相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月10日提交的第62/543761号美国申请的权益，其内容通过引用并入本文。
背景
核受体亚家族4的a组成员1(nr4a1)在结肠、胰腺、乳腺(雌激素受体阳性和阴性)和肺部肿瘤中过表达；在乳腺、结肠和肺部肿瘤患者中，nr4a1的高表达预示着生存率降低。nr4a1在癌症中的功能活性已通过敲低或过表达在癌细胞系中进行了广泛研究，且结果已表明在肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌和胃癌细胞系中，nr4a1调节癌细胞增殖、存活、细胞周期进程、迁移和侵袭中的一种或多种(图1)。研究已将β1和其他整联蛋白确定为nr4a1调节的基因。研究还表明nr4a1在横纹肌肉瘤(rms)患者的肿瘤中过表达，并且该受体调节rms细胞中的促癌途径，如图1所示。nr4a1的促癌功能包括调节几个本身是单一药物靶点的基因，包括整联蛋白、存活蛋白、egfr和其他受体酪氨酸激酶。
这表明nr4a1拮抗剂的开发将代表独特的化学疗法，其同时靶向与实体瘤的生长、存活和迁移/侵袭相关的多种促癌途径。研究最初表明几种1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对位取代的苯基)甲烷(c-dim)化合物使nr4al失活，随后的研究确定了作为nr4a1配体的dim-c-pphoh和其他对位取代的苯基类似物。dim-c-pphoh和相关化合物在细胞培养物中在10-20μm的浓度下阻断图1中概述的促癌途径，并在30-40mg/kg/d的剂量下部分抑制肿瘤生长。dim-c-pphoh对nr4a1具有高结合亲和力(ko-0.100μm)，但显示出短的体内半衰期。
如上所述，研究已经集中在结合nr4a1并充当拮抗剂(反向激动剂)的nr4a1配体的开发上。本发明的一名或多名发明人的研究已经依赖于rna干扰(rnai)以敲低nr4a1，以及依赖于分子/生化研究来确定受体敲低对细胞功能和细胞功能所需的相关途径的影响。初步研究表明nr4a1的敲低导致胰腺癌细胞生长减缓和凋亡的诱导；在横纹肌肉瘤、肺癌、乳腺癌、肾癌和结肠癌细胞系中也观察到了这一点。机理研究表明nr4a1通过与结合到促存活(存活蛋白和bcl2)和生长促进(egfr和其他受体酪氨酸激酶)基因的近端富含gc的区域的sp转录因子相互作用，充当激活这些基因的辅因子。与其他辅因子(例如p300)偶联的nr4a1激活并调节这些基因的表达。
已经证明在一系列c-dim类似物中，对羟基苯基类似物(dim-c-pphoh；cdim8)不仅结合于nr4a1，而且充当拮抗剂。因此，dim-c-pphoh抑制癌细胞的生长和存活，并抑制存活蛋白、egfr和其他nr4a1/sp调节的基因的表达。通过rnai对nr4a1的敲低也通过sestrin的p53依赖性和非依赖性活化来抑制mtor信号传导；在多种癌细胞系中针对dim-c-pphoh和其他nr4a1/c-dim拮抗剂观察到相似的结果。nr4a1通过调节异柠檬酸脱氢酶1(idh1)和含硫氧还蛋白结构域蛋白5(txndc5)的表达，在维持癌细胞系中的低氧化应激方面也起关键作用。敲低nr4a1或用dim-c-pphoh和其他nr4a1拮抗剂处理降低idh1和txndc6的表达，导致在许多癌细胞系中的活性氧(ros)的诱导、ros依赖性内质网应激以及细胞死亡(图1)。最近的研究表明nr4a1在癌细胞迁移/侵袭中起关键作用，这是由于nr4a1/sp介导的β1-整联蛋白(一种促侵袭基因)的调节。敲低nr4a1或用dim-c-pphoh或其他nr4a1拮抗剂处理减少癌细胞迁移并下调β1-整联蛋白和其他整联蛋白(图1)。
这些研究证实了nr4a1在实体瘤中是促癌的，并且dim-c-pphoh和其他c-dim已被表征为癌细胞系中的nr4a1拮抗剂。第一代c-dim化合物都包含对位取代的苯基部分，并且dim-c-pphoh(对羟基苯基)被表征为高亲和力配体，该配体在癌细胞系中主要表现出nr4a1拮抗剂活性，并且具有最小的受体非依赖性活性，如线粒体毒性；然而，dim-c-pphoh和相关化合物作为体内肿瘤生长抑制剂的活性在～30mg/kg/d范围内，并且体内半衰期非常短。
本发明试图满足这些需求并提供进一步的相关优点。
概述
提供该概述以简化形式介绍一系列概念，这些概念将在下文的详述中被进一步描述。该概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征，其也不旨在被用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
一方面，本发明提供了核受体亚家族4的a组成员1(nr4a1)配体。在一个实施方案中，配体是下式的化合物：
或其盐，
其中，
r1、r2、r1′和r2′各自独立地选自氢、包含1至约10个碳原子的直链烷基和包含1至约10个碳原子的支链烷基；
r3、r4、r5、r6、r3′、r4′、r5′和r6′各自独立地选自氢、卤素、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的烷氧基和硝基；
r7选自氢、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的环烷基和芳基；
r8、r9、r10、r11和r12独立地选自h、卤素、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的烷氧基、包含1至约10个碳原子的卤代烷基、硝基、羟基和包含1至约10个碳原子的卤代烷氧基；
其中r8、r9、r10、r11和r12中的至少一个是oh，和
其中当r10为oh时，r8、r9、r11和r12中的至少一个不是氢。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本文所述的化合物和药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供了治疗可通过调节nr4a1活性治疗的个体的疾病或病症的方法，其包括向所述个体给予治疗有效量的本文所述的化合物或药物组合物。
另一方面，本发明提供了调节细胞中nr4a1活性的方法，其包括向所述细胞给予本文所述的化合物或药物组合物。
附图说明
当结合附图时，所要求保护的发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更容易理解，因为通过参考以下详细描述，所要求保护的发明的前述方面和许多伴随的优点变得更好理解，其中：
图1示意性地示出了核受体亚家族4的a组成员1(nr4a1)的抑制，如1,1-双(3′-吲哚基)-1-(对位取代的苯基)甲烷(c-dim)/nr4a1配体削弱nr4a1依赖性生长和生存途径；
图2图示了用根据本发明的实施方案的4-、3-和2-羟基c-dim类似物处理的、用gal4-nr4a1和gal4-nr4a2和uas-luc(gal4-结合荧光素酶构建体)转染的panc1细胞中的荧光素酶活性；
图3包括用根据本发明的实施方案的单羟基c-dim化合物处理的pancl(胰腺)和skbr3(乳腺)癌细胞的蛋白质印迹图像，其显示两种nr4a1依赖性因子，即β1-整联蛋白和txndc5的表达的下调；
图4包括用根据本发明的实施方案的4-、3-和2-羟基c-dim化合物处理的rh30(rms)细胞的蛋白质印迹图像，其显示pax3-fox01a和txndc5的表达的下调；
图5包括用根据本发明的实施方案的4-、3-和2-羟基c-dim化合物处理的skbr3(乳腺)癌细胞的蛋白质印迹图像，其显示serpinb5的表达的上调；
图6图示了用根据本发明的实施方案的2-羟基c-dim类似物处理的、用gal4-nr4a1和uas-luc转染的panc1细胞中的荧光素酶活性；
图7图示了用根据本发明的实施方案的3-羟基c-dim类似物处理的、用gal4-nr4a1和uas-luc转染的panc1细胞中的荧光素酶活性；
图8图示了用根据本发明的实施方案的4-羟基c-dim类似物处理的、用gal4-nr4a1和uas-luc转染的panc1细胞中的荧光素酶活性；
图9图示了用根据本发明的实施方案的4-羟基c-dim类似物处理的、用gal4-nr4a1和uas-luc转染的panc1细胞中的荧光素酶活性；
