本发明涉及对丁香假单胞菌角斑病变种(pseudomonassyringaepv.lachrymans)有抗性的黄瓜植物(cucumissativusl.)，该病原体在黄瓜中导致角叶斑疾病。本发明还涉及与该抗性关联的标记以及标记用于鉴定和/或开发抗性植物的用途。本发明还涉及这类植物的种子和后代以及源自这类植物并用于获得这类植物的繁殖材料。此外，本发明涉及用于产生、鉴定和选择假单胞菌抗性黄瓜植物，以及用于产生杂交黄瓜种子的方法。
黄瓜(cucumissativus)种的黄瓜植物(或也称为黄瓜)属于葫芦(cucurbit)科，科学命名为葫芦科(cucurbitaceae)。该物种是黄瓜属(cucumis)的一部分，黄瓜属包含重要的食物作物黄瓜，还有许多瓜类型(其中多数包括在甜瓜(cucumismelo)种中)以及其他一些不太为人所知的物种。黄瓜是一年生的草本开花植物物种，被认为起源于亚洲。
黄瓜植物早已被驯化且在非洲和亚洲国家已经栽培了数千年。黄瓜是具有七对染色体的二倍体植物。栽培的黄瓜植株具有雄花和雌花，它们可以一起存在于雌雄同株的植物中，但是在当今的栽培品种中，通常使用纯雌株(全部雌性)的植物。黄瓜易于交叉授粉，但是当同一植物中有雌花和雄花时，黄瓜也可以自花授粉。目前全世界栽培有各种各样的黄瓜类型，通常大小、颜色和皮类型不同。黄瓜生产在相对温暖的气候下最成功，其偏好温度为约18–25℃。几种病虫害可影响黄瓜的产量，包括几种通常由昆虫传播的病毒，以及细菌和真菌病。可能威胁黄瓜收成的这些主要病害之一是角叶斑。
角叶斑是葫芦科的一种严重疾病，是由丁香假单胞菌角斑病变种引起的。该细菌性疾病可发生在大多数葫芦植物上，包括黄瓜、甜瓜、南瓜和西葫芦。该病在世界范围内分布，并已观察到在潮湿的环境下出现。丁香假单胞菌角斑病变种在24°至28℃之间最为活跃，并且偏好相对高的湿度(高于95％)。如该病名称所示的，由该病引起的叶斑点是有角的，因为周围的叶脉限制了斑点的扩大。最初的症状是棕褐色的水浸湿的斑点，可能被黄色的光晕包围。更老的斑点变白、干燥并从周围的健康组织撕裂，在受影响的叶子上留下不规则的孔。在潮湿的条件下，在病变处形成由细菌构成的白色乳状渗出物并干燥成薄的白色外壳。重度感染的叶子可能整体变黄。有或没有光晕的病变也可能出现在叶柄和茎上。在果实上，可能会出现较小的圆形斑点，这些斑点通常会裂开并变成白色，从而也允许其他病原体污染果实并导致果实腐烂。飞溅的雨水将细菌从土壤传播到植物的各个部位，并在植物之间传播。细菌还可以通过人、昆虫、栽培设备和收获者轻松地在田间传播。细菌可以在受污染的种子、土壤或患病植物的碎片中存活。
在黄瓜栽培中，需要对丁香假单胞菌角斑病变种具有抗性。因此，本发明的一个目的是提供一种对丁香假单胞菌角斑病变种具有抗性的黄瓜植物。
本发明的另一个目的是提供分子标记来鉴定和/或协助开发携带一种或多种引起丁香假单胞菌角斑病变种抗性的基因或qtl的黄瓜植物。如本专利申请中使用的术语“假单胞菌”、“角叶斑”和“丁香假单胞菌角斑病变种”可互换使用。
在产生本发明的研究中，鉴定和表征了黄瓜植物中的角叶斑(丁香假单胞菌角斑病变种)抗性。可以将具有角叶斑(丁香假单胞菌角斑病变种)抗性的黄瓜植物用于开发商业化的高端黄瓜品种。开发了对丁香假单胞菌角斑病变种有抗性的黄瓜植物。
在产生本发明的研究中，表征了存在于属于内部育种系的黄瓜植物中的丁香假单胞菌角斑病变种抗性。使用这些抗性植物完成了qtl图谱研究来鉴定引起对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性的遗传区域。在该研究中发现，对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性受到位于不同染色体上的一个基因和任选地几个次要qtl(数量性状基因座)的调控。具有该基因的突变体等位基因和任选地该qtl的一个或多个次要突变体等位基因的植物显示出对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。进一步表征了牵涉丁香假单胞菌角斑病变种抗性的缺失/存在的该基因的突变体等位基因和该qtl的突变体等位基因。牵涉对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的存在的基因是赤霉素-20-氧化酶基因。
本发明涉及一种黄瓜植物，该黄瓜植物包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，该突变体等位基因赋予了该植物对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。该黄瓜赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因如在以下黄瓜植物中发现的，其代表性种子以保藏号ncimb42582保藏。
本文所指的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因是赤霉素-20-氧化酶基因的显性等位基因，其赋予对假单胞菌的抗性。因此，对丁香假单胞菌角斑病变种有抗性的本发明的植物可以纯合或杂合地包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因。
本发明的植物包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，其在某位置具有单核苷酸多态性(snp)，该位置上的snp导致赤霉素-20-氧化酶蛋白的野生型氨基酸序列的变化。单核苷酸多态性(snp)是个体植物之间dna序列中的单核苷酸变异。snp可以出现在基因的编码序列、基因的非编码区域或基因间区域中。编码区中的snp可以是同义的和非同义的。所谓的同义snp不影响蛋白质序列，而非同义的snp则改变蛋白质的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，赤霉素-20-氧化酶基因中的snp发现于seqidno:1的野生型核苷酸序列的第860位上，导致赤霉素-20-氧化酶蛋白的野生型氨基酸序列的变化。
在本发明的一个实施方案中，赤霉素-20-氧化酶蛋白的野生型氨基酸序列中的变化是在seqidno:3的野生型氨基酸序列第287位上的氨基酸取代。在本发明的一个实施方案中，该snp包含从鸟嘌呤到腺嘌呤的变化。在本发明的一个实施方案中，赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因包含seqidno:2。
野生型核苷酸序列seqidno:1、突变体核苷酸序列seqidno:2、野生型氨基酸序列seqidno:3和突变体氨基酸序列seqidno:4可见表1。
与突变体或修饰形式相反，野生型通常指物种、基因型或基因在自然界中最常见的典型形式的表型和/或基因型。在此上下文中，它指在黄瓜植物中存在时不会产生对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的赤霉素-20-氧化酶基因的核苷酸序列，以及赤霉素-20-氧化酶蛋白的编码氨基酸序列。
赤霉素-20-氧化酶基因序列中的snp导致赤霉素-20-氧化酶蛋白中从半胱氨酸(c)到酪氨酸(y)的氨基酸取代。在seqidno:3的黄瓜氨基酸序列的第287位发现了由本发明的核苷酸突变引起的氨基酸取代，得到氨基酸序列seqidno:4。氨基酸序列seqidno:3和seqidno:4可见表1。
该核苷酸突变被认为是非保守的，氨基酸变化可以被认为是非保守的。当编码dna序列中一个或多个碱基对的突变导致编码不同氨基酸的改变的密码子三联体时，就会发生蛋白质中的氨基酸变化。并非编码dna序列中的所有(点)突变都会导致氨基酸变化。编码序列中不导致氨基酸变化的突变称为“沉默突变”。其他突变称为“保守的”；它们导致一种氨基酸被具有可比性质的另一种氨基酸替换，从而使突变不太可能改变成熟蛋白的折叠或影响其功能。如本发明中一样，编码dna序列中的非保守突变导致氨基酸序列中的一个或多个变化。
如本文所用，“非保守氨基酸改变”是指一种氨基酸被具有不同化学性质的另一种氨基酸替换，所述不同化学性质可能导致所编码的蛋白质的稳定性降低、功能性和/或结构效果改变。
本发明的植物可具有处于纯合或杂合状态的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因。纯合植物和杂合植物都可以用作赤霉素-20-氧化酶基因突变体等位基因的潜在来源。当杂合地具有赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因的植物与另一种不显示该抗性的植物杂交时，杂交后代的至少一部分显示出对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。当非抗性植物与对赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因纯合的植物杂交时，全部后代将具有该抗性。
