.将木浆、tempo、溴化钠、次氯酸钠混合，调节ph在9～11，在ph值没有进一步变化后，将ph值调至7，并用透析袋对混合溶液透析，对透析后的溶液进行机械搅拌，制得tempo预处理的纳米纤维素溶液；
s3.将银氨溶液加入到tempo预处理的纳米纤维素溶液中，将混合溶液在60～90℃下水浴加热30～90min，得到tempo预处理的纳米纤维素和银纳米粒子的有机/无机杂化材料。
所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料在复方氨基酸注射液或氨基酸营养输液医药样品检测中的应用。
优选地，所述样品检测时是将所述的有机/无机杂化材料中加入氯化钠溶液和标准半胱氨酸溶液混合均匀，在20～40℃下充分反应后，分别测定所获的各混合反应体系在可见光波段的吸光值，由此建立半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；以稀释处理过后的复方氨基酸注射液或氨基酸营养输液代替标准半胱氨酸溶液，检测出医药样品中半胱氨酸的浓度。
优选地，所述氯化钠溶液的浓度为50～1000mmol/l。
与现有的技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明利用水浴加热方法对有机物tempo氧化法预处理的纳米纤维素和无机物银纳米粒子进行了杂化，合成有机/无机杂化材料。由于tempo氧化法预处理的纳米纤维素上携带负电荷，在静电斥力作用下，该纳米纤维素能够在水溶液中均匀分布。因此，装载于纳米纤维素上的银纳米粒子也能均匀分布，可以解决银纳米粒子容易积聚沉淀、稳定性差的问题。
2.本发明的有机/无机杂化材料中有机物tempo氧化法预处理的纳米纤维素装载银纳米粒子所达成的均匀分布状态，更利于捕捉结合半胱氨酸分子，提高检测半胱氨酸的灵敏度。
3.本发明的有机/无机杂化材料对半胱氨酸具有灵敏度高、响应时间短、合成能耗低、高选择性、无需对样品进行预处理、稳定性好等优点，检测半胱氨酸的线性范围为10～1000nm，灵敏度可以达到3～5nmol/l，响应时间为3～5min，可靶向识别半胱氨酸分子。可应用于复方氨基酸注射液、氨基酸营养输液、尿液等医药样品中半胱氨酸的检测。
4.本发明所合成的有机/无机杂化材料在检测半胱氨酸分子进程中，无需有毒药剂的加入，确保检测识别进程绿色环保。
附图说明
图1为实施例1的tempo预处理的纳米纤维素和银纳米粒子的有机/无机杂化材料中银纳米粒子的微观形貌图。
图2为实施例1中半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线图。
图3为实施例2中对于20种氨基酸的选择性测试图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.将体积比为1:5:30的2wt％硝酸银溶液、2wt％氢氧化钠溶液、2wt％氨水溶液依次加入均匀混合，制备银氨溶液。
2.将1g的漂白针叶木浆(纯纤维素含量为99％，裂断长度为7.7km，粘度为17mpa.s)、0.015g2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(tempo)、0.1g溴化钠、5mmol/l的次氯酸钠混合，控制溶液的ph值为11，在混合溶液ph值没有进一步变化后，将混合溶液ph调至7，并用分子量为14000da的透析袋对混合溶液透析5天。对透析后的溶液进行转速为37500rpm的机械搅拌，制备有机物tempo氧化法预处理的纳米纤维素。所得的有机物tempo氧化法预处理的纳米纤维素宽度为7.5nm，长度为200nm。
3.取3000μl的银氨溶液加入至2mol/l的tempo氧化法预处理的纳米纤维素，在75℃下水浴加热60min，得到由有机物tempo氧化法预处理的纳米纤维素和银纳米粒子的有机/无机杂化材料。当ph为5时，有机/无机杂化材料的最大吸收波长为400nm。储存该杂化材料的容器用锡箔纸完全包裹、避光保存，存放温度为20℃。
图1为实施例1的有机/无机杂化材料中无机物银纳米粒子的微观形貌图。从图1中可知，银纳米粒子的粒径为20nm，微观形貌为类圆形。在上述2ml的有机/无机杂化材料中加入1000mmol/l的氯化钠溶液和1ml浓度为10～1000nmol/l的标准半胱氨酸溶液，混合均匀，在20℃下充分反应后，分别测定所获的各混合反应体系在可见光波段的吸光值，由此建立半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线。图2为实施例1中半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线图。如图2所示，检测半胱氨酸的灵敏度可达到3.3nmol/l，检测线性范围为10～1000nmol/l。将复方氨基酸注射液用超纯水稀释1000倍。参照上述操作，以稀释处理过后的复方氨基酸注射液代替标准半胱氨酸溶液，可检测出复方氨基酸注射液中半胱氨酸的浓度。说明该有机/无机杂化材料对半胱氨酸灵敏度可以达到3～5nmol/l，响应时间为3～5min，应用于复方氨基酸注射液中半胱氨酸的浓度检测。