图10a包括用根据本发明的实施方案的4-羟基c-dim类似物(5μm)和用4-oh(dim-c-pphoh，母体化合物)处理的panc1细胞的蛋白质印迹图像，其显示serpinb5的诱导；
图10b包括用根据本发明的实施方案的4-羟基c-dim类似物(5μm)和用4-oh(dim-c-pphoh，母体化合物)处理的rh30细胞的蛋白质印迹图像，其显示pax3-fox01a和txndc5诱导的降低；
图11a-11c图示了dim-c-pphoh(4-oh化合物)和根据本发明的实施方案的取代的c-dim类似物在rh30细胞中分别对白介素24(il-24)、鸟嘌呤脱氨酶(gda)和含双皮质素结构域蛋白2(dcdc2)的nr4a1依赖性诱导；
图12a-12c图示了相对于对照(灰色)，使用用根据本发明的实施方案的4-羟基c-dim类似物(10mg/kg/天)(黑色)处理的人mda-mb-231乳腺癌细胞的无胸腺裸鼠异种移植模型中的乳腺肿瘤体积；
图13图示了用根据本发明的实施方案的3-羟基c-dim类似物处理的、用gal4-nr4a2和uas-luc转染的panc1细胞中的荧光素酶活性；
图14包括用根据本发明的实施方案的3-羟基c-dim类似物处理的skbr3细胞的蛋白质印迹图像；
图15图示了用根据本发明的实施方案的2-羟基c-dim类似物处理的、用gal4-nr4a2和uas-luc转染的panc1细胞中的荧光素酶活性；
图16包括用根据本发明的实施方案的2-羟基c-dim类似物处理的panc1细胞的蛋白质印迹图像，其显示txndc5和β1-整联蛋白的诱导降低；
图17包括用根据本发明的实施方案的2-羟基c-dim类似物处理的panc1细胞的蛋白质印迹图像，其显示serpinb5和gadd45α的诱导；
图18包括用根据本发明的实施方案的4-羟基c-dim类似物处理的来自原位乳腺癌模型的解离的肿瘤细胞裂解物的蛋白质印迹图像，其显示mtor途径的抑制；
图19包括用根据本发明的实施方案的4-羟基c-dim类似物处理的来自原位乳腺癌模型的解离的肿瘤细胞裂解物的蛋白质印迹图像，其显示nr4a1基因产物的下调，以及gadd45α、serpinb5和c-parp的上调；
图20a图示了用根据本发明的实施方案的c-dim类似物处理的葡萄糖饥饿的hepg2细胞中的荧光素酶活性，其显示g6p酶的下调；
图20b图示了用根据本发明的实施方案的c-dim类似物处理的葡萄糖饥饿的hepg2细胞中的荧光素酶活性，其显示pepck的下调；
图21图示了用根据本发明的实施方案的c-dim类似物处理的panc1细胞中骨桥蛋白(opn)基因表达的nr4a2依赖性诱导；
图22是根据本发明的实施方案的与nr4a1结合的c-dim类似物的表面等离振子共振(spr)响应曲线；
图23a-23d图示了用根据本发明实施方案c-dim类似物治疗的小鼠中的异种移植乳腺肿瘤体积(a-c)和质量(d)；
图24a-24d图示了用根据本发明的实施方案3,5-二溴-4-羟基c-dim化合物治疗的小鼠中的rms异种移植肿瘤的肿瘤体积；
图25a-25d是用根据本发明的实施方案的c-dim类似物处理的c2c12细胞的全细胞裂解物的蛋白质印迹图像；
图26a-26d图示了用根据本发明的实施方案的c-dim类似物处理的c2c12细胞中的相对nr4a1/葡萄糖转运蛋白4(glut-4)mrna表达；
图27图示了用根据本发明的实施方案的c-dim类似物处理的c2c12细胞中的葡萄糖摄取；
图28a-28e图示了用dim-c-pphoh(a)、dim-c-pphoh-3,5-br2(b)、dim-c-pphoh-3-cl(c)和dim-c-pphoh-3-cl-5-och3(d)处理24小时的c2c12细胞，或用nr4a1表达质粒(e)转染的细胞中的糖酵解基因的相对mrna表达；
图29a图示了用溶媒对照和根据本发明的一个实施方案的c-dim8-3-cl-5-och3(10mg/kg/d)处理的小鼠中血糖的相对百分比；和
图29b图示了用溶媒对照和根据本发明的一个实施方案的c-dim8-3-cl-5-och3处理的hfd饲喂的c57bl/6小鼠中葡萄糖耐量水平中的血糖水平降低。
详述
本发明提供了核受体亚家族4的a组成员1(nr4a1)配体，包含治疗有效量的这样的nr4a1配体的药物组合物，以及相关的使用方法。
nr4a1配体
一方面，本发明提供了一种作为nr4a1配体的化合物。如本文进一步描述的，在某些实施方案中，使用4-、3-和2-羟基苯基c-dim类似物作为骨架来研究第二代nr4a1配体的合成和最终开发，所述第二代nr4a1配体表现出对癌症和其他疾病的强效活性，其中nr4a1是例如代谢和神经系统疾病中的潜在的治疗靶点。
因此，在一个实施方案中，所述配体是具有下式的化合物：
或其盐，
其中，
r1、r2、r1′和r2′各自独立地选自氢、包含1至约10个碳原子的直链烷基和包含1至约10个碳原子的支链烷基；
r3、r4、r5、r6、r3′、r4′、r5′和r6′各自独立地选自氢、卤素、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的烷氧基和硝基；
r7选自氢、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的环烷基和芳基；
r8、r9、r10、r11和r12独立地选自h、卤素、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的烷氧基、包含1至约10个碳原子的卤代烷基、硝基、羟基和包含1至约10个碳原子的卤代烷氧基；
其中r8、r9、r10、r11和r12中的至少一个是oh，和
其中当r10为oh时，r8、r9、r11和r12中的至少一个不是氢。
如本文进一步讨论的，本发明的化合物是nr4a1配体。就这一点而言，在一些实施方案中，拮抗剂配体阻断受体的组成功能及其用于刺激性同源配体结合于nr4a1蛋白并激活nr4a1依赖性基因的能力。
如本领域技术人员所理解的，被称为单价化学部分的化学部分(例如，烷基、芳基等)也涵盖结构上允许的多价部分。例如，虽然“烷基”部分通常是指单价基团(例如ch3ch2-)，但在适当情况下，“烷基”部分也可以指二价基团(例如-ch2ch2-，其等同于“亚烷基”)。类似地，在其中要求二价部分的情况下，本领域技术人员将理解，术语“芳基”是指相应的二价亚芳基。
本文所用的术语可以在单破折号“-”或双破折号“＝”之前和/或之后，以表示指定的取代基和其母体部分之间的键的键级；单破折号表示单键，双破折号表示双键。在没有单破折号或双破折号的情况下，应理解在取代基及其母体部分之间形成单键；此外，除非破折号表示其它，否则取代基意在“从左至右”读出。例如，c1-c6烷氧基羰氧基和-oc(o)c1-c6烷基表示相同的官能度；类似地，芳基烷基和-烷基芳基表示相同的官能度。
所有原子都应理解为具有其正常成键的化合价数(例如，碳为4，n为3，o为2，s为2、4或6，取决于原子的氧化态)。有时，部分可以定义为例如(a)ab，其中a为0或1。在这种情况下，当a为0时，该部分为b，而当a为1时，该部分为ab。
当取代基的同类原子或基团数目可以变化时(例如，烷基可以为c1、c2、c3等)，重复原子或基团的数目可以由范围(例如，c1-c6烷基)表示，该范围包括该范围内的各个和每个数目以及任何和所有子范围。例如，c1-c3烷基包括c1、c2、c3、c1-2、c1-3和c2-3烷基。
除非另有说明，否则本文所用的术语“烷基”意指含有1至10个碳原子的直链或支链烃基。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基，正辛基、正壬基和正癸基。当“烷基”基团是两个其他部分之间的连接基团时，则它也可以是直链或支链；实例包括但不限于-ch2-、-ch2ch2-、-ch2ch2chc(ch3)-、-ch2ch(ch2ch3)ch2-。
如本文所用的术语“环烷基”意指单环或双环环烷基环系统。单环环系统是含有3至8个碳原子的环状烃基，其中这些基团可以是饱和或不饱和的，但不是芳族的。在某些实施方案中，环烷基是完全饱和的。单环环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。双环环烷基环系统是桥连的单环或稠合的双环。桥连的单环包含单环环烷基环，其中单环的两个不相邻的碳原子通过一个和三个另外的碳原子之间的亚烷基桥连接(即，-(ch2)w-形式的桥连基团，其中w是1、2或3)。