此外，根据本发明发现，除了位于6号染色体上的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因外，四个次要qtl的突变体等位基因也促进黄瓜植物对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
位于2号染色体上的一个qtl称为qtl2。在保藏物ncimb42582的种子中，qtl2位于侧翼标记m5007和m5609之间。标记m5007由序列seqidno:5和seqidno:6表示，标记m5609由seqidno:9和seqidno:10表示。在该保藏的种子中，赋予抗性的qtl2的等位基因与标记m5009的序列seqidno:8连锁。qtl2的易感性等位基因与如存在于序列seqidno:7中的snp连锁。qtl2位于标记的20cm或10cm或5cm内。
位于5号染色体上的一个qtl称为qtl3。在保藏物ncimb42582的种子中，qtl3位于侧翼标记m1000和m3418之间。标记m1000由序列seqidno:11和seqidno:12表示，标记m3418由序列seqidno:15和seqidno:16表示。在该保藏的种子中，赋予抗性的qtl3的等位基因与如存在于标记m2071的序列seqidno:14中的snp连锁。qtl3的易感性等位基因与如存在于序列seqidno:13中的snp连锁。qtl3位于标记的20cm或10cm或5cm内。
位于7号染色体上的一个qtl称为qtl4。在保藏物ncimb42582的种子中，qtl4位于侧翼标记m1520和m0459之间。标记m1520由序列seqidno:23和seqidno:24表示，标记m0459由序列seqidno:27和seqidno:28表示。在该保藏的种子中，赋予抗性的qtl4的等位基因与如存在于标记m5644的序列seqidno:26中的snp连锁。qtl4的易感性等位基因与如存在于序列seqidno:25中的snp连锁。qtl4位于标记的20cm或10cm或5cm内。
位于7号染色体上的一个qtl称为qtl5。在保藏物ncimb42582的种子中，qtl5位于侧翼标记m5843和m0205之间。标记m5843由序列seqidno:29和seqidno:30表示，标记m0205由序列seqidno:33和seqidno:34表示。在该保藏的种子中，赋予抗性的qtl5的等位基因与如存在于标记m5618的序列seqidno:32中的snp连锁。qtl5的易感性等位基因与如存在于序列seqidno:31中的snp连锁。qtl5位于标记的20cm或10cm或5cm内。
位于7号染色体上称为qtl5的qtl可能类似于乙烯响应转录因子样蛋白基因，缩写名称为erlf1_arath(at4g13040)。
如本文所定义的赋予抗性的qtl的等位基因也称为本发明的qtl的突变体等位基因。本发明的黄瓜植物优选包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因与本发明的qtl的一个或多个丁香假单胞菌角斑病变种突变体等位基因的组合。
qtl(数量性状基因座)包含植物基因组中产生目的性状的遗传信息。qtl可以包含基因或可以与控制该性状的基因紧密连锁。qtl基因座的变化与表型(在此具体的例子中为丁香假单胞菌角斑病变种抗性)的变化相关。当植物显示本发明的性状时，其基因组包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地促进本发明的性状的一个或多个qtl的突变体等位基因。
侧翼标记标示感兴趣的基因或qtl所在的区域的边界。它们不一定与由该基因/qtl导致的性状连锁。然而，本领域技术人员可以使用侧翼标记的序列信息来将这些标记定位在遗传图谱上，从而也可以确定遗传图谱上qtl/基因所处的目标区域/基因座。连锁的标记与感兴趣的基因或qtl连锁。这意味着连锁标记的dna序列所述位置足够接近产生一起遗传性状的基因。如果植物包含本发明的连锁标记的dna序列，则其对丁香假单胞菌角斑病变种具有抗性。
如本文所用，术语“等位基因”是基因或qtl的变体形式。基因或qtl的dna序列中的突变(包括snp)可导致不同形式，称为等位基因。等位基因可能编码略有不同的蛋白质型式，然后可能导致不同的表型性状。
在本申请的上下文中，单词“性状”是指植物的表型。特别地，单词“性状”是指本发明的性状，更具体地是指对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的性状。
如本文所用，术语“对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性”是指对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性的表型性状。为了确定丁香假单胞菌角斑病变种抗性的存在，可以实施生物测定。如本领域技术人员已知的，生物测定可以几种方式进行。实施例1描述了用于确定植物是否显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的一种合适的生物测定法。在该测试中，以下植物被认为是显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的一种且由此被视为本发明的植物：具有比没有赤霉素-20-氧化酶基因突变体等位基因任选地本发明的qtl的一个或多个突变体等位基因的黄瓜植物的同基因黄瓜植物的丁香假单胞菌角斑病变种抗性得分在1.0至5.0的级别上平均低至少1.0、低至少1.5、低至少2.0、低至少2.5、低至少3.5、低至少4.0、低至少4.5(按增加的优选度排序)的丁香假单胞菌角斑病变种抗性得分和任选地本发明的一个或多个qtl的突变体等位基因。同基因黄瓜植物是在基因型上相同但不具有赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和。
在上述测试中，不具有赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因或本发明的任何qtl的突变体等位基因的黄瓜植物的平均疾病得分为5.0，以1.0到5.0为等级范围。包含本发明的赤霉素-20氧化酶基因的突变体等位基因的黄瓜植物显示平均丁香假单胞菌角斑病变种抗性得分为3.0。如果另外存在选自本发明qtl的qtl的一个突变体等位基因，则黄瓜植物的平均抗性得分为2.5。如果另外存在选自本发明qtl的qtl的两个突变体等位基因，则平均得分为2.0。如果另外存在选自本发明qtl的qtl的三个突变体等位基因，则平均得分为1.5。如果另外存在选自本发明qtl的qtl的四个突变体等位基因，则平均丁香假单胞菌角斑病变种抗性得分为1.0。
本发明的植物可以是近交系、杂交种、双单倍体或分离种群的植物。如本文所用，近交系的植物是因三轮或更多轮自交或回交而得到的植物种群的植物，或是双单倍体的植物。近交系可以是例如用于生产商业杂交种的亲本系。
根据本发明的一方面，该植物是农艺学上优良的黄瓜植物。农艺学上优良的黄瓜植物可以是近交系或杂交种。在本发明的上下文中，农艺学上优良的黄瓜植物是具有以下基因型的植物，该基因型由于人为干预的定向杂交和选择而导致可区别的和期望的农艺学性状的积累，这使得生产者能够收获具有商业意义的产品。
如本文所用，杂交植物是具有不同基因型的两种不同植物之间杂交的结果。更特别地，杂交植物是两种不同近交系的植物之间杂交的结果，这类杂交植物可以例如是商业化的f1杂交品种的植物。
本发明进一步涉及黄瓜植物的细胞，该细胞包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，和任选地选自下组的qtl的一个或多个突变体等位基因：qtl2、qtl3、qtl4、qtl5，如本文中定义的；其中赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和所述qtl的突变体等位基因赋予对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性，且如从保藏于ncimb登录号ncimb42582下的种子生长的黄瓜植物中发现的。该细胞来自以下黄瓜植物，该黄瓜植物可通过将一种黄瓜植物与从保藏于登录号ncimb42582下的种子生长的黄瓜植物杂交，然后在获得的f1和/或f2中选择显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物来获得。
任选地，可以确认显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的所述黄瓜植物包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文所定义的qtl的突变体等位基因。