实施例2
1.将体积比为1:2:12的质量分数为2wt％硝酸银溶液、2wt％氢氧化钠溶液、2wt％氨水溶液依次加入均匀混合，制备银氨溶液。
2.将0.5g的漂白针叶或阔叶木浆(漂白针叶或阔叶木浆的纯纤维素含量为95％，裂断长度为7.4km，粘度为15mpa.s)、0.01gtempo、0.05g溴化钠、7.5mm的次氯酸钠混合，控制溶液的ph值为9，在混合溶液ph值没有进一步变化后，将混合溶液ph调至7，并用分子量为12000da的透析袋对混合溶液透析7天。对透析后的溶液进行转速为35000rpm的机械搅拌，制备有机物tempo氧化法预处理的纳米纤维素，其tempo氧化法预处理的纳米纤维素宽度为10nm，长度为250nm。
3.取4000μl的银氨溶液加入至1mol/l的tempo氧化法预处理的纳米纤维素，在90℃下水浴加热30min，得到由有机物tempo氧化法预处理的纳米纤维素和银纳米粒子的有机/无机杂化材料。其中，银纳米粒子的粒径大小为5nm，微观形貌为类圆形。储存该有机/无机杂化材料的容器用锡箔纸完全包裹、避光保存，存放温度为15℃。当ph为4.5时，有机/无机杂化材料的最大吸收波长为390nm。
配制浓度均为1mmol/l的丙氨酸(ala)、精氨酸(arg)、天冬酰胺(asn)、天冬氨酸(asp)、半胱氨酸(cys)、谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)、甘氨酸(gly)、组氨酸(his)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、赖氨酸(lys)、蛋氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、脯氨酸(pro)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、色氨酸(try)、酪氨酸(tyr)、缬氨酸(val)溶液。在2ml的有机/无机杂化材料中加入500mmol/l的氯化钠溶液和1ml20种上述氨基酸溶液，混合均匀，在40℃下充分反应后，分别测定所获的各混合反应体系在可见光波段的吸光值，并进行对比，其最终检测结果如图3所示。从图3中可知，除半胱氨酸以外，其余19种氨基酸与该有机/无机杂化材料之间无显著的反应，说明制得的有机/无机杂化材料对半胱氨酸有高选择性的检测。
实施例3
1.将体积比为1:3:18的质量分数为2wt％硝酸银溶液、2wt％氢氧化钠溶液、2wt％氨水溶液依次加入均匀混合制备银氨溶液。
2.将0.5g的漂白针叶木浆(纯纤维素含量为97％，裂断长度为7.55km，粘度为18mpa.s)、0.02gtempo、0.15g溴化钠、10mmol/l的次氯酸钠混合，控制溶液的ph值为10，在混合溶液ph值没有进一步变化后，将混合溶液ph调至7，并用分子量为13000da的透析袋对混合溶液透析6天。对透析后的溶液进行转速为40000rpm的机械搅拌，制备有机物tempo氧化法预处理的纳米纤维素，其tempo氧化法预处理的纳米纤维素宽度为5nm，长度为150nm。
3.取2000μl的银氨溶液加入至1.5mol/l的tempo氧化法预处理的纳米纤维素，在60℃下水浴加热90min，得到由有机物tempo氧化法预处理的纳米纤维素和银纳米粒子的有机/无机杂化材料。储存该有机/无机的容器用锡箔纸完全包裹、避光保存，存放温度为25℃。其中，银纳米粒子的粒径大小为30nm，微观形貌为类圆形。调整ph为5.5时，有机/无机杂化材料的最大吸收波长为410nm。