“烷氧基”是指通过氧原子附加至母体分子部分的如本文所定义的烷基。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。
如本文所用，术语“芳基”意指苯基(即，单环芳基)，或包含至少一个苯环的双环环系统或在芳族双环环系统中仅包含碳原子的芳族双环。双环芳基可以是薁基，萘基，或与单环环烷基、单环环烯基或单环杂环基稠合的苯基。双环芳基通过双环系统的苯基部分中所含的任何碳原子或萘基或薁基环中的任何碳原子连接至母体分子部分。双环芳基的稠合的单环环烷基或单环杂环基部分任选地被一个或两个氧代基团和/或硫代基团取代。
“卤素”是指氯、溴、氟或碘原子基团。术语“卤素”还涵盖术语“卤代”或“卤化物”。
术语“卤代烷基”、“卤代烯基”和“卤代烷氧基”是指根据具体情况，被一个或多个卤素原子取代的烷基、烯基或烷氧基。
如本文所用，术语“硝基”意指-no2基团。
如本文所用，术语“取代的”意指指定部分的氢基被指定取代基的基团替代，条件是该取代产生稳定或化学上可行的化合物。当针对指定原子使用时，术语“可取代的”意指连接至原子的是氢基，其可以被合适的取代基的基团替代。
2-羟基配体
在一些实施方案中，r8为oh。在某些情况下，由于oh基团在中心苯基上的位置，这样的配体在本文中被称为“2-羟基”和/或“2-oh”配体。在某些这样的实施方案中，r9、r10、r11和r12各自为h。在某些其他实施方案中，r9、r10、r11和r12独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。在一个实施方案中，r10为och3。在一个实施方案中，r11选自ch3、och3和cf3。在一个实施方案中，r9和r11为br。
在一个实施方案中，本发明的组合物具有以下结构之一：
3-羟基配体
在一些实施方案中，r9为oh。在某些情况下，由于oh基团在中心苯基上的位置，这样的配体在本文中被称为“3-羟基”和/或“3-oh”配体。在某些这样的实施方案中，r8、r10、r11和r12各自为h。在某些其他实施方案中，r8、r10、r11和r12独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。在某些实施方案中，r8为卤素。
在一个实施方案中，本发明的组合物具有以下结构之一：
4-羟基配体
在一些实施方案中，r10为oh。在某些情况下，由于oh基团在中心苯基上的位置，这样的配体在本文中被称为“4-羟基”和/或“4-oh”配体。在某些这样的实施方案中，r8、r9、r11和r12独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。在某些其他实施方案中，r9为卤素，r11选自h、卤素和och3。
在一个实施方案中，本发明的组合物具有以下结构之一：
本发明的c-dim化合物可以通过使取代的苯甲醛与吲哚或取代的吲哚缩合来制备。可以通过在80-90℃下在稀乙酸中将两份吲哚或取代的吲哚与一份苯甲醛或取代的苯甲醛一起孵育24-48小时来合成所述化合物。通过过滤回收固体，并由苯或苯/己烷结晶，得到70-90％收率的c-dim。使用单一的吲哚原料将得到对称产物，而使用两种不同的吲哚原料将得到不对称产物。
代表性的c-dim化合物的制备和表征描述于例如第7,232,843号美国专利中，其通过引用整体并入本文。
药物组合物
在某些方面，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的化合物以及药学上可接受的载体，任选地包含其他治疗和/或预防成分。
本文所用的术语“治疗有效量”是指足以治疗特定障碍、病症或疾病，例如改善、缓和、减轻和/或延迟其一种或多种症状的化合物或组合物的量。关于癌症或其他不期望的细胞增殖，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(例如抑制肿瘤生长)的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以防止发生和/或复发的量。可以以一次或多次给予来给予有效量。
用于治疗用途的“药学上可接受的载体”在药学领域中是众所周知的，并且例如描述在remington'spharmaceuticalsciences，第18版(easton,pa.:mackpublishingcompany,1990)中。例如，可以使用生理ph下的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。例如，可以添加苯甲酸钠、山梨酸(sortieacid)和对羟基苯甲酸的酯作为防腐剂。同上，在1449页。另外，可以使用抗氧化剂和助悬剂。同上。
用于非液体制剂的合适的赋形剂也是本领域技术人员已知的。关于药学上可接受的赋形剂和盐的详尽论述可在remington'spharmaceuticalsciences，第18版(easton,pa.:mackpublishingcompany,1990)中获得。
另外，在这样的溶媒中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、生物缓冲物质、表面活性剂等。生物缓冲液可以是任何溶液，其为药理学上可接受的，并且为制剂提供期望的ph，即生理上可接受的范围内的ph。缓冲溶液的实例包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水、hank's缓冲盐水等。
根据预期的给予方式，药物组合物可以是固体、半固体或液体剂型的形式，例如片剂、栓剂、丸剂、胶囊、散剂、液体、混悬剂、乳膏、软膏、洗剂等，优选为适合单次给予精确剂量的单位剂型。该组合物将包括有效量的所选药物与药学上可接受的载体的组合，并且另外可以包括其他药剂、佐剂、稀释剂、缓冲剂等。
本发明包括包含本发明的化合物以及一种或多种药学上可接受的载体，以及任选的其他治疗和/或预防成分的药物组合物，本发明的化合物包括异构体，异构体的外消旋或非外消旋混合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
通常，本发明的化合物将通过任何被接受的给予方式以治疗有效量给予。合适的剂量范围取决于许多因素，例如待治疗疾病的严重程度，受试者的年龄和相对健康状况，所用化合物的效力，给予途径和形式，给予所针对的适应症，以及相关医疗从业人员的偏好和经验。治疗这样的疾病的本领域普通技术人员将能够在不进行过度实验的情况下并且依赖于个人知识和本申请的公开内容来确定对于给定疾病的本发明的化合物的治疗有效量。
因此，本发明的化合物可以作为药物制剂，包括适于口服(包括颊和舌下)、直肠、鼻、局部、肺、阴道或肠胃外(包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮下和静脉内)给予的那些给予，或以适于通过吸入或吹入给予的形式给予。优选的给予方式是采用方便的每日剂量方案静脉内或口服给予，该方案可以根据患病程度调整。
对于固体组合物，常规的无毒固体载体包括，例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。液态的药学上可给予的组合物可以例如通过在赋形剂，例如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等中将本文所述的活性化合物和任选的药物佐剂溶解、分散等，从而形成溶液或悬浮液来制备。如果需要，待给予的药物组合物还可以包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂等，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯等。制备这样的剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或将是显而易见的，例如，参见上文提到的remington'spharmaceuticalsciences。