所述细胞可以是分离形式或者可以是完整植物或其部分的一部分。
本发明的细胞还可以是可用于再生本发明的新植物的可再生细胞。本发明植物的每个细胞均携带导致对丁香假单胞菌角斑病变种有抗性的遗传信息。如本文所用，遗传信息的存在是赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因以及任选地选自如本文所定义的qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的组的qtl的一个或多个突变体等位基因的存在。
本发明进一步涉及黄瓜植物用作农作物、用作种子来源、用作繁殖材料来源或用于消费的用途，所述黄瓜植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性，如从保藏于ncimb登录号ncimb42582下的种子生长的黄瓜植物中发现的。
本发明还涉及包含如本文定义的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因的黄瓜种子，其中从所述种子生长的黄瓜植物显示出对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。所述黄瓜种子可以另外包含本文定义的qtl的一个或多个突变体等位基因，其中从所述种子生长的黄瓜植物显示出对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。所述种子携带赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文定义的qtl的一个或多个突变体等位基因，当从种子中生长出植物时，其产生本发明的植物。
本发明还涉及保藏于ncimb登录号ncimb42582下的种子用于将对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性转移至另一株黄瓜植物中的用途。
本发明还涉及本发明的黄瓜植物或黄瓜种子的后代，其中所述后代包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文定义的qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的一个或多个突变体等位基因，且其中所述后代植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。这类后代可以是植物、细胞、组织或种子。如本文所用，术语“后代”用于指来自与本发明的植物杂交的第一代和所有后续后代，所述本发明的植物包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地选自本文中定义的qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的qtl的一个或多个突变体等位基因。后代还包括包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文定义的qtl的一个或多个突变体等位基因，并且是通过营养繁殖从本发明的其他植物或植物后代获得的植物。本发明的后代包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地选自如本文中定义的qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的组的qtl的一个或多个突变体等位基因，并显示出对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
本发明进一步涉及能够发育成本发明的黄瓜植物和/或衍生自本发明的黄瓜植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适合于有性繁殖、营养繁殖或适合于可再生细胞的组织培养，其中所述繁殖材料选自小孢子、花粉、卵巢、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、扦插、根、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生细胞、原生质体、细胞或其组织培养物，其中发育成的植物和/或由繁殖材料产生的植物显示出对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
本发明还涉及具有对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性的黄瓜植物的组织培养物，该组织培养物包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，其包含在seqidno:1的野生型核苷酸序列的第860位的snp，该组织培养物任选地包含选自下组的一个或多个突变体等位基因：qtl2、qtl3、qtl4和qtl5；其中qtl2位于2号染色体上；qtl3位于5号染色体上，qtl4位于7号染色体上，以及qtl5位于7号染色体上，所述突变体等位基因赋予对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性；且其中所述qtl的突变体等位基因如在其代表性种子保藏于保藏号ncimb42582下的黄瓜植物中发现的；其中在该保藏物的种子中，qtl2位于由seqidno:5和seqidno:6代表的分子标记m5007和由seqidno:9和seqidno:10代表的分子标记m5609之间，且与标记m5009的序列seqidno:8连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl3位于由seqidno:11和seqidno:12代表的分子标记m1000和由seqidno:15和seqidno:16代表的分子标记m3418之间，且与标记m2071的序列seqidno:14连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl4位于由seqidno:23和seqidno:24代表的分子标记m1520和由seqidno:27和seqidno:28代表的分子标记m0459之间，且与标记m5644的序列seqidno:26连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl5位于由seqidno:29和seqidno:30代表的分子标记m5843和由seqidno:33和seqidno:34代表的分子标记m0205之间，且与标记m5618的序列seqidno:32连锁。
所述组织培养物可以由未分化或已经分化的组织制备。未分化的组织例如是茎尖、花药、花瓣、花粉，并且可以用于微繁殖以获得生长成本发明的新植物的新的小植株。组织也可以从本发明的细胞生长。
本发明还涉及如本文定义的黄瓜赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因。特别地，赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因在seqidno:1的野生型核苷酸序列的第860位上包含snp。在本发明的一个实施方案中，该snp包含鸟嘌呤到腺嘌呤的变化。在本发明的一个实施方案中，赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因的核酸序列包含seqidno:2。
本发明的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因在本领域中并不知晓是天然存在的。在一个实施方案中，该基因是一种分离的基因。该基因也可以存在于黄瓜植物的基因组中，以赋予该植物对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
seqidno:1和seqidno:2的序列(如可见于表1的)均为黄瓜赤霉素-20-氧化酶基因的编码序列。这两个序列之间的唯一区别是seqidno:1第860位上的snp。序列seqidno:2是赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因。