在2ml的有机/无机杂化材料中加入50mmol/l的氯化钠溶液和1ml浓度为10～1000nm的标准半胱氨酸溶液，混合均匀，在30℃下充分反应后，分别测定所获的各混合反应体系在可见光波段的吸光值，由此建立半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线。取1ml尿液样本，用1ml乙腈稀释，除去尿液中蛋白质和其他物质的干扰后，在20℃下以12000rpm的转速离心10min。将上清液在50℃下真空干燥10h后，用100l水对样品进行重新溶解。参照上述操作，以稀释处理过后的尿液样本代替半胱氨酸溶液，可检测出尿液中半胱氨酸的浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料，其特征在于，所述的有机/无机杂化材料是将硝酸银溶液、氢氧化钠溶液和氨水均匀混合，制得银氨溶液；然后将木浆、tempo、溴化钠、次氯酸钠溶液混合，调节ph在9～11，在ph值没有进一步变化后将ph值调至7，对混合溶液透析后的溶液进行机械搅拌，制得tempo预处理的纳米纤维素溶液；将银氨溶液加入到tempo预处理的纳米纤维素溶液，将混合溶液在60～90℃下水浴加热制得；所述的有机/无机杂化材料是tempo预处理的纳米纤维素和银纳米粒子杂化材料，所述tempo预处理的纳米纤维素的宽度为5～10nm，长度为150～250nm；所述的有机/无机杂化材料中银的粒径为5～30nm；所述有机/无机杂化材料在ph为4.5～5.5时，其吸收波长为390～410nm。
2.根据权利要求1所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料，其特征在于，所述硝酸银溶液的浓度为1～3wt％，所述氢氧化钠溶液的浓度为1～3wt％，所述氨水的浓度为1～3wt％；所述硝酸银溶液、氢氧化钠溶液和氨水的体积比为1：(2～5)：(12～30)。
3.根据权利要求1所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料，其特征在于，所述木浆为漂白针叶木浆或阔叶木木浆；所述漂白针叶或阔叶木浆的纯纤维素的含量为95～99％，裂断长度为7.4～7.7km，粘度为15～18mpa.s。
4.根据权利要求1所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料，其特征在于，所述木浆、tempo、溴化钠的质量比为(0.5～1)：(0.01～0.02)：(0.05～0.15)；所述次氯酸钠溶液的浓度为5～8mmol/l；所述木浆、tempo和溴化钠的总质量与次氯酸钠溶液的体积比为(0.56～1.17)g：(20～40)ml。
5.根据权利要求1所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料，其特征在于，所述透析用透析袋的分子量为12000～14000da；所述透析的时间为5～7天；所述机械搅拌的速率为35000～40000rpm。
6.根据权利要求1所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料，其特征在于，所述银氨溶液和tempo预处理的纳米纤维素溶液的体积比为(2000～4000)μl：(26～28)ml，所述tempo预处理的纳米纤维素溶液的浓度为1～2mol/l。
7.根据权利要求1-6任一项所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
s1.将硝酸银溶液、氢氧化钠溶液和氨水均匀混合制备银氨溶液；
s2.将木浆、tempo、溴化钠、次氯酸钠混合，调节ph在9～11，在ph值没有进一步变化后，将ph值调至7，并用透析袋对混合溶液透析，对透析后的溶液进行机械搅拌，制得tempo预处理的纳米纤维素溶液；
s3.将银氨溶液加入到tempo预处理的纳米纤维素溶液中，将混合溶液在60～90℃下水浴加热30～90min，得到tempo预处理的纳米纤维素和银纳米粒子的有机/无机杂化材料。
8.权利要求1-7任一项所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料在复方氨基酸注射液或氨基酸营养输液医药样品检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料在复方氨基酸注射液或氨基酸营养输液医药样品检测中的应用，其特征在于，所述样品检测时是将权利要求1-7任一项所述的有机/无机杂化材料中加入氯化钠溶液和标准半胱氨酸溶液混合均匀，在20～40℃下充分反应后，分别测定所获的各混合反应体系在可见光波段的吸光值，由此建立半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；以稀释处理过后的复方氨基酸注射液或氨基酸营养输液代替标准半胱氨酸溶液，检测出医药样品中半胱氨酸的浓度。
10.根据权利要求9所述的环保检测半胱氨酸的有机/无机杂化材料在复方氨基酸注射液或氨基酸营养输液医药样品检测中的应用，其特征在于，所述氯化钠溶液的浓度为50～1000mmol/l。
技术总结