在又一个实施方案中是使用渗透增强剂赋形剂，所述渗透增强剂赋形剂包括聚合物，例如：聚阳离子(壳聚糖及其季铵衍生物、聚-l-精氨酸、胺化明胶)；聚阴离子(n-羧甲基壳聚糖、聚丙烯酸)；和硫醇化聚合物(羧甲基纤维素-半胱氨酸、聚卡波非-半胱氨酸、壳聚糖-硫代丁基脒、壳聚糖-巯基乙酸、壳聚糖-谷胱甘肽缀合物)。
对于口服给予，组合物将通常采用片剂、胶囊、软凝胶胶囊的形式，或者可以是水性或非水性溶液、悬浮液或糖浆。片剂和胶囊是优选的口服给予形式。用于口服使用的片剂和胶囊可以包括一种或多种常用的载体，例如乳糖和玉米淀粉。通常也加入润滑剂，例如硬脂酸镁。通常，本发明的化合物可以与口服、无毒、药学上可接受的惰性载体，例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇等组合。此外，当期望或必要时，也可以将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入到混合物中。合适的粘合剂包括淀粉，明胶，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，玉米甜味剂，天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡等。在这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
因此，例如，可通过常规过程制备胶囊，使得剂量单元是100mg本发明的化合物、100mg纤维素和10mg硬脂酸镁。还可以通过填充标准的两件式硬明胶胶囊来制备大量的单位胶囊，每个硬明胶胶囊均含有100mg粉末状活性成分、150mg乳糖、50mg纤维素和10mg硬脂酸镁。或者，片剂可以通过常规过程制备，使得剂量单元是100mg本发明的化合物、150mg乳糖、50mg纤维素和10mg硬脂酸镁。还可以通过常规过程制备大量片剂，使得剂量单元是100mg本发明的化合物，并且其他成分可以是0.2mg胶体二氧化硅、5mg硬脂酸镁、250mg微晶纤维素、10mg淀粉和100mg乳糖。可以施加适合的包衣以增加适口性或延迟吸收。
当使用液体悬浮液时，活性剂可以与任何口服、无毒的、药学上可接受的惰性载体，如乙醇、甘油、水等以及与乳化剂和助悬剂组合。如果需要，也可以加入调味剂、着色剂和/或甜味剂。用于掺入本文的口服制剂的其他任选组分包括但不限于防腐剂、助悬剂、增稠剂等。
肠胃外制剂可以以常规形式制备，或者作为液体溶液或悬浮液，在注射前可在液体中下沉以溶解或悬浮的固体形式，或者作为乳液。优选地，无菌可注射悬浮液根据本领域已知的技术，使用合适的载体、分散剂或润湿剂和助悬剂配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。可以使用的可接受的溶媒和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油、脂肪酸酯或多元醇通常用作溶剂或悬浮介质。此外，肠胃外给予可以涉及使用缓慢释放或持续释放系统，以保持恒定的剂量水平。
肠胃外给予包括关节内、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径，并且包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。通过某些肠胃外途径给予可涉及通过由无菌注射器或一些其它机械装置，如连续输注系统推进的针或导管将本发明的制剂引入患者体内。由本发明提供的制剂可以用针筒、注射器、泵或本领域认可的用于肠胃外给予的任何其它装置来给予。
优选地，无菌可注射悬浮液根据本领域已知的技术使用合适的载体、分散剂或润湿剂和助悬剂配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。可以使用的可接受的溶媒和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常使用suede、不挥发油、脂肪酸酯或多元醇作为溶剂或悬浮介质。此外，肠胃外给予可以涉及使用缓慢释放或持续释放系统，以保持恒定的剂量水平。
用于肠胃外给予的根据本发明的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液或乳液。非水溶剂或溶媒的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄榄油和玉米油，明胶，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。这样的剂型还可以含有辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。它们可以通过例如通过细菌保留过滤器过滤，通过将灭菌剂掺入组合物中，通过照射组合物，或通过加热组合物来灭菌。它们也可以在使用前立即用无菌水或一些其它无菌可注射介质制造。
制剂可任选地含有等渗剂。制剂优选含有等渗剂，甘油是最优选的等渗剂。当使用甘油时，甘油的浓度在本领域已知的范围内，例如约1mg/ml至约20mg/ml。
肠胃外制剂的ph可以通过缓冲剂，如磷酸盐、乙酸盐、tris或l-精氨酸来控制。缓冲剂的浓度优选足以在储存期间提供ph的缓冲，以将ph维持在目标ph±0.2ph单位。当在室温下测量时，优选的ph在约7至约8之间。
其他添加剂，如药学上可接受的增溶剂，像tween
根据需要，通过将所需量的本发明的化合物中的一种或多种与上文列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒包含基本分散介质和来自上文列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其由其先前的无菌过滤溶液产生活性成分加上任何其他期望成分的粉末。因此，例如，通过将1.5重量％的活性成分在10体积％的丙二醇和水中搅拌来制备适合于通过注射给予的肠胃外组合物。用氯化钠使溶液等渗，并灭菌。
供选择地，本发明的药物组合物可以以用于直肠给予的栓剂形式给予。这些可以通过将药剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放药物。这样的材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本发明的药物组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入给予。这样的组合物根据药物制剂领域中熟知的技术制备，并且可以使用苯甲醇或其它合适的防腐剂，增强生物利用度的吸收促进剂，推进剂如碳氟化合物或氮，和/或其它常规的增溶剂或分散剂，制备成盐水溶液。
用于局部药物递送的优选制剂是软膏和乳膏。软膏是半固体制剂，其通常基于凡士林或其它石油衍生物。如本领域已知的，含有所选活性剂的乳膏是粘性液体，或水包油型或油包水型半固体乳液。乳膏基质是可水洗的，并且含有油相、乳化剂和水相。油相，有时也称为“内”相，通常由凡士林和脂肪醇，如鲸蜡醇或硬脂醇组成；水相通常但不必须超过油相的体积，并且通常含有润湿剂。乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。如本领域技术人员将理解的，所使用的具体软膏或乳膏基质id是将提供最佳药物递送的软膏或乳膏基质id。与其它载体或溶媒一样，软膏基质应该是惰性的、稳定的、无刺激性的和无致敏性的。
用于颊给予的制剂包括片剂、锭剂、凝胶剂等。供选择地，可以使用本领域技术人员已知的透粘膜递送系统进行颊给予。本发明的化合物也可以使用常规的透皮药物递送系统，即透皮“贴剂”通过皮肤或粘膜组织递送，其中药剂通常包含在待固定到身体表面的用作药物递送装置的层压结构内。在这种结构中，药物组合物通常包含在上背衬层下面的层或“储库”中。层压装置可以包含单个储库，或者它可以包含多个储库。在一个实施方案中，所述储库包含药学上可接受的接触粘合剂材料的聚合物基质，所述接触粘合材料用于在药物递送期间将所述系统固定到皮肤上。合适的皮肤接触粘合剂材料的实例包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等。供选择地，含有药物的储库和皮肤接触粘合剂作为分离的和不同的层存在，粘合剂在储库下面，在这种情况下，储库可以是如上文所述的聚合物基质，或者它可以是液体或凝胶储库，或者可以采取一些其它形式。在这些层压材料中的背衬层充当装置的上表面，作为层压结构的主要结构元件起作用，并为装置提供了很大的柔性。选择用于背衬层的材料对活性剂和存在的任何其它材料应是基本上不可渗透的。