可以通过杂交和选择将来自包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因的植物中的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因基因渗入(introgress)到另一种植物中，来将本发明的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因导入植物中。本发明的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因也可以通过遗传修饰，特别是通过同源转基因(cis-genesis)或异源转基因(trans-genesis)导入植物中。同源转基因是利用天然基因对植物进行的遗传修饰，该天然基因编码来自农作物本身或性相容供体植物的(农业)性状。异源转基因是用来自不可杂交物种的基因或合成基因对植物进行的遗传修饰。
可以适当地用于修饰基因或基因组合的技术包括一般的植物转化技术，例如使用土壤杆菌介导的转化方法。也可以采用其他基因组编辑方法，例如使用crispr/cas系统。遗传修饰的方法是本领域技术人员众所周知的。
本发明还涉及突变体赤霉素-20-氧化酶蛋白，包含seqidno:3的野生型氨基酸序列第287位上的取代。特别地，该突变体赤霉素-20-氧化酶蛋白包含seqidno:4。
seqidno:3和seqidno:4的序列(如可见于表1的)均为黄瓜赤霉素-20-氧化酶基因的氨基酸序列。这两个序列之间的唯一区别是seqidno:3第287位上的氨基酸变化。序列seqidno:4是赤霉素-20-氧化酶基因的突变体氨基酸序列。本发明进一步涉及核酸序列，其可用作标记来鉴定赋予抗性的如本文中定义的qtl的等位基因。
用于鉴定qtl2的突变体等位基因的标记是seqidno:8。用于鉴定qtl3的突变体等位基因的标记是seqidno：14。用于鉴定qtl4的突变体等位基因的标记是seqidno:26。用于鉴定qtl5的突变体等位基因的标记是seqidno:32。源自所述序列的包含与丁香假单胞菌角斑病变种抗性性状相关的snp的任何序列也是本发明的一部分。
本发明进一步涉及赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和/或任何上述标记或其一部分在鉴定和/或开发对丁香假单胞菌角斑病变种有抗性的黄瓜植物中的用途。序列seqidno:8、seqidno:14、seqidno:26和seqidno:32分别与qtl2、qtl3、qtl4和qtl5赋予丁香假单胞菌角斑病变种抗性的等位基因连锁。序列seqidno:8、seqidno:14、seqidno:26和seqidno:32与其野生型序列对应物seqidno:7、seqidno:13、seqidno:25和seqidno:31(与提及的qtl的易感性等位基因连锁)的唯一差异是各1个snp，如表2中指示的。
如在登录号ncimb42582下保藏的种子中发现的，赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文定义的qtl的一个或多个突变体等位基因可以用于在黄瓜植物中赋予对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
本发明还涉及一种用于鉴定显示对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的方法，包括：
a)在黄瓜植物中检测seqidno:1的野生型核苷酸序列中的snp，从而鉴定出显示对丁香假单胞菌角斑病变种有抗性的黄瓜植物；
b)任选地，实施针对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的表型测定法来确认该黄瓜植物对丁香假单胞菌角斑病变种有抗性。
特别地，seqidno:1的野生型核苷酸序列中的snp是在第860位从鸟嘌呤(g)到腺嘌呤(a)的变化。
用于鉴定显示对丁香假单胞菌角斑病变种有抗性的黄瓜植物的方法可以进一步包括检测选自下组的qtl的一个或多个突变体等位基因：qtl2、qtl3、qtl4、qtl5，如本文定义的。
通过使用赤霉素-20-氧化酶基因的序列seqidno:2，以及任选地通过使用选自下组的一个或多个标记序列：由seqidno:8代表的标记m5009，由seqidno:14代表的标记m2071，由seqidno:26代表的标记m5644和由seqidno:32代表的标记m5618，实现了对具有丁香假单胞菌角斑病变种抗性的性状的植物的检测。
本发明涉及一种选择显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的方法，该方法包括：a)测定黄瓜植物的基因组核酸中在赤霉素-20-氧化酶基因的等位基因中是否存在突变，其中赤霉素-20-氧化酶基因中的snp位于野生型核苷酸序列seqidno:1的第860位；b)确定所述突变是纯合的还是杂合的；c)以及基于所述确定选择所述黄瓜植物。
本发明进一步涉及一种选择显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的植物的方法，该方法包括：a)测定黄瓜植物的基因组核酸中在赤霉素-20-氧化酶基因的等位基因中是否存在突变(其中赤霉素-20-氧化酶基因中的snp位于野生型核苷酸序列seqidno:1的第860位)，和另外是否存在选自qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的qtl的一个或多个突变体等位基因；其中qtl2位于2号染色体上；qtl3位于5号染色体上，qtl4位于7号染色体上，以及qtl5位于7号染色体上，所述突变体等位基因赋予对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性；且其中所述qtl的突变体等位基因如在其代表性种子保藏于保藏号ncimb42582下的黄瓜植物中发现的；其中在该保藏物的种子中，qtl2位于由seqidno:5和seqidno:6代表的分子标记m5007与由seqidno:9和seqidno:10代表的分子标记m5609之间，且与标记m5009的序列seqidno:8连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl3位于由seqidno:11和seqidno:12代表的分子标记m1000与由seqidno:15和seqidno:16代表的分子标记m3418之间，且与标记m2071的序列seqidno:14连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl4位于由seqidno:23和seqidno:24代表的分子标记m1520与由seqidno:27和seqidno:28代表的分子标记m0459之间，且与标记m5644的序列seqidno:26连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl5位于由seqidno:29和seqidno:30代表的分子标记m5843与由seqidno:33和seqidno:34代表的分子标记m0205之间，且与标记m5618的序列seqidno:32连锁；b)确定所述突变和所述突变体等位基因是纯合的还是杂合的；c)以及基于所述确定选择所述黄瓜植物。
本发明进一步涉及一种用于产生杂交黄瓜种子的方法，其中从这类种子生长的植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性，所述方法包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得种子，其中所述第一亲本植物和/或所述第二亲本植物包含如本文中定义的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，其中所述赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因在从该种子生长的植物中赋予对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
显然，包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因的亲本植物可以是但不必然是直接从保藏的种子生长的植物。所述亲本植物也可以是来自保藏种子的后代植物、从其衍生的后代植物、或来自通过其他方式已获得赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因以及任选地本发明qtl的一个或多个突变体等位基因的种子的后代植物。
在本发明的一个实施方案中，所述第一亲本植物和/或所述第二亲本植物另外包含如本文中定义的qtl的一个或多个突变体等位基因。所得的包含赤霉素-20-氧化酶的突变体等位基因和任选地选自如本文中定义的qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的qtl的一个或多个突变体等位基因、且显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性的植物也是本发明的植物。
本发明进一步涉及一种用于产生杂交黄瓜植物的方法，所述杂交黄瓜植物包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文中定义的qtl的一个或多个突变体等位基因，其中所述杂交黄瓜植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性，该方法包括将第一亲本黄瓜植物与第二亲本黄瓜植物杂交并收获所得杂交种子，其中第一亲本植物和/或第二亲本植物包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地选自如本文中定义的qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的qtl的一个或多个突变体等位基因且显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性，并使所述杂交种子生长成杂交植物，所述杂交植物包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文中定义的qtl的一个或多个突变体等位基因，并显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
本发明还涉及一种用于产生显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性的黄瓜植物的方法，其中所述方法包括：
a)将包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地选自如本文中定义的qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的qtl的一个或多个突变体等位基因的植物与另一植物杂交以获得f1群体；
b)任选地，对f1的植物进行一轮或多轮自交和/或杂交以获得更多代的群体；
c)从群体中选出包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地选自如本文中定义的qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的qtl的一个或多个突变体等位基因的植物，且其中所选出的植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性，和/或从群体中选出在表型测定中显示对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的植物。用于产生显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性的黄瓜植物的方法可以进一步包括以下步骤，即将所选植物与包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文中定义的qtl的一个或多个突变体等位基因的植物杂交；并重复所述步骤a)至c)。
在携带赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因以及任选地本发明的qtl的一个或多个突变体等位基因的新的黄瓜植物的育种过程中，可以独立于所述基因的突变体等位基因以及任选地本发明的qtl的一个或多个突变体等位基因而将期望的农艺学性状引入所述黄瓜植物中。
如本文所用，“期望的性状”包括但不限于例如，提高的产量、果实形状、果实大小、果实颜色、种子大小、植物活力、植物高度、和对一种或多种疾病或致病生物的抗性。这些期望的性状中的任何一种都可以与本发明的基因的突变体等位基因以及qtl的一个或多个突变体等位基因相组合。
本领域技术人员熟悉例如通过基因渗入将新性状引入已经具有其他期望的农业特性的植物中。
基因渗入可以通过标准育种技术完成，其中选择可以用表型选择或使用(分子)标记或其组合进行。
由此，本发明提供一种将另一期望性状引入具有对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的性状的黄瓜植物中的方法，包括：a)将具有对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的性状的黄瓜植物(其代表性种子保藏在保藏号ncimb42582下)与包含所述期望性状的第二黄瓜植物杂交以产生f1子代；b)选出包含对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的性状和所述期望性状的f1子代；c)将所选的f1子代与任一亲本杂交以产生回交后代；d)选出包含期望的性状和对丁香假单胞菌角斑病变种抗性性状的回交后代；和e)任选地，连续重复步骤c)以及d)一次或多次以产生选出的包含该期望性状和对丁香假单胞菌角斑病变种抗性性状的第四代或更多代回交后代。本发明还包含通过该方法产生的黄瓜植物。
本发明进一步提供一种用于产生具有对丁香假单胞菌角斑病变种抗性性状的黄瓜植物的方法，其通过使用加倍单倍体产生技术以产生包含所述性状的加倍单倍体系。
本发明还涉及一种用于产生具有对丁香假单胞菌角斑病变种抗性性状的黄瓜植物的方法，包括使用其基因组中包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文中定义的qtl的一个或多个突变体等位基因(导致对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性)的种子来生长所述黄瓜植物。该种子适宜地是其代表性样品保藏在ncimb在保藏号ncimb42582下的种子。
本发明涉及一种用于产生具有丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的方法，包括以下步骤：a)在黄瓜植物的群体中引入突变；b)选择显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物；c)确认步骤b)下选择的植物在赤霉素-20-氧化酶基因的等位基因中具有突变并选出包含这类突变的植物，其中所述突变是赤霉素-20-氧化酶基因中的snp且位于野生型核苷酸序列seqidno:1的第860位；和d)生长步骤c)下获得的植物。可以通过许多不同的方法如tilling、ems和zfn诱导植物中的突变。本领域技术人员知晓实施哪种方法以及如何实施。
本发明还涉及一种用于种子产生的方法，包括从种子(该种子的代表性样品保藏于ncimb保藏号ncimb42582下)生长黄瓜植物，允许该植物产生种子，并收获那些种子。产生的种子包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文中定义的qtl的一个或多个突变体等位基因，而且从该种子生长的植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。种子的产生适宜地通过杂交和/或自交完成。
在一个实施方案中，本发明涉及一种通过使用组织培养物来产生具有丁香假单胞菌角斑病变种抗性的性状的黄瓜植物的方法。
此外，本发明涉及一种通过使用营养生殖来产生具有丁香假单胞菌角斑病变种抗性的性状的黄瓜植物的方法。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及一种用于产生具有丁香假单胞菌角斑病变种抗性的性状的黄瓜植物的方法，其中将包含导致本发明性状的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文中定义的qtl的一个或多个突变体等位基因植物的后代或繁殖材料用作来源以将该性状基因渗入到另一种黄瓜植物中。
包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和如本文中定义的qtl的突变体等位基因的植物的代表性种子保藏于保藏号ncimb42582下。
本发明还涉及一种用于开发包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文中定义的qtl的一个或多个突变体等位基因的黄瓜植物的育种方法，该黄瓜植物具有丁香假单胞菌角斑病变种抗性的性状，其中使用包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如本文中定义的qtl的一个或多个突变体等位基因的种质。
优选地，本发明提供了具有本发明的丁香假单胞菌角斑病变种抗性性状的黄瓜植物，该植物可通过本文中描述的任意方法和/或本领域技术人员熟悉的任何方法获得。
标记信息