本发明的化合物可以被配制用于气雾剂给予，特别是向呼吸道给予，并且包括鼻内给予。所述化合物将通常具有小的粒度，例如具有5微米或更小的量级。这样的粒度可以通过本领域已知的方法获得，例如通过微粉化。活性成分在加压包装中与合适的推进剂，如氯氟烃(cfc)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体一起提供。气雾剂还可以方便地含有表面活性剂，例如卵磷脂。喷的剂量可通过计量阀控制。供选择地，活性成分可以干粉形式提供，例如化合物在合适的粉末基质，如乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羟丙基甲基纤维素、和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)中的粉末混合物。粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。粉末组合物可以单位剂量形式存在，例如在明胶或泡罩包装的胶囊或药筒中，通过吸入器可以从所述胶囊或药筒给予粉末。
将药学或治疗有效量的组合物递送至受试者。精确的有效量将因受试者不同而异，并且将取决于物种，年龄，受试者的大小和健康状况，所治疗的病症的性质和程度，治疗医师的推荐，以及选择用于给予的治疗剂或治疗剂的组合。因此，对于给定情况的有效量可以通过常规实验来确定。对于本发明的目的，在至少一个剂量中，治疗量通常在约0.01mg/kg至约250mg/kg体重的范围内，更优选在约0.1mg/kg至约10mg/kg的范围内。在较大的哺乳动物中，指定的日剂量可以是约1mg至300mg，每天一次或多次，更优选在约10mg至200mg的范围内。可以根据需要向受试者给予多个剂量，以减少和/或减轻所讨论的病症的体征、症状或原因，或带来生物系统的任何其它期望的改变。当需要时，可以用适于活性成分的持续或控制释放给予的肠溶包衣制备制剂。
药物制剂优选在单位剂型中。在这种形式中，制剂被细分成含有适合量的活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，该包装含有离散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊和在小瓶或安瓿中的粉末。此外，单位剂型可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者它可以是包装形式的适当数量的这些中的任何一种。
调节nr4a1活性的方法
另一方面，本发明提供了一种调节细胞中nr4a1活性的方法，其包括向所述细胞给予本文所述的化合物或药物组合物。
在一些实施方案中，调节nr4a1活性包括使本文别处描述的化合物与nr4a1蛋白结合。在一些实施方案中，所述化合物具有拮抗活性，即所述化合物在刺激受体的同源功能方面具有降低的功效或没有功效(例如，拮抗剂配体)。在一些实施方案中，拮抗剂配体阻断受体的组成功能及其用于刺激性同源配体结合于nr4a1蛋白并激活nr4a1依赖性基因的能力。在一些实施方案中，nr4a1配体可以是一种组织、应答或基因特异性激动剂。
术语“拮抗剂”是指可以与nr4a1受体结合以减少或抑制分子和细胞活性的化合物。拮抗剂可以是直接结合于受体的配体。供选择地，拮抗剂可通过例如以下方式间接与受体结合：(a)与直接结合于受体的另一种分子或蛋白形成复合物，或(b)以另外的方式导致另一种化合物的修饰，以使另一种化合物直接与nr4a1受体结合。
术语“激动剂”是指可以与nr4a1受体结合以产生或增加分子和细胞活性的化合物。激动剂可以是直接结合于受体的配体。供选择地，激动剂可通过例如以下方式间接与受体结合：(a)与直接结合于受体的另一种分子或蛋白形成复合物，或(b)以另外的方式导致另一种化合物的修饰，以使另一种化合物直接与nr4a1受体结合。
术语“激活”及其变体是指分子和细胞活性的任何可测量的增加。
在一个实施方案中，细胞是癌细胞。
在一个实施方案中，细胞在体外与化合物或药物组合物接触。在一个实施方案中，通过向受试者给予有效量的化合物或药物组合物，使细胞与化合物或药物组合物在体内接触。
在一个实施方案中，nr4a1活性的调节诱导选自β1-整联蛋白、txndc5、存活蛋白、efgr、pax3-fox01a及其组合的蛋白的下调。在一个实施方案中，nr4a1活性的调节诱导选自serpinb5、gadd45α及其组合的蛋白的上调。
在一个实施方案中，所述化合物具有下式：
或其盐，
其中，
r1、r2、r1′和r2′各自独立地选自氢、包含1至约10个碳原子的直链烷基和包含1至约10个碳原子的支链烷基；
r3、r4、r5、r6、r3′、r4′、r5′和r6′各自独立地选自氢、卤素、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的烷氧基和硝基；
r7选自氢、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的环烷基和芳基；
r8、r9、r10、r11和r12独立地选自h、卤素、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的烷氧基、包含1至约10个碳原子的卤代烷基、硝基、羟基和包含1至约10个碳原子的卤代烷氧基；
其中r8、r9、r10、r11和r12中的至少一个是oh，和
其中当r10为oh时，r8、r9、r11和r12中的至少一个不是氢。
4-羟基配体
在一个实施方案中，r10为oh。在某些这样的实施方案中，r8、r9、r11和r12独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。在某些其他实施方案中，r9是卤素，并且r11选自h、卤素和och3。
在一个实施方案中，本发明的组合物具有以下结构之一：
2-羟基配体
在一个实施方案中，r9为oh。在某些这样的实施方案中，r8、r10、r11和r12各自为h。在某些其他实施方案中，r8、r10、r11和r12独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。在某些实施方案中，r8为卤素。
在一个实施方案中，本发明的组合物具有以下结构之一：
3-羟基配体
在一个实施方案中，r8为oh。在某些这样的实施方案中，r9、r10、r11和r12各自为h。在某些其他实施方案中，r9、r10、r11和r12独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。在一个实施方案中，r10为och3。在一个实施方案中，r11选自ch3、och3和cf3。在一个实施方案中，r9和r11为br。
在一个实施方案中，本发明的组合物具有以下结构之一：
治疗疾病或病症的方法
另一方面，本发明提供了治疗可通过调节nr4a1活性来治疗的个体的疾病或病症的方法，该方法包括向所述个体给予治疗有效量的本文所述的化合物或药物组合物。
考虑到递送途径、化合物的代谢以及其他药代动力学参数，例如分布的体积、清除率、受试者的年龄等，本领域普通技术人员将能够确定用于给予组合物的最有效剂量和时间。例如，nr4a1拮抗剂可以以任何众所周知的方法给予，例如通过局部给予、口服给予、静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射、鼻内给予、经皮给予、直肠给予，或通过任何将有效量的活性剂输送到待治疗的组织或部位的方法给予。合适的剂量是达到期望终点的剂量。应当理解，可能需要不同的剂量来治疗不同的障碍。药剂的有效量是例如引起肿瘤细胞计数、生长、大小、细胞迁移或细胞侵袭的停止或显著减少的量。
所述组合物可以与药物载体和/或稀释剂一起给予。所述药剂还可以与其他药剂联合给予，例如，与其他化学疗法或免疫刺激药或治疗剂联合给予，例如在癌症治疗中。可用于本发明的药物载体或稀释剂的实例包括任何生理缓冲介质，即，包含合适的水溶性有机载体的约ph7.0至7.4的生理缓冲介质。合适的水溶性有机载体包括但不限于玉米油、二甲基亚砜、明胶胶囊等。