表1中所示的seqidno:1和seqidno:3的序列分别代表赤霉素-20-氧化酶基因的野生型等位基因和赤霉素-20-氧化酶蛋白的野生型序列，如同存在于对丁香假单胞菌角斑病变种易感的黄瓜植物中一样。表1中所示的seqidno:2和seqidno:4的序列分别代表赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和突变体赤霉素-20-氧化酶蛋白，其在保藏物ncimb42582的种子的基因组中与丁香假单胞菌角斑病变种抗性连锁。
在赤霉素-20-氧化酶基因序列中，赋予丁香假单胞菌角斑病变种抗性的突变体等位基因(seqidno:2)和野生型等位基因(seqidno:1)之间不同的核苷酸在方括号内粗体显示。该核苷酸是在第860位上的snp，其中seqidno:1具有g，seqidno:2具有a。
在赤霉素-20-氧化酶蛋白序列中，赋予丁香假单胞菌角斑病变种抗性的突变体蛋白(seqidno:4)和野生型蛋白(seqidno:3)之间不同的氨基酸在方括号内粗体显示。该氨基酸是在第287位上的多态，其中seqidno:3具有c，seqidno:4具有y。
这些序列中指示的snp(方括号内粗体的核苷酸)可以用作分子标记，以检测在不包含丁香假单胞菌角斑病变种抗性的植物与包含所述抗性的植物之间的杂交后代中该赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因的存在，其中包含所述抗性的植物可以是从其代表性样品保藏在ncimb保藏号42582下的种子生长的植物。
表2中所示的序列seqidno:8、seqidno:14、seqidno:26、seqidno:32分别代表标记m5009、m2071、m5644和m5618的序列，其分别与qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的赋予该抗性的等位基因连锁，如同存在于保藏ncimb42582的种子的基因组中的。
表2中所示的序列seqidno:7、seqidno:13、seqidno:25、seqidno:31分别代表标记m5009、m2071、m5644和m5618的序列，其分别与qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的野生型易感性等位基因连锁，如同存在于对丁香假单胞菌角斑病变种易感的黄瓜植物中的。
如表2中所示，每个标记的两种序列之间不同的核苷酸在方括号之间粗体显示。
对于标记m5009，其为第101位上的snp，其中seqidno:7在第101位上具有t而seqidno:8在第101位上具有c。
对于标记m2071，其为第101位上的snp，其中seqidno:13在第101位上具有c而seqidno:14在第101位上具有a。
对于标记m5644，其为第101位上的snp，其中seqidno:25在第101位上具有a而seqidno:26在第101位上具有c。
对于标记m5618，其为第101位上的snp，其中seqidno:31在第101位上具有g而seqidno:32在第101位上具有t。
这些序列中指示的snp(方括号之间粗体显示的核苷酸)可以用作分子标记，以在不包含丁香假单胞菌角斑病变种抗性的植物与包含所述抗性的植物之间的杂交的后代中分别检测赋予抗性的qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的等位基因的存在，其中包含所述抗性的植物可以是从其代表性样品保藏在ncimb保藏号42582下的种子生长的植物。
保藏
纯合地包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因以及qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的突变体等位基因且具有本发明的表型性状的黄瓜(cucumissativus)ex5010的种子在2016年6月3日保藏于ncimbltd,fergusonbuilding,craibstoneestate,bucksburn,aberdeenab219ya,uk，保藏号为ncimb42582。
表
表1.黄瓜野生型赤霉素-20-氧化酶(gaox2)基因和突变体赤霉素-20-氧化酶(gaox2)基因的突变体等位基因的核苷酸序列和氨基酸序列。括号之间粗体的核苷酸和氨基酸指示snp。
表2.指示与丁香假单胞菌角斑病变种抗性连锁的qtl的位置的侧翼标记的序列以及与和丁香假单胞菌角斑病变种抗性连锁的qtl连锁的标记的序列。括号之间粗体的核苷酸指示snp。
实施例
实施例1
抗性测定丁香假单胞菌角斑病变种
针对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的存在测定黄瓜群体的表型。在德国西北部的田间试验中，将植物于5月播种，在播种5天后种植。对于每个植物编号，试验中使用了12株植物。种植后两周可见自然感染并评估植物。当时，该试验还接种了一种名为psl814/98的丁香假单胞菌角斑病变种分离物，如slomnicka等人,2015和olczak-woltman等人,2007的公开内容中描述的。将保持在-80℃的接种物在kb培养基中复制来制备。通过喷雾接种植物。从种植后的两周到种植后的六周，每周一次使用以下级别肉眼评估全黄瓜植物中丁香假单胞菌角斑病变种症状：
1：无症状
2：无症状到一些萎黄病变
3：一些萎黄病变
4：带小洞的萎黄病变
5：许多萎黄病变，许多较大的洞
收集所有评估和重复，并对每个植物编号进行平均。
实施例2
鉴定黄瓜植物中丁香假单胞菌角斑病变种抗性的qtl
在实施例1中，鉴定出对假单胞菌具有抗性的黄瓜植物。使用该植物作为亲本，制备了杂交群体来鉴定qtl和创建遗传图谱。总体上，标记数据源自268株黄瓜植物，使用了98个标记。在这些杂交群体上实施的qtl分析揭示了与丁香假单胞菌角斑病变种抗性连锁的1个主要qtl和4个次要qtl。该主要qtl见于6号染色体上，次要qtl见于2号染色体、5号染色体、和7号染色体(2个)上。与qtl连锁的标记的测序揭示了标记序列中snp的存在。qtl的标记序列在杂交群体中与该性状连锁。通过blast鉴定了6号染色体上主要qtl的核苷酸序列。该序列的最佳blast命中均类似于赤霉素-20-氧化酶基因的序列。
实施例3
单个qtl和qtl组合的验证
为了验证如实施例1和实施例2中描述的赤霉素-20-氧化酶基因和任选地其他qtl对黄瓜植物中丁香假单胞菌角斑病变种抗性的效果，在包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地选自qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的qtl的一个或多个突变体等位基因的黄瓜植物品系与不含有赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和/或一个或多个所述qtl的突变体等位基因的黄瓜植物品系之间进行杂交。测试源自该杂交的f6群体的植物中赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和/或选自qtl2、qtl3、qtl4、qtl5的qtl的一个或多个突变体等位基因的存在，其中对于赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因具有标记序列seqidno:1和2，对于qtl2的突变体等位基因具有seqidno:7和8，对于qtl3的突变体等位基因具有seqidno:13和14，对于qtl4的突变体等位基因具有seqidno:25和26，以及对于qtl5的突变体等位基因具有seqidno:31和32，如表1和表2中所示。没有所述突变体等位基因的黄瓜植物的平均疾病得分是5.0。包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因的黄瓜植物显示平均疾病抗性得分是3.0。如果在存在赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因以外还存在本发明qtl的述及的突变体等位基因之一，则平均疾病抗性得分是2.5。如果在存在赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因以外还存在本发明qtl的两个突变体等位基因，则平均疾病抗性得分是2.0。如果存在本发明其他qtl的三个突变体等位基因，则平均疾病得分是1.5。包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和本发明qtl(qtl2、qtl3、qtl4和qtl5)的所有突变体等位基因的植物在如实施例1中定义的1.0至5.0的级别上平均得分为1.0。