个体可以是任何动物，例如哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼类。示例性的哺乳动物类别包括啮齿动物、灵长类动物、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物、兔形动物等。例如，个体可以是人、猴、猿或其他灵长类动物、小鼠、大鼠或其他啮齿动物、狗、猫、猪、马、牛或兔等。
如本文所用，术语“治疗”是指对障碍或病症提供改善、治愈或预防作用。在一些实施方案中，治疗包括预防病症的升级或进展，或(与没有治疗或与其他治疗相比)减缓病症的升级或进展的速率。在癌症的情况下(下文更多描述)，治疗包括减缓或防止细胞生长或细胞分裂速率，减缓或防止细胞迁移和/或减缓或防止细胞侵袭。
示例性病症包括癌症、糖尿病、血栓形成、结肠炎、克罗恩氏病、炎性肠病、多发性硬化症、类风湿性关节炎免疫抑制障碍、关节炎、哮喘、中风、再狭窄、鼻炎和骨质疏松症。示例性癌症包括胰腺癌、肾癌、结肠癌、横纹肌肉瘤、肺癌和乳腺癌。
在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在一个实施方案中，所述癌症选自胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、横纹肌肉瘤和肺癌。
在一个实施方案中，nr4a1活性的调节诱导选自β1-整联蛋白、txndc5、存活蛋白、efgr、pax3-fox01a及其组合的蛋白的下调。在一个实施方案中，nr4a1活性的调节诱导选自serpinb5、gadd45α及其组合的蛋白的上调。
在一个实施方案中，所述疾病是糖尿病，并且nr4a1活性的调节诱导个体中的葡萄糖摄取。在一个实施方案中，nr4a1活性的调节诱导glut-4和rab4的上调以及ampk的磷酸化。
nr4a1与4-羟基取代的nr4a1配体的结合
以下是对根据本发明实施方案的与nr4a1结合的化合物的描述。
4-羟基化合物(c-dim8)与nr4a1以高亲和力结合，是一种有效的nr4a1拮抗剂，其抑制几种促癌nr4a1调节的基因/途径的表达。尽管4-羟基类似物在小鼠异种移植模型中是一种相对有效的肿瘤生长抑制剂，但其血清半衰期相对短。因此，合成了九种取代的4-羟基类似物，以研究它们作为nr4a1配体的相对效力及其半衰期，因为某些取代基支持羟基。确定了它们对panc1细胞中gal4-nr4a1和gal4-nr4a2的激活/失活的影响(见图9和13)。
仅在22.5μm而非15μm下观察到4-羟基参考化合物对gal4-nr4a1转录激活的显著抑制(陡峭的剂量响应曲线)。在7.5μm和15μm的浓度下测试了取代的4-羟基类似物，除3-氟-4-羟基类似物外，剩下的8种4-羟基取代的化合物比4-羟基参考化合物作为nr4a1依赖性转录激活的抑制剂更有效。参见图9。
就rh30横纹肌肉瘤细胞中的两种nr4a1调节的基因产物，即txndc5和pax3-fox01a的下调而言，比较了4-羟基参考化合物和9种类似物的作用。参见图10b。在20μm的高剂量下，4-羟基参考化合物使两种基因产物的表达降低了50-60％；相反地，所有9种类似物在5μm的浓度下使两种基因产物的表达都降低了80％至>95％。因此，所有类似物的效力均比4-羟基参考化合物的效力强>4倍，因此代表了很有希望的新的第二代nr4a1配体。结果还表明在确定nr4a1拮抗剂效力的差异方面，nr4a1依赖性转录激活分析看来比nr4a1调控的基因产物的预测性低。
此外，研究了相同化合物对panc1和skbr3细胞中nr4a1调节的基因产物的c-dim介导的抑制。参见图10a和14以及19。这些结果类似于在rh30细胞中观察到的那些。
核受体的配体既激活又抑制基因表达，并且由于nr4a1是促癌的，因此我们专注于作为nr4a1调节的基因的拮抗剂或抑制剂的nr4a1配体。
与4-溴参考化合物相比[即1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对溴苯基)甲烷]相比，4-羟基类似物对gal4-nr4a2的激活作用最小，表明这些化合物看来是nr4a1特异性的。参见例如图13。
4-羟基配体的构效关系
以下是对根据本发明的实施方案的化合物的构效关系的描述。
nr4a1可能是代谢疾病中的主要参与者，并且已经确定了代表在体内和体外分析中都有效的第二代nr4a1配体的dim-c-pphoh衍生物(c-dim8；nr4a1标准品)，如本文进一步讨论的。
图11a-11c总结了在rh30细胞中通过dim-c-pphoh和6种取代的类似物诱导白介素-24(il-24)、鸟嘌呤脱氨酶(gda)和含双皮质素结构域蛋白2(dcdc2)mrna的完整构效关系研究。诱导的ec50值清楚地显示结构依赖性效力，并且这也反映在它们的功效(即最大诱导效力)中。
通过表面等离子体共振测量的nr4a1和nr4a2与4-羟基配体的结合
以下是使用表面等离子共振(spr)对根据本发明的实施方案的化合物与nr4a1的结合的描述。
结合实验是在25℃下在biacore3000系统(gehealthcare)上使用spr方法进行的。使用胺偶联过程将纯化的nr4a1和nr4a2lbd蛋白共价固定在cm5传感器芯片(ge)上。供选择地，更昂贵的his-标签结合nta传感器芯片(ge)可用于确保正确的蛋白表面取向。使用5或10μmdim-c-pphx类似物(其中x＝br(#2)、x＝oh(#8)、x＝cn(#10)和x＝co2me(#14))，在配体注射后产生spr响应曲线(传感图)(参见图22)。尽管两种蛋白都成功地固定在芯片上，但nr4a2似乎在测试缓冲液条件下聚集/低聚，因此缓冲液离子强度需要进一步优化。dim-c-pphoh(c-dim8)与nr4a1以高亲和力结合，dim-c-pphbr(c-dim2)与两种蛋白均表现出粘性相互作用，这对于kd测定是个问题。
用4-羟基配体处理的细胞的nr4a2依赖性骨桥蛋白基因表达
显示了根据本发明的实施方案的化合物对骨桥蛋白(opn)表达的诱导。
用含有4-f、4-cl和4-i取代基的dim-c-pphx(卤素取代的)类似物以2.5μm的增量在2.5到20μm的浓度下处理panc1细胞，并使用qpcr分析确定nr4a2依赖性opn基因表达。化合物处理影响了最初旨在用作内部对照的gapdh的表达。但是，确定了mrna水平，并且每个qpcr反应使用了相同量的mrna。opn的诱导倍数可用于确定剂量响应曲线和ec50值(图21)。在某些实施方案中，其他管家基因，例如β肌动蛋白和18s核糖体rna目前被用作内部对照。
nr4a1与3-羟基和2-羟基配体的结合
以下是对根据本发明的实施方案的3-羟基和2-羟基化合物对nr4a1的结合的描述。
4-羟基化合物(c-dim8)与nr4a1以高亲和力结合，并且是一种有效的nr4a1拮抗剂，其抑制几种促癌nr4a1调节的基因/途径的表达。上文显示4-羟基化合物的类似物代表了新一代更有效的nr4a1配体。
本文所述的结果表明在某些实施方案中，3-羟基(3-oh)和2-羟基(2-oh)化合物作为nr4a1拮抗剂/激动剂比4-oh标准品更有效。
转录激活结果表明在用gal4-nr4a1转染的panc1细胞中，4-、3-和2-羟基化合物均会降低转录激活，其具有在15至22.5μm之间的陡峭的剂量响应曲线。参见图8、7和6。与4-溴标准nr4a2配体相比，3-和2-羟基异构体具有最小的nr4a2活性。参见图13和15。
图3显示在panc1和skbr3细胞中的β1-整联蛋白和txndc5的下调中，2-羟基和3-羟基化合物均比4-羟基化合物更有效。注意到在较高浓度的3-羟基(skbr3细胞)和2-羟基(skbr3和panc1细胞)化合物下，β1-肌动蛋白负载对照也减少了。结果与转录激活数据相关。
蛋白质印迹分析表明这些3-和2-羟基cdim化合物诱导serpinb5的效力(即2-oh/3-oh>4-oh)与观察到的下调β1-整联蛋白和txndc5的效力相似。参见例如图3和5。
在rh30横纹肌肉瘤细胞中的txndc5和β1-整联蛋白下调中，2-、3-和4-羟基化合物的效力与在panc1和skbr3细胞中观察到的相似。参见图4。
取代的2-羟基和3-羟基配体的nr4a1结合和转录激活