1.一种黄瓜植物，其包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，所述突变体等位基因赋予该植物对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
2.如权利要求1所述的黄瓜植物，其中所述赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因在以下位置上包含snp，该位置上的snp导致赤霉素-20-氧化酶蛋白的野生型氨基酸序列中的变化。
3.如权利要求2所述的黄瓜植物，其中所述赤霉素-20-氧化酶基因中的snp位于野生型核苷酸序列seqidno:1的第860位，从而导致赤霉素-20-氧化酶蛋白的野生型氨基酸序列中的变化。
4.如权利要求2或3所述的黄瓜植物，其中所述赤霉素-20-氧化酶蛋白的野生型氨基酸序列中的变化是位于野生型氨基酸序列seqidno:3的第287位上的氨基酸取代。
5.如权利要求2-4中任一项所述的黄瓜植物，其中所述snp包含从鸟嘌呤到腺嘌呤的改变。
6.如权利要求1-5中任一项所述的黄瓜植物，其中所述赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因包含seqidno:2。
7.如权利要求1-6中任一项所述的黄瓜植物，其中所述黄瓜植物另外包含选自下组的qtl中的一个或多个突变体等位基因：qtl2、qtl3、qtl4和qtl5；其中qtl2位于2号染色体上；qtl3位于5号染色体上，qtl4位于7号染色体上，以及qtl5位于7号染色体上，所述突变体等位基因赋予对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性；且其中所述qtl的突变体等位基因如同在其代表性种子以保藏号ncimb42582保藏的黄瓜植物中发现的；其中在该保藏物的种子中，qtl2位于由seqidno:5和seqidno:6代表的分子标记m5007与由seqidno:9和seqidno:10代表的分子标记m5609之间，且与标记m5009的序列seqidno:8连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl3位于由seqidno:11和seqidno:12代表的分子标记m1000与由seqidno:15和seqidno:16代表的分子标记m3418之间，且与标记m2071的序列seqidno:14连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl4位于由seqidno:23和seqidno:24代表的分子标记m1520与由seqidno:27和seqidno:28代表的分子标记m0459之间，且与标记m5644的序列seqidno:26连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl5位于由seqidno:29和seqidno:30代表的分子标记m5843与由seqidno:33和seqidno:34代表的分子标记m0205之间，且与标记m5618的序列seqidno:32连锁。
8.一种黄瓜种子，其包含如权利要求1-3、5或6中任一项限定的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，其中从所述种子生长的黄瓜植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
9.如权利要求8所述的黄瓜种子，其另外包含如权利要求7中限定的qtl中的一个或多个突变体等位基因，其中从所述种子生长的黄瓜植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
10.如权利要求1-7中任一项所述的黄瓜植物或者如权利要求8或9所述的黄瓜种子的后代，其包含如权利要求1-3、5或6中任一项限定的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，且任选地包含如权利要求7中限定的qtl的一个或多个突变体等位基因，且其中所述后代植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
11.能够发育成和/或衍生于如权利要求1-7中任一项所述的黄瓜植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适合有性繁殖、适合营养繁殖或适合可再生细胞的组织培养，其中所述繁殖材料选自小孢子、花粉、卵巢、胚珠、胚胎、胚囊、卵细胞、扦插、根、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生组织、原生质体、细胞或其组织培养物，其中发育成的植物和/或由该繁殖材料产生的植物包含如权利要求1-3、5或6中任一项限定的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，且任选地包含如权利要求7中限定的qtl的一个或多个突变体等位基因，并显示出对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
12.一种赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，其包含seqidno:1的野生型核苷酸序列第860位上的snp。
13.如权利要求12中所述的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，其中所述snp包含从鸟嘌呤到腺嘌呤的改变。
14.如权利要求12或13所述的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，其中赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因的核酸序列包含seqidno:2。
15.一种突变体赤霉素-20-氧化酶蛋白，其包含seqidno:3的野生型氨基酸序列第287位上的取代。
16.如权利要求15所述的突变体赤霉素-20-氧化酶蛋白，其中所述突变体赤霉素-20-氧化酶蛋白的氨基酸序列包含seqidno:4。
17.用于鉴定如权利要求12限定的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因的标记。
18.用于鉴定如权利要求7限定的qtl2的突变体等位基因的标记，该标记选自下组：seqidno.7和seqidno.8。
19.用于鉴定如权利要求7限定的qtl3的突变体等位基因的标记，该标记选自下组：seqidno.13和seqidno.14。
20.用于鉴定如权利要求7限定的qtl4的突变体等位基因的标记，该标记选自下组：seqidno:25和seqidno.26。
21.用于鉴定如权利要求7限定的qtl5的突变体等位基因的标记，该标记选自下组：seqidno.31和seqidno.32。
22.如权利要求12-14中任一项所述的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因或者权利要求17-21中任一项所述的标记的任一种或其部分用于鉴定和/或开发显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的用途。
23.一种用于鉴定显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的方法，包括：
a)在黄瓜植物中检测seqidno:1的野生型核苷酸序列中的snp，从而鉴定出显示对丁香假单胞菌角斑病变种有抗性的黄瓜植物；
b)任选地，实施针对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的表型测定法来确认该黄瓜植物对丁香假单胞菌角斑病变种有抗性。
24.如权利要求23所述的方法，其中seqidno:1的野生型核苷酸序列中的snp是在第860位从鸟嘌呤到腺嘌呤的改变。
25.如权利要求23或24所述的方法，进一步包括检测如权利要求7中限定的qtl的一个或多个突变体等位基因。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，进一步包括(c)选择包含如权利要求1-3、5或6中任一项限定的赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因和任选地如权利要求7中限定的qtl的一个或多个突变体等位基因的黄瓜植物。