针对2-和3-羟基c-dim类似物获得的结果表明在某些实施方案中，它们是比母体4-羟基参考标准更强效的nr4a1拮抗剂。因此，合成了2-和3-羟基dim的几种取代的类似物，并研究了它们在转录激活分析中的活性。此外，对于2-羟基类似物，我们还研究了它们对基因诱导(serpinb5和gadd45α)(参见图17)和抑制(β1-整联蛋白和txndc5)的功能性作用(参见图16)。
对十种2-羟基类似物的转录激活分析及其对nr4a1的作用表明在与用于观察母体2-羟基化合物的浓度相似的浓度下，4-甲氧基、5-甲基和5-甲氧基衍生物降低了转录激活。参见图6。
在该相同组的取代的2-羟基类似物化合物中，某些化合物(例如2-溴、5-三氟甲基和3,5-二溴)激活了nr4a2，并且最大诱导响应比针对4-溴dim参考标准观察到的诱导响应>33％。参见图15。
研究了2-羟基dim类似物对panc1和skbr3细胞中的nr4a1依赖性降低(β1-整联蛋白和txndc5–参见图16)和增加(serpinb5和gadd45α–参见图17)的基因产物表达的影响，并将结果与针对2-羟基dim化合物(未取代的)观察到的结果比较。结果表明所分析的取代的2-羟基dim化合物的活性没有明显高于母体化合物，这与以前采用4-羟基dim和取代的类似物的研究相反。
在panc1细胞中还研究了五种取代的3-羟基dim类似物化合物对nr4a1依赖性转录激活的影响。2-氯和2-溴类似物均比未取代的3-和4-羟基dim标准品更有效(注意：5-羟基类似物等同于3-羟基取代)。参见图7。
4-羟基配体激活肿瘤抑制因子serpinb5
核受体的配体既激活又抑制基因表达，并且这些作用是细胞环境特异性的。我们最初的研究集中于作为nr4a1拮抗剂的c-dim，其下调促癌基因，例如β1-整联蛋白和txndc5；然而，c-dim也诱导癌细胞中肿瘤抑制基因的表达。
在panc1细胞中，20μm的4-羟基阳性对照化合物(c-dim8)和4μm的取代的类似物诱导了serpinb5(mapsin)，参见图10a，其是一种抑制细胞侵袭和转移的肿瘤抑制基因。但是，对于panc1细胞中的这种响应，只有二取代的3,5-br2和3-cl-5-甲氧基和3-cl类似物比4-羟基c-dim阳性对照的效力高>4倍。
在skbr3乳腺癌细胞中，20μm的4-羟基阳性对照化合物最小程度地诱导了serpinb5，而在用5μm的取代的4-羟基类似物处理的细胞中观察到serpinb5的显著诱导。参见图14。在这项研究中，dmso(对照)值相对较高，导致4-羟基化合物的低诱导，而在其他实验中，由于较低的基础serpinb5水平而观察到诱导。skbr3和panc1细胞中的结果表明c-dim类似物诱导serpinb5的效力有所不同，这些结果证实4-羟基取代的c-dim类似物代表第二代强效nr4a1配体。
4-oh配体的体外和体内分析
以下是对在体内和体外分析中根据本发明的实施方案的更具活性的dim-4-oh类似物中的三种的描述。
图12a-12c总结了相对于对照(灰色迹线)，在原位模型中在携带三阴性mda-md-231细胞的无胸腺裸鼠中(黑色迹线)，dimc-pph-oh的三种类似物对体内肿瘤生长的抑制。dim-c-pph-oh的3-氯、3,5-二溴-和3-氯-5-甲氧基类似物以10mg/kg/天的剂量抑制肿瘤生长，并且明显的是肿瘤生长抑制的ed50值将在低mg/kg/天或高μg/kg/天的范围内。参见图12a-12c。显然，新的取代类似物代表第二代nr4a1配体，其效力比dim-c-pph-oh明显更强，后者仅在40-50mg/kg/天的剂量下部分抑制肿瘤生长。
分析了来自对照和处理的小鼠的肿瘤裂解物对先前在体外研究中表征的nr4a1依赖性响应的影响。通过蛋白质印迹分析来自单一肿瘤的裂解物，三种类似物(a)降低了mtor途径，包括磷酸化的mtor、p70s6k、ps6rp和p-ebp1(参见图18)，(b)降低了nr4a1/sp调节的因子，包括存活蛋白、egfr、txndc5和β1-整联蛋白(参见图19)，和(c)诱导了nr4a1调节的gad045a和serpinb5基因产物的表达，并且还诱导了parp裂解(凋亡的标志物)(见图19)。
在rh30细胞中研究了dim-c-pphoh(dim-4-oh)和用于体内研究的更有效的dim-c-pphoh类似物中的两种(3-氯-和3,5-二溴-)对三种nr4a1响应基因的结构依赖性诱导。通过rnaseq确定了三种nr4a1可诱导基因，即il-24、gda和dcdc2。初步研究显示12小时后，c-dimnr4a1配体最大程度地诱导mrna。结果(图11a-11c)显示作为基因表达诱导物的3种nr4a1配体的结构依赖性效力差异。基于ec50值，3-氯-或3,5-二溴类似物的效力最多是dim-c-pphoh的效力的10倍以上：但是，这些效力差异是化合物和基因依赖性的。
作为体外sar的确认，图23显示第二代c-dim/nr4a1配体中的三种以5mg/kg/天的剂量完全抑制乳腺肿瘤生长，该剂量明显低于以前的研究，其中30-40mg/kg/天的dim-c-pphoh(c-dim8)仅部分(40-50％)抑制肿瘤生长。
图24总结了使用3,5-二溴第二代c-dim/nr4a1配体的小鼠异种移植研究的结果，并且在剂量为10.0、7.5、5.0和2.5mg/kg/天时，存在对rms肿瘤生长的完全肿瘤生长抑制。在两项体内研究中均未观察到毒性，并且一项体内研究表明在0.25mg/kg/d的剂量下抑制rms肿瘤生长。因此，体外gal4-nr4a1筛选分析对体外和体内nr4a1依赖性抗癌活性有高度预测性，并且采用鼠肌肉细胞(c2c12)的初步结果表明癌症的sar与调节nr4a1介导的代谢活性的sar相当。
用取代的nr4a1配体处理的c2c12细胞的葡萄糖摄取
以下是对用根据本发明的实施方案的化合物处理的细胞的葡萄糖摄取的描述。
先前的研究表明nr4a1调节c2c12肌肉细胞中与葡萄糖代谢相关的基因，并且还增强glut-4的表达。此外，在肌肉细胞中具有glut-4敲低的小鼠是胰岛素抗性的，表明增加肌肉中glut-4表达的药物是潜在的抗糖尿病药。也有证据表明nr4a1在增强肌肉中的葡萄糖代谢中起作用，这与nr4a1配体的潜在抗糖尿病活性一致，之前已报道过环孢霉素(cytosporone)衍生的nr4a1配体在小鼠模型中的该活性。对dim-c-pphoh和第二代取代类似物的初步研究使用c2c12肌肉细胞作为研究这些化合物的抗糖尿病活性的模型。图25a-25d示出了nr4a1在c2c12细胞中表达，并且用c-dim8(dim-c-pphoh)或第二代取代的c-dim8类似物3,5-二溴-(c-dim8-3,5-br2)、3-氯-(c-dim8-3-cl)和3-氯-5-甲氧基-(c-dim8-3-cl-5-och3)处理增加了nr4a1在c2c12细胞中的表达。此外，我们还观察到rab4的表达增强和ampk的激活(磷酸化)，并且在c2c12细胞中观察到抗糖尿病药物二甲双胍的相似结果。图26a-26d所示的结果表明dim-c-pphoh(c-dim8)和二甲双胍均诱导c2c12细胞中的nr4a1和glut-4基因表达，并且在用20μmdim-c-pphoh处理后观察到最大诱导。第二代取代的化合物在2.5至5.0μm的浓度下诱导了相似的响应。
研究了dim-c-pphoh和三种取代的类似物对c2c12细胞中的葡萄糖摄取的影响(图27)，并且观察到dim-c-pphoh(15和20μm)和取代的类似物(2.5-5.0μm)显著诱导了葡萄糖摄取。观察到的c-dim8-3,5-br2和c-dim8-3-cl-5-och3的响应与观察到的500μm二甲双胍的响应相似。
nr4a1在c2c12细胞中的过表达诱导几种参与糖酵解的基因，包括磷酸果糖激酶(pfkm)、磷酸甘油酸变位酶2(pgam2)、双磷酸甘油酸变位酶(bpgm)和糖原磷酸化酶m(pygm)。用nr4a1配体和二甲双胍处理c2c12细胞显著诱导了所有基因的表达，并且在c2c12细胞中过表达nr4a1后观察到相似的诱导响应(图28e)。这些结果(图25-28)证明dim-c-pphoh和取代的类似物在c2c12肌肉细胞中诱导葡萄糖摄取和糖酵解，并代表通过nr4a1起作用的新的一类抗糖尿病药物。
图20总结了在葡萄糖饥饿的hepg2细胞中显示增强的糖异生的结果。dim-c-pphoh(c-dim8)和3,5-二溴类似物抑制g6p酶和pepckmrna水平，结果表明该机制涉及mtor的nr4a1/ampk依赖性抑制；但是，lkb/nr4a1相互作用的作用可能不同于以前公开的。
这些数据表明c-dim类似物是nr4a1的选择性受体调节剂，因为它们在糖尿病模型中以激动方式起作用，而在肿瘤模型中以拮抗方式起作用。
采用取代的nr4a1配体对以高脂饮食维持的小鼠的处理
以下是对用根据本发明的实施方案的化合物处理的以高脂饮食维持的小鼠的描述。
将c57bl/6小鼠以高脂饮食维持数周，然后每隔一天通过口服管饲用c-dim8-3-cl-5-och3(在玉米油中10mg/kg/d)处理。在治疗期间以几个间隔检查血糖，观察到血糖水平显著降低(图29a和29b)。此外，与在葡萄糖耐量测试中的对照动物相比，用c-dim8-3-cl-5-och3(10mg/kg/d)处理的小鼠也表现出降低的血清葡萄糖水平，并且在目前的研究(25mg/kg/d)中，我们观察到降低的血清葡萄糖和升高的血清胰岛素水平。抗糖尿病药物通常也观察到这些结果，并证实了c-dim8类似物表现出抗糖尿病活性，并且该体内数据补充了体外研究的结果，证实了c-dim8和相关的取代类似物代表了新的一类nr4a1依赖性抗糖尿病药物。
应当理解除非明确说明，否则为本发明的任何方面提供的任何实施方案、特征、要素、定义或一般描述可以不受限制地应用于本发明的任何其它方面。因此，就本发明的任何方法、药剂或组合物而言，本文讨论的任何实施方案都可以实施，反之亦然。此外，本发明的药剂和组合物可用于实现本发明的方法。
当在本文中与术语“包含”一起使用时，使用词语“一(a)”或“一(an)”可以意指“一(one)”，但其也与“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的含义一致。
术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确地表示仅指代供选择的方案或供选择的方案是相互排斥的，但是本发明支持仅指代供选择的方案以及“和/或”的定义。
在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括装置的误差、用于确定该值的方法的固有变化，或研究对象之间存在的变化。
术语“包含(comprise)”、“具有(have)”和“包括(include)”是开放式连接动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有那些一个或多个步骤，并且还涵盖其他未列出的步骤。作为“包含”的替代方案或除“包含”之外，本文中的任何实施方案都可以描述为“由……组成”。过渡性短语“由……组成”排除在权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。使用单数或复数的词语还分别包括复数和单数。此外，词语“本文”、上文和“下文”以及类似含义的词语，当用于本申请时，应指作为整体的本申请，而不是指本申请的任何特定部分。
本文所引用的出版物和它们被引用所针对的主题在此特别地通过引用整体并入。
尽管已经说明和描述了本发明的优选实施方案，但是应当理解在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行各种改变。
1.一种下式的化合物：
或其盐，
其中，
r1、r2、r1′和r2′各自独立地选自氢、包含1至约10个碳原子的直链烷基和包含1至约10个碳原子的支链烷基；
r3、r4、r5、r6、r3′、r4′、r5′和r6′各自独立地选自氢、卤素、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的烷氧基和硝基；
r7选自氢、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的环烷基和芳基；
r8、r9、r10、r11和r12独立地选自h、卤素、包含1至约10个碳原子的直链烷基、包含1至约10个碳原子的支链烷基、包含1至约10个碳原子的烷氧基、包含1至约10个碳原子的卤代烷基、硝基、羟基和包含1至约10个碳原子的卤代烷氧基；
其中r8、r9、r10、r11和r12中的至少一个是oh，和
其中当r10为oh时，r8、r9、r11和r12中的至少一个不是氢。
2.权利要求1所述的化合物，其中r8是oh。
3.权利要求2所述的化合物，其中r9、r10、r11和r12各自为h。
4.权利要求2所述的组合物，其中r9、r10、r11和r12独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。
5.权利要求2所述的化合物，其中r10为och3。
6.权利要求2所述的化合物，其中r11选自ch3、och3和cf3。
7.权利要求2所述的化合物，其中r9和r11为br。
8.权利要求2所述的化合物，其选自：
9.权利要求1所述的化合物，其中r9是oh。
10.权利要求9所述的化合物，其中r8、r10、r11和r12各自为h。
11.权利要求9所述的化合物，其中r8、r10、r11和r12独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。
12.权利要求9所述的化合物，其中r8为卤素。
13.权利要求9所述的化合物，其选自：
14.权利要求1所述的化合物，其中r10为oh。
15.权利要求14所述的化合物，其中r8、r9、r11和r12独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。
16.权利要求14所述的化合物，其中r9为卤素，并且r11选自h、卤素和och3。
17.权利要求14所述的化合物，其选自：
18.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的化合物或其盐，和药学上可接受的载体。
19.一种治疗可通过调节核受体亚家族4的a组成员1(nr4a1)活性治疗的个体的疾病或病症的方法，其包括向所述个体给予治疗有效量的根据权利要求1-17任一项所述的化合物或其盐，或权利要求18所述的药物组合物。
20.权利要求19所述的方法，其中所述疾病或病症选自癌症、血栓形成、结肠炎、克罗恩氏病、炎性肠病、多发性硬化症、类风湿性关节炎免疫抑制障碍、关节炎、哮喘、中风、再狭窄、鼻炎、糖尿病和骨质疏松症。
21.权利要求20所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、横纹肌肉瘤和肺癌。
22.权利要求19所述的方法，其中nr4a1活性的调节诱导选自β1-整联蛋白、txndc5、存活蛋白、efgr、pax3-fox01a及其组合的蛋白的下调。
23.权利要求19所述的方法，其中nr4a1活性的调节诱导选自serpinb5、gadd45α及其组合的蛋白的上调。
24.权利要求20所述的方法，其中所述疾病是糖尿病，并且nr4a1活性的调节诱导所述个体中的葡萄糖摄取。
25.权利要求24所述的方法，其中nr4a1活性的调节诱导glut-4和rab4的上调以及ampk的磷酸化。
26.权利要求19所述的方法，其中所述给予包括局部给予、口服给予、静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射、鼻内给予、透皮给予、直肠给予或其组合。
27.一种调节细胞中的nr4a1活性的方法，其包括向所述细胞给予根据权利要求1-17中任一项所述的化合物或其盐，或权利要求18所述的药物组合物。
28.权利要求27所述的方法，其中调节细胞中的nr4a1活性包括降低细胞中功能性nr4a1的水平。
29.权利要求27所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
30.权利要求27所述的方法，其中所述细胞在体外与所述化合物或药物组合物接触。
31.权利要求27所述的方法，其中通过向受试者给予有效量的所述化合物或药物组合物，使所述细胞在体内与所述化合物或药物组合物接触。
32.权利要求27所述的方法，其中nr4a1活性的调节诱导选自β1-整联蛋白、txndc5、存活蛋白、efgr、pax3-fox01a及其组合的蛋白的下调。
33.权利要求27所述的方法，其中nr4a1活性的调节诱导选自serpinb5、gadd45α及其组合的蛋白的上调。
技术总结