27.一种用于产生杂交黄瓜种子的方法，其中从这类种子生长的植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性，其中所述方法包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得种子，其中所述第一亲本植物和/或所述第二亲本植物包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，其中所述赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因在从该种子生长的植物中赋予对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因包含seqidno:1的黄瓜野生型核苷酸序列第860位上的snp，该snp具体地是从鸟嘌呤(g)到腺嘌呤(a)的改变。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述第一亲本植物和/或第二亲本植物另外包含如权利要求7中限定的qtl的一个或多个突变体等位基因。
30.一种用于产生显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的方法，该方法包括：
a)将如权利要求1-7中任一项限定的植物与另一植物杂交以获得f1群体；
b)任选地，对f1的植物进行一轮或多轮自交和/或杂交以获得更多代的群体；
c)从该群体中选择包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因的植物，和/或从该群体中通过表型测定选择显示对丁香假单胞菌角斑病变种抗性的植物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述方法在步骤(c)中还包括从群体中选择另外包含如权利要求7中限定的qtl的一个或多个突变体等位基因的植物。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因包含seqidno:1的黄瓜野生型核苷酸序列第860位上的snp，该snp具体地是从鸟嘌呤(g)到腺嘌呤(a)的改变。
33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述黄瓜植物是近交系、杂交种、双单倍体或分离种群的植物。
34.丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的细胞，该细胞包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，所述突变体等位基因包含seqidno:1的野生型核苷酸序列第860位上的snp。
35.如权利要求34所述的细胞，还包含选自下组的qtl的一个或多个突变体等位基因：qtl2、qtl3、qtl4和qtl5；其中qtl2位于2号染色体上；qtl3位于5号染色体上，qtl4位于7号染色体上，以及qtl5位于7号染色体上，所述突变体等位基因赋予对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性；且其中所述qtl的突变体等位基因是如在其代表性种子保藏号ncimb42582保藏下的黄瓜植物中发现的；其中在该保藏物的种子中，qtl2位于由seqidno:5和seqidno:6代表的分子标记m5007与由seqidno:9和seqidno:10代表的分子标记m5609之间，且与标记m5009的序列seqidno:8连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl3位于由seqidno:11和seqidno:12代表的分子标记m1000与由seqidno:15和seqidno:16代表的分子标记m3418之间，且与标记m2071的序列seqidno:14连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl4位于由seqidno:23和seqidno:24代表的分子标记m1520与由seqidno:27和seqidno:28代表的分子标记m0459之间，且与标记m5644的序列seqidno:26连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl5位于由seqidno:29和seqidno:30代表的分子标记m5843与由seqidno:33和seqidno:34代表的分子标记m0205之间，且与标记m5618的序列seqidno:32连锁。
36.具有丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的组织培养物，该组织培养物包含赤霉素-20-氧化酶基因的突变体等位基因，所述突变体等位基因包含seqidno:1的野生型核苷酸序列第860位上的snp。
37.如权利要求36所述的组织培养物，还包含选自qtl2、qtl3、qtl4和qtl5的一个或多个突变体等位基因；其中qtl2位于2号染色体上；qtl3位于5号染色体上，qtl4位于7号染色体上，以及qtl5位于7号染色体上，所述突变体等位基因赋予对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性；且其中所述qtl的突变体等位基因如同在其代表性种子以保藏号ncimb42582保藏的黄瓜植物中发现的；其中在该保藏物的种子中，qtl2位于由seqidno:5和seqidno:6代表的分子标记m5007与由seqidno:9和seqidno:10代表的分子标记m5609之间，且与标记m5009的序列seqidno:8连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl3位于由seqidno:11和seqidno:12代表的分子标记m1000与由seqidno:15和seqidno:16代表的分子标记m3418之间，且与标记m2071的序列seqidno:14连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl4位于由seqidno:23和seqidno:24代表的分子标记m1520与由seqidno:27和seqidno:28代表的分子标记m0459之间，且与标记m5644的序列seqidno:26连锁；其中在该保藏物的种子中，qtl5位于由seqidno:29和seqidno:30代表的分子标记m5843与由seqidno:33和seqidno:34代表的分子标记m0205之间，且与标记m5618的序列seqidno:32连锁。
38.一种用于产生具有丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的方法，包括以下步骤：
a)在黄瓜植物的群体中引入突变；
b)选择显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物；
c)确认步骤b)下选择的植物在赤霉素-20-氧化酶基因的等位基因中是否具有突变并选出包含这类突变的植物，其中所述突变是由野生型核苷酸序列seqidno:1表示的赤霉素-20-氧化酶基因中的snp；
d)生长步骤c)下获得的植物。
39.一种用于产生显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的方法，包括从以保藏号ncimb42582保藏的种子生长出植物或从自其衍生的种子生长出植物。
40.一种选择显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的方法，包括：
a)测定黄瓜植物的基因组核酸中在seqidno:1的野生型赤霉素-20-氧化酶基因核苷酸序列中的突变的存在；和
b)如果存在所述突变，则选择该黄瓜植物。
41.如权利要求40所述的方法，其中所选择的黄瓜植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中seqidno:1的野生型赤霉素-20-氧化酶基因核苷酸序列中的突变构成野生型核苷酸序列seqidno:1第860位上的snp。
43.一种选择显示丁香假单胞菌角斑病变种抗性的黄瓜植物的方法，包括：
a)测定黄瓜植物的基因组核酸中在seqidno:1的野生型赤霉素-20-氧化酶基因核苷酸序列中的突变的存在和与如权利要求7限定的qtl遗传连锁的基因组丁香假单胞菌角斑病变种抗性标记的存在，其中所述qtl与丁香假单胞菌角斑病变种抗性相关，其中所述qtl位于基因组丁香假单胞菌角斑病变种抗性标记m5007、m5609、m5009、m1000、m3418、m2071、m1520、m0459、m5644、m5843、m0205和m5618中任一个的20cm或10cm或5cm内；
b)如果存在所述突变和任一个所述基因组丁香假单胞菌角斑病变种抗性标记，则选择该黄瓜植物。
44.如权利要求43所述的方法，其中所选择的黄瓜植物显示对丁香假单胞菌角斑病变种的抗性。
技术总结